綿羊CCNG1基因克隆及表達(dá)分析

高磊，沈敏，甘尚權(quán)，楊井泉，張譯元

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綿羊基因克隆及表達(dá)分析

高磊1,2，沈敏1,2，甘尚權(quán)1,2，楊井泉1,2，張譯元1,2

1. 新疆農(nóng)墾科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，石河子 832000；2. 新疆兵團(tuán)綿羊繁育生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石河子 832000

細(xì)胞周期蛋白cyclin G1(CCNG1)是一個(gè)重要的細(xì)胞周期調(diào)控因子，參與哺乳動(dòng)物顆粒細(xì)胞增殖、卵母細(xì)胞成熟等繁殖生物學(xué)過(guò)程，但其在綿羊中鮮有報(bào)道。為了研究基因?qū)d羊發(fā)情調(diào)控以及季節(jié)性繁殖的影響，文章對(duì)綿羊基因進(jìn)行了克隆和組織表達(dá)譜分析，利用Real-time PCR對(duì)該基因在多浪羊(常年發(fā)情)與中國(guó)美利奴羊(季節(jié)性繁殖)發(fā)情周期不同階段性腺軸組織的表達(dá)變化進(jìn)行了實(shí)時(shí)檢測(cè)。獲得了綿羊基因部分cDNA序列，其中編碼區(qū)全長(zhǎng)885 bp，編碼294個(gè)氨基酸。CCNG1蛋白結(jié)構(gòu)經(jīng)預(yù)測(cè)存在多個(gè)磷酸化位點(diǎn)和蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)?；蛟谒鶛z測(cè)綿羊各組織中均有表達(dá)，但在卵巢與腎臟中為高豐度表達(dá)；在不同綿羊品種發(fā)情周期不同階段性腺軸組織的表達(dá)變化規(guī)律基本一致，卵巢、子宮、松果體、垂體均是在發(fā)情期達(dá)到峰值。但是在發(fā)情期和發(fā)情后期卵巢的表達(dá)量存在顯著的品種間差異(<0.01)。研究結(jié)果表明，可能通過(guò)參與卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育繼而達(dá)到對(duì)綿羊發(fā)情和季節(jié)性繁殖的調(diào)控。

綿羊；基因；克??；表達(dá)；發(fā)情周期

細(xì)胞周期蛋白又稱細(xì)胞周期素(Cyclins)，是在細(xì)胞周期進(jìn)程中發(fā)揮重要作用的一類特殊蛋白質(zhì)。這類蛋白均擁有一個(gè)高度保守的結(jié)構(gòu)域——細(xì)胞周期盒，通過(guò)這個(gè)特殊結(jié)構(gòu)域，細(xì)胞周期蛋白與細(xì)胞周期素依賴性激酶(CDK)、細(xì)胞周期素依賴性激酶抑制劑(CKI)結(jié)合參與對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)程進(jìn)行一系列精細(xì)而高度有序的調(diào)控[1]。目前，已發(fā)現(xiàn)有16個(gè)細(xì)胞周期蛋白家族成員，其中多個(gè)已被證實(shí)與哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞成熟、顆粒細(xì)胞增殖、細(xì)胞生長(zhǎng)、G1/S期的轉(zhuǎn)換、細(xì)胞凋亡等生理過(guò)程密切相關(guān)[2~5]。細(xì)胞周期蛋白可能是卵巢及卵泡發(fā)育過(guò)程中重要的調(diào)控因子。

細(xì)胞周期素G1(Cyclin G1, CCNG1)是較晚發(fā)現(xiàn)的一個(gè)細(xì)胞周期蛋白。研究發(fā)現(xiàn)，基因在人和小鼠卵巢中呈高豐度表達(dá)；同時(shí)其表達(dá)與雌激素水平密切相關(guān)，推斷可能在卵泡發(fā)育、顆粒細(xì)胞增殖、分化等過(guò)程扮演了重要的角色[6]。Liu等[7]研究顯示，在小鼠各個(gè)時(shí)期卵泡的卵母細(xì)胞中均有表達(dá)，且隨著卵泡發(fā)育成熟，其表達(dá)呈上升趨勢(shì)；給予絨毛膜促性腺激素(Human chorionic gonadotropin, hCG)后，排卵前顆粒細(xì)胞中的表達(dá)水平顯著降低；當(dāng)顆粒細(xì)胞完全分化為黃體細(xì)胞后，mRNA水平進(jìn)一步減弱。提示可能作為正調(diào)節(jié)因子參與卵母細(xì)胞減數(shù)分裂過(guò)程的調(diào)控和卵泡的發(fā)育。張惠等[8]研究發(fā)現(xiàn)，表達(dá)水平與hCG激素水平呈負(fù)相關(guān)，并以正調(diào)節(jié)因子參與顆粒細(xì)胞的增殖分化。另外，可能作為負(fù)調(diào)控因子參與子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的分化以及蛻膜化過(guò)程中基質(zhì)細(xì)胞的增殖分化[9]。上述研究結(jié)果表明，在哺乳動(dòng)物卵泡發(fā)育中可能扮演了重要的角色。但對(duì)于該基因確切的調(diào)控機(jī)制仍不明晰，其在綿羊卵泡發(fā)育以及發(fā)情調(diào)控中的作用尚未見相關(guān)報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)室前期通過(guò)構(gòu)建多浪羊(常年發(fā)情)與中國(guó)美利奴羊發(fā)情期(季節(jié)性繁殖)卵巢組織抑制性消減雜交文庫(kù)獲得了與牛匹配的EST。結(jié)合前人的研究，推測(cè)可能是影響綿羊卵泡發(fā)育及發(fā)情周期調(diào)節(jié)的重要候選基因?；诖?，本研究對(duì)綿羊CDS區(qū)序列進(jìn)行了克隆并進(jìn)行了組織表達(dá)譜分析，同時(shí)檢測(cè)了發(fā)情周期不同階段多浪羊和中國(guó)美利奴羊性腺軸組織(甲狀腺、卵巢、子宮、松果體、下丘腦、垂體)mRNA的表達(dá)變化規(guī)律，為進(jìn)一步了解綿羊完整的發(fā)情機(jī)制積累基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取3~4歲的多浪羊(常年發(fā)情)和中國(guó)美利奴羊(季節(jié)性繁殖)成年母羊各12只，進(jìn)行統(tǒng)一飼養(yǎng)管理，通過(guò)早晚2次公羊試情，結(jié)合母羊陰道細(xì)胞類型分析[10]，確定其發(fā)情周期。待其發(fā)情周期穩(wěn)定之后，分別選取處于發(fā)情期(0~1.5 d)、發(fā)情后期(3~4 d)、發(fā)情間期(7~10 d)和發(fā)情前期(12~15 d)4個(gè)不同階段的多浪羊與中國(guó)美利奴羊各3只，進(jìn)行宰殺，迅速采集心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、卵巢、子宮、淋巴結(jié)、小腸、下丘腦、甲狀腺、松果體、垂體等組織樣品，置液氮保存，以供備用。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取及cDNA合成

參照TRIzol Reagent (Invitrogen)說(shuō)明書，分別提取多浪羊和中國(guó)美利奴羊各組織總RNA，0.7%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性，并利用核酸蛋白分析儀測(cè)定RNA的濃度和純度。cDNA第一鏈采用Prime-ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time) (TaKaRa)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行合成。

1.2.2 綿羊cDNA的克隆

根據(jù)牛mRNA序列(GenBank登錄號(hào)：BC150004)設(shè)計(jì)特異引物，由北京六合華大基因科技股份有限公司合成，引物序列及特征見表1。PCR擴(kuò)增體系為25 μL，其中綿羊卵巢cDNA模板1 μL、10×Buffer 2.5 μL、dNTPs 2 μL、上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL、DNA聚合酶0.5 μL、ddH2O 18 μL。PCR擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s、 55℃復(fù)性30 s、72℃延伸45 s，共35個(gè)循環(huán)；最后再72℃延伸10 min。利用凝膠回收試劑盒(Promega)回收目的片段，并將其克隆到pMD19-T載體，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性重組子，質(zhì)粒提取后由北京六合華大科技股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3 生物信息學(xué)分析

利用DNAMAN 5.0軟件進(jìn)行序列拼接；使用Mega 5.0等軟件構(gòu)建CCNG1系統(tǒng)進(jìn)化樹，分析不同物種之間的序列差異；利用SMART軟件預(yù)測(cè)CCNG1保守結(jié)構(gòu)域；利用TMHMM Server 2.0、NetPhos 2.0 Serve、NetPhosK 1.0 Server軟件預(yù)測(cè)CCNG1蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域、磷酸化位點(diǎn)；利用signal 4.0、NetOGlyc4.0及NetNGlyc1.0軟件預(yù)測(cè)信號(hào)肽、O糖基化位點(diǎn)及N糖基化位點(diǎn)。

1.2.4基因組織表達(dá)譜分析

根據(jù)克隆獲得的綿羊基因的測(cè)序結(jié)果重新設(shè)計(jì)引物(表1)，以發(fā)情期多浪羊的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、甲狀腺、卵巢、子宮、淋巴結(jié)、小腸和下丘腦cDNA為模板進(jìn)行半定量RT-PCR檢測(cè)。以綿羊基因?yàn)閰⒄?，調(diào)整各組織cDNA初始模板濃度和最佳擴(kuò)增循環(huán)數(shù)。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，分別讀取灰度值，并將持家基因與目的基因?qū)?yīng)組織PCR產(chǎn)物的灰度值進(jìn)行比較，分析基因在不同組織的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)

分別以多浪羊和中國(guó)美利奴羊發(fā)情周期不同階段的卵巢、子宮、松果體、下丘腦、垂體和甲狀腺組織cDNA為模板，以綿羊?yàn)閮?nèi)參，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，引物見表1。反應(yīng)體系20 μL，其中：cDNA模板1 μL，SYBR? Premix Ex Taq (2×) (Tli RNaseH Plus) (TaKaRa)10 μL，上下游引物(10 mmol/L)各0.8 μL，ddH2O 7.4 μL。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，并設(shè)置相應(yīng)的陰性對(duì)照(擴(kuò)增模板為雙蒸水)。PCR擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s、58℃復(fù)性20 s、72℃延伸20 s，共45個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增結(jié)束后，以0.1℃/s的速度進(jìn)行溶解曲線分析。分別讀取目的基因和持家基因的值，利用法(Qr=2－ΔΔCt)計(jì)算基因在不同品種綿羊發(fā)情周期不同階段性腺軸組織mRNA的相對(duì)表達(dá)量。并利用SPSS(18.0)軟件對(duì)定量數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同組織總RNA的提取

各組織樣品總RNA經(jīng)0.7 %變性瓊脂糖凝膠電泳后，均可清晰見到18 S、28 S及5 S條帶(圖略)，無(wú)蛋白和基因組污染。經(jīng)核酸蛋白分析儀檢測(cè)，所有樣品的260/280均介于1.8~2.0之間。說(shuō)明提取的總RNA具有較好的完整性，符合反轉(zhuǎn)錄要求。

2.2 綿羊CCNG1基因的克隆、測(cè)序及生物信息學(xué)分析

以多浪羊卵巢組織cDNA為模板，經(jīng)克隆測(cè)序，獲得一條長(zhǎng)為2009 bp的目的片段(圖略)。所獲得的序列經(jīng)與GenBank公布的牛基因序列比對(duì)，同源性高達(dá)96%，確定為綿羊基因(GenBank登錄號(hào)：KC539855)。

表1 PCR引物信息

將獲得的綿羊基因序列提交到UCSC (http://genome.ucsc.edu/)綿羊基因組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析，結(jié)果表明，該基因位于綿羊5號(hào)染色體。所獲序列包括32 bp的5′ UTR區(qū)、1092 bp的3′ UTR區(qū)以及885 bp的完整CDS區(qū)。其CDS區(qū)編碼294個(gè)氨基酸，編碼蛋白的分子量約為34 kDa，理論等電點(diǎn)(pI)為9.15(圖1)。經(jīng)DNAStar軟件比對(duì)發(fā)現(xiàn)，綿羊CCNG1的氨基酸序列與山羊(預(yù)測(cè))、牛、人、大鼠、小鼠等物種的同源性較高，分別為99.32 %、98.64%、93.90 %、90.51 %、90.17 %。結(jié)合系統(tǒng)進(jìn)化樹分析可以看出，綿羊與山羊、牛同處于一個(gè)分支上，親緣關(guān)系最近(圖2)。

蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，綿羊CCNG1的細(xì)胞周期盒(Cyclin box)位于ORF 5′端135nt處，含有115個(gè)氨基酸。該周期盒序列與人、大鼠、小鼠、牛、豬等的同源性分別為98.26 %、97.39 %、97.39 %、99.13 %和98.26 %。在綿羊cyclin G1 N端沒(méi)有發(fā)現(xiàn)“RXXL”基序和“SPXXXE/D”基序，這一結(jié)果與大鼠的研究結(jié)果一致。

Phyre軟件預(yù)測(cè)結(jié)果表明，綿羊CCNG1蛋白存在12個(gè)a螺旋區(qū)域和1個(gè)β折疊區(qū)(圖3)。磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)顯示，綿羊CCNG1蛋白存在15個(gè)絲氨酸磷酸化位點(diǎn)、4個(gè)蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)、1個(gè)酪氨酸磷酸化位點(diǎn)以及一個(gè)特異性蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)。糖基化位點(diǎn)及信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果表明，CCNG1蛋白含有8個(gè)O糖基化位點(diǎn)，無(wú)N糖基化位點(diǎn)和信號(hào)肽。

“下劃線”代表的是細(xì)胞周期蛋白盒。

圖2 不同物種CCNG1蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹

圖3 綿羊CCNG1的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

2.3 綿羊CCNG1基因的組織表達(dá)譜

半定量RT-PCR結(jié)果顯示，基因在多浪羊的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、甲狀腺、卵巢、子宮、淋巴結(jié)、小腸、下丘腦組織中均有表達(dá)，其中在卵巢和腎臟中表達(dá)豐度最高，其次是子宮、淋巴結(jié)、肝臟，在心臟、脾臟、肺臟、甲狀腺、小腸及下丘腦中表達(dá)水平較低(圖4)。

2.4 CCNG1在不同品種綿羊發(fā)情周期性腺軸組織的表達(dá)規(guī)律

從整個(gè)發(fā)情周期來(lái)看，不同綿羊品種性腺軸組織(卵巢、子宮、松果體、下丘腦和垂體)的mRNA表達(dá)規(guī)律基本一致：在發(fā)情前期表達(dá)水平較低，進(jìn)入發(fā)情期后表達(dá)水平升高，到了發(fā)情后期表達(dá)水平仍然較高但相對(duì)于發(fā)情期有所降低，進(jìn)入發(fā)情間期后表達(dá)水平下降到這個(gè)發(fā)情周期的最低點(diǎn)(圖5)。但在表達(dá)豐度上，多浪羊和中國(guó)美利奴羊不同品種間存在較大差異：相對(duì)于甲狀腺組織，中國(guó)美利奴羊性腺軸組織卵巢、子宮、下丘腦、松果體、垂體的表達(dá)水平在整個(gè)發(fā)情周期均低于甲狀腺組織，表達(dá)豐度由高到低依次為：甲狀腺、子宮、卵巢、垂體、松果體、下丘腦(圖5B)；多浪羊在發(fā)情前期性腺軸軸其他組織表達(dá)水平也是均低于甲狀腺組織，但是進(jìn)入到發(fā)情期和發(fā)情后期卵巢組織表達(dá)水平顯著升高，表達(dá)水平分別達(dá)到甲狀腺組織的2.2倍和1.7倍(<0.01)，隨后表達(dá)水平急劇下降，到發(fā)情間期表達(dá)水平為整個(gè)發(fā)情周期的最低點(diǎn)(圖5A)。

圖4 CCNG1在多浪羊發(fā)情期不同組織的半定量RT-PCR結(jié)果

另外，本文對(duì)不同綿羊品種發(fā)情周期不同階段性腺軸組織表達(dá)水平也進(jìn)行了比較(圖6)。由圖可見，貫穿整個(gè)發(fā)情周期，多浪羊除了子宮表達(dá)水平低于中國(guó)美利奴羊以外，其卵巢、松果體、垂體和下丘腦的表達(dá)量在多數(shù)時(shí)期都是高于中國(guó)美利奴羊。其中多浪羊的卵巢和松果體組織表達(dá)水平在發(fā)情前期、發(fā)情期和發(fā)情后期顯著高于中國(guó)美利奴羊，而在發(fā)情間期品種間差異不大；多浪羊垂體組織在發(fā)情前期和發(fā)情期要顯著高于中國(guó)美利奴羊(<0.05)，但到了發(fā)情后期和發(fā)情間期，水平則低于中國(guó)美利奴羊，但品種間差異并不顯著。在兩個(gè)綿羊品種的整個(gè)發(fā)情周期中下丘腦的表達(dá)水平都非常低。

圖5 不同綿羊品種發(fā)情周期性腺軸組織CCNG1表達(dá)變化

A：多浪羊；B：中國(guó)美利奴羊。

圖6 不同綿羊品種發(fā)情周期不同階段不同性腺軸組織CCNG1表達(dá)量的比較

同一品種不同組織相同小寫字母表示差異不顯著(>0.05)，不同大寫字母之間表示差異極顯著(<0.01)，不同小寫字母之間表示差異顯著(<0.05)；*和**分別表示同一組織不同品種間差異顯著(<0.05)和差異極顯著(<0.01)。

3 討 論

3.1 綿羊CCNG1基因及其蛋白結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

細(xì)胞周期蛋白盒(cyclin box)是細(xì)胞周期蛋白的特征性結(jié)構(gòu)域，由一段長(zhǎng)約110個(gè)氨基酸殘基的高度保守的基序組成，主要負(fù)責(zé)結(jié)合CDKs[11]。目前所獲得的不同物種的細(xì)胞周期蛋白均含有這一標(biāo)志性結(jié)構(gòu)[12~14]。本研究獲得的綿羊CCNG1細(xì)胞周期蛋白盒序列與大鼠、牛等哺乳動(dòng)物的相似度非常高，說(shuō)明其具有高度保守性。

細(xì)胞周期蛋白的降解是細(xì)胞有絲分裂結(jié)束和進(jìn)入下一個(gè)細(xì)胞周期的關(guān)鍵步驟，其N端結(jié)構(gòu)對(duì)于細(xì)胞分裂中期的特異性降解是必需的[15]。其中位于細(xì)胞周期蛋白N端的降解框(Destruction box)主要參與由泛素介導(dǎo)的周期蛋白的降解，這是一段由9個(gè)氨基酸(RXXLGXIXN)組成的特殊序列，“RXXL”基序在cyclins以泛素化途徑降解過(guò)程中發(fā)揮重要作用。通過(guò)分析蛋白質(zhì)N端降解框的有無(wú)，可以初步判斷該蛋白是否為持續(xù)表達(dá)。Tamura等[12]研究發(fā)現(xiàn)，大鼠CCNG1 N段含有一個(gè)典型的周期蛋白盒，但無(wú)降解框和PEST序列。本研究結(jié)果顯示，綿羊CCNG1蛋白除含有細(xì)胞周期蛋白盒之外，也沒(méi)有降解框和PEST序列，與來(lái)自大鼠的結(jié)果一致。說(shuō)明綿羊CCNG1的穩(wěn)定性較好，能夠在細(xì)胞周期過(guò)程中持續(xù)表達(dá)。另外也進(jìn)一步表明哺乳動(dòng)物CCNG1不含有降解框和PEST序列的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。

Tamura等[12]等研究表明，CCNG1氨基酸C端存在一段與人表皮生長(zhǎng)因子受體(EGF-R)或禽類ErbB蛋白的酪氨酸磷酸化位點(diǎn)同源的自身磷酸化結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域通過(guò)與p53結(jié)合行使調(diào)控功能。大鼠[13]、小鼠[14]、人[16]CCNG1的p53結(jié)合位點(diǎn)不同，提示這些功能性結(jié)合位點(diǎn)的差異可能在蛋白磷酸化或去磷酸化過(guò)程中起非常重要的作用。本研究結(jié)果表明，綿羊CCNG1存在15個(gè)絲氨酸磷酸化位點(diǎn)、4個(gè)蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)、1個(gè)酪氨酸磷酸化位點(diǎn)。初步推測(cè)這些磷酸化位點(diǎn)可能在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑等方面扮演了重要的角色。

3.2 CCNG1在不同組織中的表達(dá)分析

是發(fā)現(xiàn)較晚的一種細(xì)胞周期素，目前對(duì)于它的確切功能還不是完全清楚。已知基因在人和小鼠的心臟、肝臟、骨骼肌、脾臟、肺臟、腎臟、肌肉、睪丸、胰腺、小腸、淋巴細(xì)胞、胃、大腦、卵巢等組織中均有表達(dá)，且在心臟、卵巢、腎臟和骨骼肌中表達(dá)豐度較高[5,17,18]，表明該基因及其編碼蛋白可能在這些組織器官的生長(zhǎng)發(fā)育以及生理功能中發(fā)揮作用。本研究結(jié)果顯示，在綿羊的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、甲狀腺、卵巢、子宮、淋巴結(jié)、小腸、下丘腦等組織中均有表達(dá)，且在卵巢、骨骼肌和腎臟中為高豐度表達(dá)，這與上述研究結(jié)果較相近，說(shuō)明基因具有廣譜表達(dá)的特性。

3.3 CCNG1與綿羊繁殖性能的關(guān)系

本實(shí)驗(yàn)選擇的多浪羊和中國(guó)美利奴羊均為新疆本地綿羊品種，二者在繁殖性能上存在明顯差異，中國(guó)美利奴羊?yàn)榈湫偷募竟?jié)性繁殖，而多浪羊?qū)儆诔Ｄ臧l(fā)情。本實(shí)驗(yàn)室前期通過(guò)構(gòu)建這兩個(gè)不同綿羊品種卵巢組織間抑制性消減文庫(kù)，篩選到了一些差異表達(dá)基因，其中就包括基因。本研究結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了之前文庫(kù)篩選結(jié)果的準(zhǔn)確性。為了進(jìn)一步了解對(duì)綿羊繁殖性能的影響，本文重點(diǎn)針對(duì)不同品種綿羊發(fā)情周期不同階段主要性腺軸組織(甲狀腺、卵巢、子宮、下丘腦、松果體、垂體)的表達(dá)情況進(jìn)行了實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。結(jié)果表明，在不同綿羊品種各組織中的表達(dá)譜基本一致，除下丘腦外，卵巢、子宮、松果體、垂體的表達(dá)量均是在發(fā)情期達(dá)到最高，其中尤以卵巢組織的表達(dá)變化最為顯著，其在發(fā)情期和發(fā)情后期表達(dá)水平極顯著高于發(fā)情間期和發(fā)情前期。發(fā)情期和發(fā)情后期是卵泡迅速發(fā)育、成熟排卵的時(shí)期，據(jù)毛文智等[19]報(bào)道，小尾寒羊發(fā)情期、發(fā)情后期(第一個(gè)卵泡波)的三級(jí)卵泡數(shù)量顯著高于發(fā)情間期(<0.05)；不同品種間，小尾寒羊的成熟卵泡數(shù)量顯著高于東北細(xì)毛羊(<0.05)。已有研究表明，CCND2、CCNE、CCNB、CCNG1等多個(gè)細(xì)胞周期蛋白家族成員均參與了卵泡發(fā)育過(guò)程的調(diào)節(jié)[1~4]。Liu等[7]曾對(duì)CCNG1在不同發(fā)育階段卵母細(xì)胞的表達(dá)變化進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)處于生發(fā)泡時(shí)期(GV)小鼠卵母細(xì)胞表達(dá)較弱，當(dāng)卵母細(xì)胞生發(fā)泡破裂(GVBD)后，mRNA以及蛋白水平較GV(減數(shù)分裂前期)期卵母細(xì)胞明顯增強(qiáng)。本研究中，在綿羊有腔卵泡(三級(jí)卵泡和成熟卵泡)階段表達(dá)水平顯著升高。由此推測(cè)，可能作為一種正調(diào)節(jié)因子參與調(diào)控卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育和卵母細(xì)胞成熟過(guò)程。

卵巢卵泡的發(fā)生是相當(dāng)精細(xì)、復(fù)雜的過(guò)程，受到多種基因的調(diào)控。促卵泡激素(FSH)、促黃體素(LH)以及雌激素等調(diào)控的卵泡顆粒細(xì)胞細(xì)胞周期的正常進(jìn)行(主要指的是顆粒細(xì)胞的增殖與分化)對(duì)于卵泡發(fā)育、排卵以及黃體生成有著至關(guān)重要的作用，也是影響哺乳動(dòng)物繁殖力高低的重要因素。激素通過(guò)調(diào)節(jié)一系列細(xì)胞周期進(jìn)程相關(guān)調(diào)控因子，改變顆粒細(xì)胞的增殖進(jìn)而達(dá)到對(duì)每一個(gè)卵泡發(fā)育的控制。結(jié)合本研究，兩個(gè)綿羊品種在發(fā)情間期卵巢的表達(dá)水平均降到最低，推測(cè)可能是造成雌激素水平下降，孕酮分泌增加，進(jìn)而導(dǎo)致卵泡顆粒細(xì)胞增殖減少，卵泡閉鎖，黃體形成的原因之一。

在本研究中，我們還注意到常年發(fā)情的多浪羊在發(fā)情前期、發(fā)情期和發(fā)情后期卵巢組織的表達(dá)水平均極顯著高于季節(jié)性繁殖的中國(guó)美利奴羊。但這種品種間的表達(dá)差異是否與二者繁殖特性上的差異，或者說(shuō)與非繁殖季節(jié)啟動(dòng)原始卵泡發(fā)育的機(jī)制差異存在直接關(guān)系還不得而知。由于本次采樣選擇在9~11月份繁殖季節(jié)，未進(jìn)行非繁殖季節(jié)的采樣和檢測(cè)分析，我們只能提出這種假設(shè)，希望在今后開展這部分的研究?jī)?nèi)容。

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(責(zé)任編委: 蔣思文)

Molecular cloning and tissue expression of thegene in sheep

Lei Gao1,2, Min Shen1,2, Shangquan Gan1,2, Jingquan Yang1,2, Yiyuan Zhang1,2

Thegene encodes cyclin G1, which is an important cell cycle regulator and has been reported to be involved in reproductive biological processes, such as oocyte maturation and granule cell proliferation in mammals. But the study ofin sheep has been rarely reported. To examine the effects ofon estrous control and seasonal breeding in sheep, we first cloned and characterized the expression level of the sheepgene. Then by Real-time PCR, we detected and analyzed the expressions ofgene at mRNA levels in the hypothalamus-pituitary-ovary (HPO) axis in different stages of an estrous cycle in Duo Lang sheep (non-seasonal breeding) and Merino sheep (seasonal breeding). The results showed that the open reading frame of the sheepgene is 885 bp in length and encodes 294 amino acids. Bioinformatic analysis indicated that the secondary structure of the sheep CCNG1 protein contained multiple phosphorylation sites and some Protein Kinase C phosphorylation sites.mRNA was identified in all tissues tested, with the levels in ovary and kidney higher than others. The expression profiles ofin the HPO axis in different stages of an estrous cycle were similar in different sheep breeds: the expression levels ofin the ovary, uterus, pineal gland and pituitary gland all peaked in the estrus phase. But there were significant differences for expression change extent ofin ovaries in the oestrus and metestrus phase between different sheep breeds. The results suggested thatprobably participated in the regulation of estrous behavior and seasonal reproduction through controling the growth and development of follicles in sheep.

sheep;; cloning; expression; estrous cycle

2014-12-09;

2015-02-13

“973”前期研究專項(xiàng)(編號(hào)：2009CB125907)，國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：30960249)，兵團(tuán)種質(zhì)資源創(chuàng)新與功能基因發(fā)掘及利用專項(xiàng)(編號(hào)：2012BB044)和新疆農(nóng)墾科學(xué)院青年科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：YQJ201315)資助

高磊，碩士，助理研究員，研究方向：動(dòng)物分子遺傳。E-mail: w.n007@163.com

沈敏，研究員，博士，研究方向：動(dòng)物分子遺傳。E-mail: shenmin0993@sina.com

10.16288/j.yczz.14-436

2015-3-11 9:20:51

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20150311.0920.005.html