芽胞桿菌高效分泌表達(dá)異源蛋白的研究進(jìn)展

王培立, 王 平, 田 健, 伍寧豐*, 姚 斌

1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所, 北京 100081;2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所, 北京 100081

芽胞桿菌屬于革蘭氏陽(yáng)性菌，為嚴(yán)格需氧或兼性厭氧的有莢膜桿菌。細(xì)胞呈現(xiàn)直桿狀，大小為(0.5～2.5) μm×(1.2～10) μm，常以鏈狀或成對(duì)排列，具圓端或方端。該屬細(xì)菌的重要特性是能夠產(chǎn)生對(duì)不利條件具有特殊抵抗力的芽胞。本屬包括對(duì)人和動(dòng)物具有致病性的炭疽芽胞桿菌(Bacillusanthracis)，能夠引起食物中毒的蠟狀芽胞桿菌(Bacilluscereus)，以及非致病性的枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)、多粘芽胞桿菌(Paenibacilluspolymyxa)、蕈狀芽胞桿菌(Bacillusmycoides)、短小芽胞桿菌(Bacilluspumilus)、解淀粉芽胞桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)和地衣芽胞桿菌(Bacilluslicheniformis)等近50種。1835年，Ehrenberg發(fā)現(xiàn)了枯草芽胞桿菌，命名為Vibriosubtilis。1872年，德國(guó)科學(xué)家科赫建立了第一個(gè)細(xì)菌分類系統(tǒng)，依據(jù)細(xì)菌形態(tài)特征命名了芽胞桿菌屬(Bacillus)，并且將枯草芽胞桿菌改名為Bacillussubtilis[1]。

在亞洲一些國(guó)家，枯草芽胞桿菌被用來(lái)制作發(fā)酵性食品豆豉，被公認(rèn)為是具有食品安全性的菌種，歸為一般認(rèn)為的安全微生物范疇[2,3]。由于枯草芽胞桿菌的安全特性，使其及多種芽胞桿菌，如地衣芽胞桿菌、巨大芽胞桿菌(Bacillusmegatherium)、解淀粉芽胞桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)、嗜熱脂肪芽胞桿菌(Bacillusstearothermophillus)和蠟樣芽胞桿菌(Bacilluscereus)等成為了重要的工業(yè)菌種，并在食品、醫(yī)藥、飼料、畜牧業(yè)和環(huán)境保護(hù)等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[1,4～6]。

1 芽胞桿菌作為基因工程菌株的優(yōu)勢(shì)

諾貝爾獎(jiǎng)得主德國(guó)科學(xué)家Cohen教授及他的學(xué)生曾對(duì)枯草芽胞桿菌表達(dá)系統(tǒng)做過(guò)系統(tǒng)的闡述[7,8]，可歸結(jié)如下：

①枯草芽胞桿菌是非致病的土壤微生物，在有氧條件下生長(zhǎng)繁殖迅速，易于培養(yǎng)。

②芽胞桿菌具有與高效分泌相關(guān)的信號(hào)肽和分子伴侶等，使其能高效分泌蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)被直接釋放到培養(yǎng)基中，通過(guò)簡(jiǎn)單處理便可從發(fā)酵上清液回收并純化目的蛋白，而且多數(shù)情況下芽胞桿菌分泌的異源蛋白質(zhì)具有天然構(gòu)象及生物活性。

③芽胞桿菌遺傳背景清晰，具有可以應(yīng)用的一些質(zhì)粒載體，易于進(jìn)行操作，并且具有良好的發(fā)酵基礎(chǔ)和生產(chǎn)技術(shù)。

基于以上優(yōu)點(diǎn)，目前枯草芽胞桿菌和解淀粉芽胞桿菌等在工業(yè)上已廣泛用于生產(chǎn)淀粉酶、普魯蘭酶、蛋白酶、脂肪酶及藥用蛋白等(表1)。

表1 枯草芽胞桿菌分泌表達(dá)的外源蛋白Table 1 Secretory expression of proteins from Bacillus subtilis.

2 芽胞桿菌分泌表達(dá)系統(tǒng)

2.1 芽胞桿菌分泌途徑

芽胞桿菌蛋白分泌的研究主要是以枯草芽胞桿菌為模式菌株。帶有信號(hào)肽的蛋白質(zhì)主要通過(guò)圖1所示的4種途徑分泌到胞外。在枯草芽胞桿菌中，超過(guò)90%以上的胞外蛋白是通過(guò)Sec-SRP(sec-signal peptide recognition particle)途徑分泌的[21]，它是蛋白質(zhì)分泌的主要途徑。另外還存在雙精氨酸途徑(twin-arginine translocation pathway，Tat轉(zhuǎn)運(yùn)途徑)、ATP結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)途徑(ATP-bing cassette transporters pathway，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)途徑)和假纖毛蛋白(pseudopilin)轉(zhuǎn)運(yùn)途徑(Com轉(zhuǎn)運(yùn)途徑)[22]。其中，ATP結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)途徑主要用于細(xì)菌素等一些分子的輸出[23]，假纖毛蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)途徑則參與枯草芽胞桿菌感受態(tài)的形成[24]，這兩種轉(zhuǎn)運(yùn)途徑只輸出特定且分子量相對(duì)較小的蛋白質(zhì)分子。

2.1.1Sec-SRP途徑 Sec-SRP途徑的主要組分有信號(hào)肽、信號(hào)肽酶、SecYEG通道及各種細(xì)胞因子等。該途徑的特點(diǎn)是：核糖體首先合成帶有信號(hào)肽的蛋白前體，在一些蛋白因子及動(dòng)力蛋白的作用下使其通過(guò)細(xì)胞膜上由一組膜蛋白組成的極性通道(該通道在真核生物、細(xì)菌、古菌中結(jié)構(gòu)都比較保守)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜外，穿膜后信號(hào)肽被信號(hào)肽酶切割，在分子伴侶和一些細(xì)胞因子的作用下形成正確的構(gòu)象，運(yùn)送出細(xì)胞外。Sec-SRP分泌途徑見(jiàn)圖2。蛋白通過(guò)哪種途徑分泌到胞外是由其所攜帶的信號(hào)肽類型所決定的。經(jīng)Sec-SRP途徑分泌的蛋白質(zhì)其N端含有Sec型信號(hào)肽，該類信號(hào)肽約含有28個(gè)氨基酸殘基，N端是帶正電荷的N-域，中間是疏水的H-域，而C-端是信號(hào)肽切割區(qū)，最典型C端氨基酸序列是 Ala-X-Ala (X表示任一氨基酸)，由第一類信號(hào)肽酶切割。

圖1 枯草芽胞桿菌的分泌途徑[21].Fig.1 Protein secretory pathways in Bacillus subtilis[21].

2.1.2Tat轉(zhuǎn)運(yùn)途徑 Tat轉(zhuǎn)運(yùn)途徑因分泌蛋白的信號(hào)肽中含有兩個(gè)相鄰的精氨酸殘基而得名。經(jīng)Tat轉(zhuǎn)運(yùn)途徑分泌的蛋白其N端信號(hào)肽約含有36個(gè)氨基酸殘基，其N-域有雙精氨酸(RR/KR)序列，中間是疏水的H-域，C-端也是信號(hào)肽切割區(qū)。Tat轉(zhuǎn)運(yùn)途徑可以轉(zhuǎn)運(yùn)緊密折疊的蛋白質(zhì)或是多亞基酶復(fù)合物，而這部分蛋白質(zhì)是不能通過(guò)Sec分泌途徑進(jìn)行分泌的。在枯草芽孢桿菌胞外蛋白中有27個(gè)蛋白前體N-端為T(mén)at信號(hào)肽，但僅有磷酸二酯酶PhoD被確認(rèn)是嚴(yán)格按Tat途徑進(jìn)行分泌的[21]。

圖2 枯草芽胞桿菌中的Sec-SRP分泌途徑 [21].Fig.2 Protein secretory pathways of Sec-SRP in Bacillus subtilis[21].

2.2 外源基因在芽胞桿菌中的分泌表達(dá)

在分泌表達(dá)外源蛋白方面，芽胞桿菌一直被認(rèn)為是很有潛力的宿主菌，如由各類芽胞桿菌生產(chǎn)的堿性蛋白酶、α-淀粉酶等幾種重要的酶制劑，在2004年的總產(chǎn)值就已經(jīng)占據(jù)世界酶制劑市場(chǎng)的50%[25]。迄今，僅枯草芽胞桿菌就表達(dá)了大約200種蛋白。1992年，Simonen等[26]總結(jié)了在B.subtilis中表達(dá)的蛋白質(zhì)，雖然大部分蛋白都表達(dá)成功，但遺憾的是有些蛋白分泌量低，特別是來(lái)源于真核細(xì)胞和革蘭氏陰性菌的外源蛋白質(zhì)，如MH-1 SCA抗體在芽胞桿菌中可成功表達(dá)但產(chǎn)量只有10～15 mg/L(表1)[11]。造成蛋白質(zhì)分泌量低的原因可能有：芽胞桿菌在對(duì)數(shù)末期會(huì)表達(dá)分泌大量的蛋白酶，對(duì)外源蛋白產(chǎn)生水解作用，造成目的蛋白的量降低甚至無(wú)法得到目的蛋白；芽胞桿菌中存在限制修飾系統(tǒng)會(huì)造成表達(dá)質(zhì)粒不穩(wěn)定；外源蛋白對(duì)細(xì)胞有毒性或影響細(xì)胞的生長(zhǎng)等。因此，建立高效的芽胞桿菌分泌表達(dá)系統(tǒng)是十分必要的一項(xiàng)研究工作。近年來(lái)從宿主改造、基因及發(fā)酵途徑等方面對(duì)提高外源基因在芽胞桿菌中的表達(dá)與分泌開(kāi)展了一系列研究。

3 芽胞桿菌蛋白分泌表達(dá)的限制因素及改造策略

3.1 載體與基因

3.1.1基因結(jié)構(gòu)及密碼子優(yōu)化 基因的二級(jí)結(jié)構(gòu)影響其分泌表達(dá)，因此可以通過(guò)密碼子優(yōu)化來(lái)平衡基因中的GC含量，去除一些反向重復(fù)序列，計(jì)算并優(yōu)化mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)等方法提升外源基因的分泌表達(dá)量。目前，與密碼子優(yōu)化相關(guān)的文獻(xiàn)有很多，相關(guān)的軟件也層出不窮，而優(yōu)化的標(biāo)準(zhǔn)也因菌株而異。整體而言，目前密碼子優(yōu)化已經(jīng)從傳統(tǒng)的只考慮密碼子使用頻率，到現(xiàn)在需要綜合考慮轉(zhuǎn)錄時(shí)mRNA的結(jié)構(gòu)、翻譯時(shí)翻譯暫停等。目前常用的軟件有DNAWorks(http：//mcl1.ncifcrf.gov/dnaworks/)、Jcat(http：//www.jcat.de/)，日本還還開(kāi)發(fā)了一個(gè)專門(mén)的密碼子數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//www.kazusa.or.jp/codon/)。

3.1.2使用串聯(lián)啟動(dòng)子及啟動(dòng)子、信號(hào)肽的優(yōu)化 在芽胞桿菌中啟動(dòng)子主要有單個(gè)啟動(dòng)子和復(fù)合啟動(dòng)子兩種方式。只具有單個(gè)啟動(dòng)子的基因，大多數(shù)在生長(zhǎng)比較快速的時(shí)候表達(dá)；復(fù)合啟動(dòng)子包括重疊啟動(dòng)子和串聯(lián)啟動(dòng)子，在表達(dá)外源基因時(shí)具有一定的優(yōu)勢(shì)。Yamagata等[28]通過(guò)使用B.brevis47的串聯(lián)啟動(dòng)子在B.brevis中成功高效表達(dá)了來(lái)源于地衣芽胞桿菌的α-淀粉酶基因bla，使α-淀粉酶的融合基因在B.brevis中的胞外表達(dá)量提升了50倍。

信號(hào)肽可以幫助蛋白質(zhì)前體折疊，幫助蛋白質(zhì)移位，對(duì)蛋白質(zhì)分泌有重要作用。在芽胞桿菌宿主的系統(tǒng)中，來(lái)源于革蘭氏陽(yáng)性菌株的基因通常能夠利用自身啟動(dòng)子以及信號(hào)肽進(jìn)行分泌表達(dá)，然而來(lái)源于革蘭氏陰性菌和真核細(xì)胞的胞外蛋白通常需要借助于芽胞桿菌胞外蛋白的啟動(dòng)子和信號(hào)肽才能夠進(jìn)行表達(dá)分泌。通常選用的啟動(dòng)子和信號(hào)肽有來(lái)源于芽胞桿菌的蛋白酶、淀粉酶等的啟動(dòng)子或信號(hào)肽。同一種蛋白在不同啟動(dòng)子、信號(hào)肽下的分泌效率也是不一樣的[29]，可以通過(guò)對(duì)啟動(dòng)子、信號(hào)肽等進(jìn)行優(yōu)化來(lái)提高外源蛋白的分泌量[46]。

3.1.3基因劑量的增加 表達(dá)載體的拷貝數(shù)或目的基因整合到基因組上的拷貝數(shù)，也就是通常所說(shuō)的基因劑量，可以影響外源基因的分泌表達(dá)，提高基因劑量可以增加蛋白的表達(dá)量。通過(guò)使用多拷貝質(zhì)粒載體或在基因組上整合多個(gè)拷貝的基因等手段可以提高外源蛋白表達(dá)分泌量。但是基因表達(dá)劑量并不是越高越好，只有合理提高基因劑量才可以增加外源蛋白的表達(dá)量，若外源蛋白的過(guò)量表達(dá)會(huì)使芽胞桿菌分泌系統(tǒng)過(guò)載，將會(huì)影響目的蛋白的分泌。Diderichsen等[30]在枯草芽胞桿菌中表達(dá)來(lái)源于嗜熱脂肪芽孢桿菌(B.stearothermophilus)的α-淀粉酶基因時(shí)發(fā)現(xiàn)，α-淀粉酶過(guò)量表達(dá)會(huì)使菌體不穩(wěn)定，并且過(guò)量的酶蛋白前體會(huì)飽和與分泌相關(guān)的蛋白運(yùn)輸元件，從而影響菌體的生理活性。通過(guò)脈沖示蹤實(shí)驗(yàn)分析蛋白質(zhì)分泌飽和程度表明，在一定范圍內(nèi)基因劑量和蛋白分泌成正相關(guān)。過(guò)高的基因劑量不僅不會(huì)使蛋白分泌增加，反而會(huì)造成大量的前體蛋白胞內(nèi)積累，必然會(huì)對(duì)菌體生長(zhǎng)產(chǎn)生影響。

3.2 與分泌過(guò)程相關(guān)的優(yōu)化

3.2.1分泌途徑中的改造 信號(hào)肽酶對(duì)信號(hào)肽的加工速度是影響蛋白質(zhì)分泌的又一個(gè)限制因素。芽胞桿菌具有向胞外分泌蛋白的能力，其分泌途徑主要為Sec-SRP途徑，其中secA、secD、secE、secF、secY、ffh和ftsY等編碼的蛋白參與枯草芽胞桿菌的蛋白分泌過(guò)程，在枯草芽胞桿菌中還發(fā)現(xiàn)了5種Ⅰ型信號(hào)肽酶的基因，分別為sipS、sipT、sipU、sipV和sipW。其中，SipW類似于真核生物的I型信號(hào)肽酶[27]。細(xì)胞中存在多個(gè)信號(hào)肽酶的作用主要是增加信號(hào)肽酶的總量，有助于提高細(xì)胞處理外泌蛋白質(zhì)的通量。許多研究也發(fā)現(xiàn)，通過(guò)篩選合適的信號(hào)肽及過(guò)表達(dá)相關(guān)的信號(hào)肽酶可以提升外源基因的分泌表達(dá)量[46]。過(guò)量表達(dá)信號(hào)肽加工酶可以顯著提高α-淀粉酶的分泌。Vitikainen等[31]過(guò)量表達(dá)信號(hào)肽加工酶SipT增加了枯草芽胞桿菌α-淀粉酶的分泌量。Pummi等[32]發(fā)現(xiàn)蛋白酶ClpXP的突變使信號(hào)肽加工酶SipS、SipT、SipV的表達(dá)水平提高2～5倍，從而提高了淀粉酶前體的加工速度，α-淀粉酶分泌量得以提高。

3.2.2分子伴侶與蛋白折疊相關(guān)因素的改造 分子伴侶具有調(diào)節(jié)胞內(nèi)多肽折疊、裝配，并介導(dǎo)蛋白質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)等多重功能。芽胞桿菌表達(dá)系統(tǒng)分泌表達(dá)外源蛋白時(shí)，由于缺乏有效的分子伴侶，外源蛋白無(wú)法被折疊形成正確的轉(zhuǎn)運(yùn)構(gòu)象而被滯留在細(xì)胞內(nèi)，從而影響到外源蛋白的分泌，因此分泌表達(dá)正確折疊的蛋白是非常重要的。通常外源蛋白被折疊成合適的轉(zhuǎn)運(yùn)構(gòu)象需要合適的分子伴侶及其靶基因共同完成。芽胞桿菌本身具有一些較高水平的分子伴侶，如GroES、GroEL、DnaJ和GrpE等。Wong等[33]發(fā)現(xiàn)，在枯草芽胞桿菌中過(guò)量表達(dá)分子伴侶GroES和GroEL可以提升抗地高辛藥物antidigoxin·SCA蛋白表達(dá)量。在芽胞桿菌Sec-SRP的分泌途徑中，外源蛋白的前體合成后需要在胞內(nèi)首先形成一定的構(gòu)象才能穿過(guò)細(xì)胞膜運(yùn)輸?shù)桨?，這就需要一些分子伴侶的輔助才能完成外源蛋白在細(xì)胞膜間的轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程。因此過(guò)表達(dá)分子伴侶如PrsA等也有可能會(huì)影響外源基因在芽胞桿菌中的分泌表達(dá)[36]。

通過(guò)Sec-SRP途徑進(jìn)行蛋白分泌時(shí)涉及到的主要分子伴侶總結(jié)如下：

①CsaA?？莶菅堪麠U菌中一種促進(jìn)蛋白正確折疊并分泌的分子伴侶，其編碼基因csaA是枯草芽胞桿菌體內(nèi)的必需基因。CsaA有助于蛋白的分泌，可以幫助變性的蛋白質(zhì)復(fù)性，防止變性蛋白質(zhì)發(fā)生聚合，并能夠作用于枯草芽胞桿菌轉(zhuǎn)位酶來(lái)幫助外泌蛋白的分泌[21，34，35]。基于CsaA的這些作用，超量表達(dá)CsaA應(yīng)該有助于提高芽胞桿菌表達(dá)系統(tǒng)中蛋白質(zhì)的分泌量。

②PrsA。芽胞桿菌蛋白分泌后期的一種重要的分子伴侶，位于細(xì)胞膜和肽聚糖壁之間，是由292個(gè)氨基酸殘基組成的一種脂蛋白，可以協(xié)助蛋白在細(xì)胞膜外進(jìn)行正確的折疊，并形成具有天然構(gòu)象的活性蛋白，起到胞外分子伴侶的作用，還有人認(rèn)為PrsA可能具有蛋白酶抑制劑的作用，可以保護(hù)分泌蛋白不被蛋白酶水解[31]，從而促進(jìn)蛋白質(zhì)的分泌[36]。Vitikainen等[31]通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明過(guò)量表達(dá)prsA基因可以使外源蛋白在枯草芽胞桿菌中的分泌量增加。Lindholm等[37]發(fā)現(xiàn)枯草芽胞桿菌的prsA基因突變將影響其α-淀粉酶的分泌，乳酸球菌(Lactococcuslactis)中提高prsA基因表達(dá)水平可使α-淀粉酶的分泌量升高。

③WprA和HtrA/B。芽胞桿菌的細(xì)胞壁會(huì)影響新生蛋白的折疊及其穩(wěn)定性，尤其是細(xì)胞壁上的一些金屬離子，如很多蛋白質(zhì)的折疊需要Ca2+，而蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到胞外如不能被及時(shí)折疊就可能被一些蛋白酶降解掉，WprA和HtrA/B可能就具有降解錯(cuò)誤折疊的外源蛋白的功能，這樣就可以避免一些錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)封閉細(xì)胞壁的孔道[29]。WprA與HtrA/B兩個(gè)組分組成了枯草芽胞桿菌的蛋白分泌的質(zhì)量控制體系。WprA是枯草芽胞桿菌的一個(gè)胞外蛋白酶，是結(jié)合在細(xì)胞壁上的蛋白，具有兩個(gè)功能結(jié)構(gòu)區(qū)：一個(gè)是具有絲氨酸蛋白酶活性的功能區(qū)；另一個(gè)是具有分子伴侶活性的功能區(qū)。相對(duì)于兩個(gè)功能區(qū)來(lái)講，WprA同時(shí)具有兩種功能：一是可以降解部分外源蛋白或細(xì)胞膜外錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)；二是WprA也可以幫助蛋白質(zhì)折疊形成正確的構(gòu)象[29]。蔣紅亮等[29]敲除了wprA基因發(fā)現(xiàn)堿性果膠酶分泌量下降了36%。

④BDB和PPI。影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的另一重要因素是與蛋白質(zhì)折疊相關(guān)的酶，如二硫鍵氧化還原酶(BDB)和肽基脯氨酰順?lè)串悩?gòu)酶(PPI)，它們可以分別幫助蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中二硫鍵的形成和脯氨酸殘基的順?lè)串悩?gòu)化，有利于新生肽鏈的折疊。這兩種酶已被克隆到了芽胞桿菌宿主中，用于提高蛋白分泌[29]。

3.2.3蛋白酶與蛋白降解相關(guān)方面的改造 芽胞桿菌能夠分泌多種蛋白酶[38]，芽胞桿菌分泌的外源蛋白經(jīng)常會(huì)被芽胞桿菌自身分泌的蛋白酶降解，嚴(yán)重影響目的蛋白的產(chǎn)量，所以蛋白酶相關(guān)基因的刪除可能會(huì)提升外源蛋白在芽胞桿菌系統(tǒng)中的分泌量。以枯草芽胞桿菌的蛋白酶為例，中性蛋白酶NprE和堿性蛋白酶AprE為其主要蛋白酶，兩種蛋白酶活性占蛋白酶總活力的95%以上，Vehmaanper等[39]敲除堿性蛋白酶基因aprE和中性蛋白酶基因nprE，使α淀粉酶產(chǎn)量提升了大約2倍。此外，枯草芽胞桿菌細(xì)胞壁蛋白酶WprA的蛋白酶活性可影響某些外源蛋白胞外表達(dá)的穩(wěn)定性。如，Stephenson等[40～42]發(fā)現(xiàn)，WprA對(duì)轉(zhuǎn)運(yùn)后蛋白的穩(wěn)定性有重要影響，敲除wprA或抑制其表達(dá)，可使α-淀粉酶產(chǎn)量顯著增加。但蛋白酶基因的刪除會(huì)影響菌株對(duì)物質(zhì)的利用率，也會(huì)影響后續(xù)的發(fā)酵工藝。除了刪除相關(guān)蛋白酶基因外，還可選用蛋白酶抑制劑或選擇分泌蛋白酶較少的芽胞桿菌作為宿主菌。

3.2.4基于發(fā)酵工藝的分子改造 采用分子手段對(duì)發(fā)酵工藝相關(guān)方面進(jìn)行改造可以使外源基因的分泌量增加，比如增加細(xì)胞的溶氧率[43]。Kallio等[44]將來(lái)源于透明顫菌的血紅蛋白基因vhb克隆到枯草芽胞桿菌中，提升了細(xì)胞對(duì)溶氧限制的抵抗，使得外源蛋白表達(dá)總量提高了1.5倍。除此之外，還可以通過(guò)對(duì)芽胞桿菌芽胞生成的相關(guān)基因進(jìn)行操作，破壞其芽胞生成的基因，從而延長(zhǎng)菌株的穩(wěn)定期，增加外源基因的分泌表達(dá)。芽胞桿菌的芽胞形成是由數(shù)百個(gè)基因協(xié)同完成的復(fù)雜過(guò)程?，F(xiàn)在已有研究表明，控制芽胞生成的主要調(diào)控因子為Spo0A和sigma因子σH、σF、σE、σK、σG。同時(shí)Spo0A因子的磷酸化狀態(tài)在芽胞形成的過(guò)程中起著重要的調(diào)控作用。近期研究發(fā)現(xiàn)，Spo0A受到磷酸化激酶KinA的激活，只有KinA達(dá)到一定程度Spo0A才能起到相應(yīng)的作用，而且KinA對(duì)σF和σE的激活作用更加靈敏[45]。因此基于上述研究，可以對(duì)芽胞生成的關(guān)鍵基因進(jìn)行改造從而提升外源基因在芽胞桿菌表達(dá)系統(tǒng)中的分泌表達(dá)。

4 展望

目前，大量不同來(lái)源的外源基因已在芽胞桿菌中實(shí)現(xiàn)了分泌表達(dá)，有些還獲得了較高產(chǎn)率。使用各類芽胞桿菌已成功生產(chǎn)了堿性蛋白酶、α-淀粉酶等幾種重要的酶制劑，其中α-淀粉酶的分泌表達(dá)量能達(dá)到20～30 mg/mL。正是因?yàn)檠堪麠U菌的這種高產(chǎn)值，使許多研究者對(duì)其分泌表達(dá)機(jī)理進(jìn)行了更加深入的研究?；诜肿訖C(jī)理的研究，可以通過(guò)對(duì)其分泌過(guò)程中的相關(guān)因素，如信號(hào)肽、信號(hào)肽酶、分子伴侶和蛋白酶基因等進(jìn)行改造來(lái)提升芽胞桿菌對(duì)外源蛋白的分泌表達(dá)量，特別是對(duì)于產(chǎn)量已經(jīng)較高但市場(chǎng)需求較大的一些蛋白，比如α-淀粉酶。另一重點(diǎn)研究對(duì)象是分泌表達(dá)量還較低的蛋白，尤其是來(lái)源于革蘭氏陽(yáng)性菌和真核生物的外源蛋白。

基因表達(dá)是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，表達(dá)系統(tǒng)也是一個(gè)復(fù)雜的體系。近年來(lái)，外源蛋白在芽胞桿菌中分泌表達(dá)方面取得很大的進(jìn)展，已建立了有效的外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)，但是相比大腸桿菌的表達(dá)體系，芽胞桿菌的表達(dá)體系相對(duì)不成熟，還需要結(jié)合不同靶基因的分泌表達(dá)差異或通過(guò)對(duì)同一芽胞桿菌不同的突變體進(jìn)行基因組重測(cè)序?qū)ふ谊P(guān)鍵元件，簡(jiǎn)化復(fù)雜的分泌表達(dá)影響因素，使該表達(dá)系統(tǒng)適用范圍更廣，更加方便、高效，以實(shí)現(xiàn)實(shí)際應(yīng)用中的“細(xì)胞工廠”化。

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