轉(zhuǎn)GmTMT2a基因玉米抗旱功能分析

張 靚, 張 蘭, 王曉萍

1.哈爾濱師范大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 哈爾濱 150025;2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所, 北京 100081

維生素E，又稱為生育酚，是一種脂溶性分子，它分為生育酚和三烯生育酚兩種；根據(jù)芳香環(huán)上甲基的數(shù)量以及其在環(huán)上的位置不同，又分別有四種不同的組分，即α-，β-，γ-，δ-生育酚和α-，β-，γ-，δ-三烯生育酚。其中α-生育酚的活性最高且是人及動物最好吸收的。生育酚只能由植物和光合藻類合成。高等植物的種子、根、莖、葉、塊莖、下胚軸、子葉等部位均已發(fā)現(xiàn)生育酚的存在，但不同部位的含量和組成不同[1～3]。α-生育酚通常是光合組織中的主要形式，γ-生育酚在種子中的含量最高。種子中生育酚的含量通常是葉片中的10～20倍[4]。

植物已經(jīng)進(jìn)化出多種機(jī)制來對抗活性氧，如超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、過氧化物酶和脂溶性的抗氧化劑，主要有生育酚和類胡蘿卜素[5]。在植物抗氧化功能方面，生育酚能夠有效地淬滅單線態(tài)氧，清除各種自由基尤其是脂質(zhì)過氧化自由基，從而終止脂質(zhì)過氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)[6～8]。植物的有氧代謝不斷產(chǎn)生活性氧，包括單線態(tài)氧、超氧化物、過氧化氫、羥自由基和脂質(zhì)過氧化物，這是在生物脅迫和非生物脅迫中普遍產(chǎn)生的共同特性。過量活性氧的積累會對各種細(xì)胞器、質(zhì)膜以及核酸、蛋白質(zhì)等大分子造成損傷，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[9]。為了防止這種現(xiàn)象，一個未知的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制會引發(fā)多個針對抗氧化劑活性和代謝調(diào)整的基因的表達(dá)，維持活性氧濃度的穩(wěn)定。

為了提高植物的抗氧化能力，本課題組將來自大豆的維生素E合成關(guān)鍵酶基因GmTMT2a轉(zhuǎn)化到玉米中，獲得了α-生育酚含量顯著提高的轉(zhuǎn)基因玉米株系[10]，本研究對該提高玉米株系的抗氧化能力及其分子機(jī)制進(jìn)行了初步的分析。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

轉(zhuǎn)GmTMT2a基因玉米(transgenic plant，TP)由本實驗室創(chuàng)制[10]，對照材料鄭58(wild type，WT)為本實驗室保存。

本研究中使用的普通化學(xué)試劑購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Trizol試劑購自Invitrogen公司(美國)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒5×All in one RT Master Mix購自ABM公司(加拿大)；實時定量2×qRT PCR Mix購自TOYOBO公司(日本)。

1.2 方法

1.2.1生長條件和處理方法 種子播種于盛有蛭石的花盆中，溫室中正常生長。每盆播種4粒，待苗長至3葉期停止?jié)菜?，停水一周和兩周時取樣測定,設(shè)三組重復(fù)。

1.2.2H2O2含量測定 取0.5 g葉片研磨，加5 mL 0.1%(W/V)三氯乙酸，混勻離心12 000 g，15 min，取5 mL上清加入0.5 mL 1 mol/L磷酸鉀緩沖液(pH 7.0)，1 mL 1 mol/L 碘化鉀，混勻后測390 nm吸光值。

H2O2(μmol/g Fw)=1+227.8×OD390[11]

1.2.3酶活性測定 粗酶液的提?。喝?.5 g葉片于預(yù)冷的研缽中, 加5 mL預(yù)冷的0.05 mol/L PBS(pH 7.8)在冰浴上研磨成勻漿, 在4℃,10 000 r/min下, 離心20 min, 分離上清液, 4℃下保存?zhèn)溆?。該上清液即為酶提取液[12]。

超氧化物歧化酶(SOD)活性測定：按鄒琦[13]的方法測定。取酶液0.05 mL 加入2.95 mL反應(yīng)液(0.05 mmol/L PBS1.5 mL,130 mmol/L Met 0.3 mL, 750 mmol/L NBT 0.3 mL, 100 μmol/L EDTA-Na20.3 mL, 20 μmol/L 核黃素0.3 mL, 蒸餾水0.25 mL), 在4 000 lx日光下反應(yīng)20 min, 在560 nm下測定光密度SOD活性單位以抑制NBT光化還原的50%為一個酶活性單位。

過氧化氫酶(CAT)活性測定:按李合生[13]的方法測定。取酶液0.1 mL加入2.9 mL反應(yīng)液(pH 7.0 Tris-HCl 1.0 mL,200 mmol/L H2O20.2 mL, 蒸餾水1.7 mL)在240 nm下測定吸光度, 每隔1 min讀數(shù)一次, 共測4 min。1 min內(nèi)A240減少0.1的酶量為1個酶活單位(U)。

過氧化物酶(POD)活性測定:按李合生[14]的方法測定。取酶液1 mL加入0.1%愈創(chuàng)木酚1 mL, 蒸餾水6.9 mL, 搖勻, 最后加入0.18% H2O21.0 mL,25℃反應(yīng)10 min, 加入5%偏磷酸0.1 mL, 終止反應(yīng), 并在470 nm下比色。

結(jié)果計算:以每分鐘吸光度變化值表示酶活性大小，即以△A470/[min·g(鮮重)]表示，也可以用每min內(nèi)A470變化0.01為1個過氧化物酶活性單位(U)表示。

過氧化物酶活性[U/(g·min)]=△A470×VT/(w×VS×0.01×t)

式中：△A470：反應(yīng)時間內(nèi)吸光度的變化。w：植物鮮重(g)。VT：提取酶液總體積(mL)。Vs：測定時取用酶液體積(mL)。t：反應(yīng)時間(min)。

1.2.4抗旱基因表達(dá)量的變化 選取三種抗旱基因P5CS、P5CR和TPS。P5CS、P5CR分別是吡咯啉-5-羧酸合成酶、吡咯啉-5-羧酸還原酶，植物中P5CS對干早脅迫下的脯氨酸合成起主要作用。TPS是海藻糖-6-磷酸合酶，海藻糖廣泛存在于動物、植物和微生物中，當(dāng)細(xì)胞處于逆境時，胞內(nèi)海藻糖含量迅速上升，能穩(wěn)定蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子的結(jié)構(gòu)，起保護(hù)劑的作用。以玉米actin1基因作為內(nèi)參。應(yīng)用Primer 5設(shè)計引物，進(jìn)行實時定量PCR分析(qRT-PCR)。引物序列見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 H2O2含量變化

在正常生長條件下，TP和WT植株的H2O2含量無明顯差異，干旱處理后，TP和WT植株的H2O2含量均有所增加，但TP植株增加至正常情況下的1.2倍；而WT植株增加至約1.8倍(圖1)，表明α-生育酚含量提高的TP植株在逆境條件下清除活性氧的能力高于WT植株。

表1 PCR擴(kuò)增引物Table 1 Sequence of primers for PCR amplification.

2.2 抗氧化酶活性變化

為了分析轉(zhuǎn)基因玉米中α-生育酚的提高對體內(nèi)的抗氧化酶類活性的影響，分別對SOD、POD和CAT的酶活進(jìn)行了測定(圖2)。在正常生長情況下，TP和WT植株中的SOD、POD和CAT的酶活性都相對較低，而且無顯著差異；在干旱處理以后，SOD的活性沒有顯著變化；POD的酶活性無論是在TP植株還是WT植株中，其增幅都約為42%。CAT酶活性增幅最大，WT植株中提高了350%,TP植株中提高了467%，而且兩者達(dá)到了極顯著差異，這也與上述轉(zhuǎn)基因植株中H2O2含量較低相一致，CAT酶活性提高，H2O2含量降低。推測逆境條件下α-生育酚的提高能夠促進(jìn)CAT的表達(dá)。

圖1 干旱處理條件下H2O2含量測定Fig.1 Analysis of H2O2 content under drought stress.

圖2 干旱處理條件下SOD(A)、POD(B)、CAT(C)酶活性測定Fig.2 Enzyme activity of SOD(A), POD(B), CAT(C) under drought stress.

2.3 抗旱基因的qRT-PCR結(jié)果

為了分析其他抗旱基因在轉(zhuǎn)基因植株中是否受到α-生育酚提高的影響，對其中的3個基因的表達(dá)進(jìn)行了分析(圖3)。結(jié)果表明，經(jīng)過兩周的干旱處理，無論是TP植株還是WT植株中，三個基因均是先下調(diào)表達(dá)，再上調(diào)表達(dá)。P5CS基因在處理一周后，在WT植株和TP植株中的表達(dá)量分別變?yōu)樘幚砬暗?8%和45%，而在處理兩周后表達(dá)量則分別上升為處理前的1.4倍和1.6倍，在轉(zhuǎn)基因和野生型玉米之間沒有顯著性變化。P5CR基因在處理一周后，在WT植株和TP植株中的表達(dá)量分別變?yōu)樘幚砬暗?8%和44%，處理兩周后表達(dá)量則為處理前的1.6倍和2.6倍。TPS基因在處理一周后，在WT植株和TP植株中的表達(dá)量分別變?yōu)樘幚砬暗?9%和27%，處理兩周后的表達(dá)量分別為處理前的2.2倍和4.1倍。結(jié)果表明在干旱條件下α-生育酚的提高能夠促進(jìn)P5CR和TPS基因的表達(dá)。

圖3 干旱處理條件下逆境相關(guān)基因的表達(dá)分析Fig.3 Expression analysis of drought-tolerance genes under drought stress.A:P5CS; B:P5CR; C:TPS

3 討論

植物在干旱等非生物逆境條件下會產(chǎn)生大量的活性氧，導(dǎo)致氧化逆境，為此植物進(jìn)化形成了多個抗氧化逆境的機(jī)制，包括抗氧化酶類以及抗氧化小分子物質(zhì)如維生素E、維生素C和谷胱甘肽等，生育酚是其中一種有效地抗氧化分子。它可以淬滅單線態(tài)氧，清除各種自由基。在生育酚的四種形式中，α-生育酚是抗脂質(zhì)過氧化最有效的組分。Collakova等[15]通過提高擬南芥中的生育酚含量提高了植株對強(qiáng)光及高溫低溫等的耐受性。2010年，Yusuf等[16]通過提高芥菜中的α-生育酚提高了植株對高鹽和重金屬的耐受性。2015年，Bimal等[17]通過提高紫蘇中的α-生育酚提高了植株的抗氧化活性。本研究表明，過表達(dá)GmTMT2a提高了玉米α-生育酚含量，同時其抗氧化能力得到了明顯提高。

為了進(jìn)一步探討干旱條件下轉(zhuǎn)基因玉米H2O2降低的分子機(jī)制，對抗氧化相關(guān)的酶類 SOD、POD和CAT的酶活性進(jìn)行了測定，其中只有CAT在轉(zhuǎn)基因玉米中的表達(dá)提高最為顯著，而CAT可以分解H2O2;此外干旱條件下在轉(zhuǎn)基因玉米中抗?jié)B透脅迫相關(guān)的基因PC5S和TPS的表達(dá)也有顯著提高。綜合上述結(jié)果，推測α-生育酚對植株抗逆性的影響包括兩方面：一是α-生育酚的提高能夠促進(jìn)CAT的表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致過氧化氫含量的下降，表現(xiàn)為植物抗氧化能力的增強(qiáng)；另一方面是α-生育酚的提高促進(jìn)了一些滲透脅迫相關(guān)基因的表達(dá)，從而提高了植株的抗?jié)B透脅迫能力，抗逆性增強(qiáng)。至于α-生育酚如何促進(jìn)抗逆相關(guān)基因CAT、PC5S和TPS的表達(dá)還有待進(jìn)一步研究。

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