外周血Th17細(xì)胞在炎癥性腸病活動度評估中的臨床意義*

?

外周血Th17細(xì)胞在炎癥性腸病活動度評估中的臨床意義*

高楠1#戴娟1張光波2李月芹1李銳1陳衛(wèi)昌1&

蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科1(215006)蘇州大學(xué)免疫研究所2

*基金項目：2011年度蘇州市科教興衛(wèi)青年科技項目(KJXW2011001)

#Email: carrie_gn@126.com

背景：Th17細(xì)胞在免疫炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，其與炎癥性腸病(IBD)的關(guān)系已成為相關(guān)領(lǐng)域的研究熱點。目的：初步探討Th17細(xì)胞在IBD發(fā)病機(jī)制中的作用以及外周血Th17細(xì)胞在IBD活動度評估中的臨床意義。方法：收集來自5家醫(yī)院的IBD患者81例[克羅恩病(CD)39例，潰瘍性結(jié)腸炎(UC)42例]和健康志愿者40名，采集外周血標(biāo)本，分離單個核細(xì)胞，經(jīng)佛波酯和伊屋諾霉素聯(lián)合刺激后，以流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血CD4+T細(xì)胞中的Th17細(xì)胞比率，同時測定臨床炎癥指標(biāo)ESR和血清CRP。結(jié)果：CD組和UC組外周血Th17細(xì)胞比率分別為2.51%±1.59%和4.15%±2.75%，均顯著高于對照組的1.44%±0.73%(P均<0.05)，其中UC組顯著高于CD組(P<0.01)，活動期CD和UC分別顯著高于緩解期CD和UC(CD: 3.39%±1.56%對1.48%±0.81%,P<0.01; UC: 5.77%±2.77%對2.18%±0.59%,P<0.01)。Spearman秩相關(guān)系數(shù)分析顯示，活動期CD和UC外周血Th17細(xì)胞比率與ESR、CRP均呈正相關(guān)(CD與ESR：rs=0.851，CD與CRP：rs=0.793，UC與ESR：rs=0.817，UC與CRP：rs=0.873，P均<0.05)。結(jié)論：Th17細(xì)胞參與了IBD的發(fā)生、發(fā)展過程，在UC發(fā)病中的作用可能更為重要。檢測外周血Th17細(xì)胞比率可能有助于IBD疾病活動度的評估。

關(guān)鍵詞炎癥性腸病；Th17細(xì)胞；紅細(xì)胞沉降率；C反應(yīng)蛋白

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease, IBD)是一種慢性非特異性腸道炎癥性疾病，包括克羅恩病(Crohn’s disease, CD)和潰瘍性結(jié)腸炎(ulcer-ative colitis, UC)，其病因尚未完全闡明，目前觀點認(rèn)為遺傳易感性、感染、免疫、環(huán)境、微生物等多種因素共同參與了IBD的發(fā)病，免疫因素在其中占主導(dǎo)地位。IBD臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣且易反復(fù)發(fā)作，疾病活動度的評估一般采用結(jié)腸鏡檢查，但用于病情監(jiān)測因檢查過程較痛苦而難以為患者所接受。

Th17細(xì)胞是Th1、Th2細(xì)胞以及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg細(xì)胞)之外的又一重要T細(xì)胞亞群，在免疫炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。近年研究發(fā)現(xiàn)多種自身免疫性疾病中存在Th17細(xì)胞產(chǎn)生的白細(xì)胞介素-17(IL-17)表達(dá)增高[1-8]，Th17細(xì)胞與IBD的關(guān)系已成為相關(guān)領(lǐng)域的研究熱點。本研究采用流式細(xì)胞術(shù)檢測IBD患者外周血CD4+T細(xì)胞中的Th17細(xì)胞比率及其與臨床炎癥指標(biāo)紅細(xì)胞沉降率(ESR)和血清C-反應(yīng)蛋白(CRP)的關(guān)系，初步探討Th17細(xì)胞在IBD發(fā)病機(jī)制中的作用以及外周血Th17細(xì)胞在IBD活動度評估中的臨床意義，為IBD的臨床輔助診斷提供新思路。

材料與方法

一、研究對象

收集2011年5月—2012年7月在蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院、常熟市第二人民醫(yī)院、蘇州市立醫(yī)院、昆山市第二人民醫(yī)院、太倉市第一人民醫(yī)院五家醫(yī)院就診的IBD患者81例，其中CD 39例，UC 42例，診斷符合2007年中華醫(yī)學(xué)會消化病學(xué)分會IBD協(xié)作組《中國炎癥性腸病診斷治療規(guī)范的共識意見》[9]。分別根據(jù)簡化CD活動指數(shù)(CDAI)和Southerland疾病活動指數(shù)對CD和UC患者進(jìn)行病情分期[9]，CD組活動期21例，緩解期18例，UC組活動期23例，緩解期19例。選取同期蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院健康志愿者40名(排除IBD以及相關(guān)疾病家族史)作為對照組。CD、UC組與對照組間性別構(gòu)成、年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。研究方案經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn)，入組受檢者標(biāo)本留取前均簽署知情同意書。

二、方法

1. 分離、培養(yǎng)外周血單個核細(xì)胞(PBMCs)：采集受檢者外周靜脈血(EDTA-K2抗凝)，取2 mL，按1∶1的比例與PBS混勻，F(xiàn)icoll密度梯度離心法分離PBMCs；將細(xì)胞重懸于RPMI 1640培養(yǎng)基中，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106/mL。

2. 細(xì)胞刺激：按試劑說明書在PBMCs懸液中分別加入刺激劑佛波酯(PMA, 1 μg/mL)和伊屋諾霉素(IM, 1 μg/mL)混勻，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)1 h，加入阻斷劑布雷菲德菌素A(BFA, 1 μg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)3 h，410×g離心5 min，棄上清，加入PBS重懸待測。

3. 流式細(xì)胞術(shù)檢測Th17細(xì)胞比率：于流式管中加入適量FITC-抗人CD4抗體(BioLegend, Inc.，劑量參照試劑說明書)，室溫暗處孵育15 min，410×g離心5 min，棄上清；加入固定劑，室溫暗處孵育15 min，410×g離心5 min，棄上清；加入破膜劑，室溫暗處孵育15 min；加入適量PBS，410×g離心 5 min，棄上清；加入PE-抗人IL-17A抗體(BioLegend, Inc.，劑量參照試劑說明書)，室溫暗處孵育30 min；加入適量PBS，410×g離心5 min，棄上清；加入適量PBS，上流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter FC 500)檢測。Th17(%)=(CD4+IL-17+/CD4+)×100%。

4. ESR、CRP檢測：外周血標(biāo)本送生化實驗室，采用常規(guī)方法檢測ESR和血清CRP。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié)果

一、外周血Th17細(xì)胞比率

流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，CD組外周血CD4+T細(xì)胞中的Th17細(xì)胞比率為2.51%±1.59%，UC組為4.15%±2.75%，均高于對照組的1.44%±0.73%，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)，其中UC組顯著高于CD組(P<0.01)(圖1)。

進(jìn)一步按病情分期進(jìn)行分組分析，CD活動期Th17細(xì)胞比率為3.39%±1.56%，緩解期為1.48%±0.81%，UC活動期為5.77%±2.77%，緩解期為2.18%±0.59%，活動期Th17細(xì)胞比率均顯著高于緩解期(P均<0.01)(圖2)。

二、活動期IBD外周血Th17細(xì)胞比率與疾病活動度的關(guān)系

Spearman秩相關(guān)系數(shù)分析顯示，CD活動期外周血CD4+T細(xì)胞中的Th17細(xì)胞比率與ESR(rs=0.851,P<0.05)和CRP(rs=0.793,P<0.05)呈正相關(guān)；UC活動期Th17細(xì)胞比率亦與ESR(rs=0.817,P<0.05)和CRP(rs=0.873,P<0.05)呈正相關(guān)。

討論

免疫功能紊亂是IBD發(fā)病的重要因素之一，效應(yīng)T細(xì)胞的活化是腸黏膜免疫及其后續(xù)炎癥反應(yīng)的起點?，F(xiàn)已明確，在各類T細(xì)胞亞群中，CD4+T細(xì)胞是導(dǎo)致腸黏膜炎癥的主要效應(yīng)細(xì)胞，所有結(jié)腸炎動物模型腸黏膜組織中浸潤的最主要的細(xì)胞類型均為CD4+T細(xì)胞。

圖1外周血CD4+T細(xì)胞中Th17細(xì)胞比率的流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果

Th17細(xì)胞是一類分化機(jī)制和功能特性與Th1、Th2細(xì)胞完全不同的CD4+T細(xì)胞亞群，研究[10]指出，IL-17+T細(xì)胞與Th1、Th2細(xì)胞和Treg細(xì)胞在分化和功能上相互制約，從而維持機(jī)體免疫平衡。Th17細(xì)胞的主要效應(yīng)細(xì)胞因子為IL-17，但其具體分化機(jī)制尚不十分清楚。越來越多的研究表明，Th17細(xì)胞參與了多種自身免疫性疾病的發(fā)病過程，如銀屑病[1]、自身免疫性腦脊髓炎[2,4-5]、IBD[3,6-8]、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎[4]等。H?ltt?等[6]的研究顯示，活動期和緩解期CD患者黏膜固有層產(chǎn)生IL-17的細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比率均高于對照組，腸黏膜活檢組織中的IL-17A mRNA表達(dá)水平亦明顯升高；而糞便IL-17含量僅在活動期CD患者中明顯升高，考慮與其腸黏膜損傷有關(guān)。Rafa等[3]對CD和UC患者血漿Th17相關(guān)細(xì)胞因子mRNA的檢測亦顯示其表達(dá)水平顯著升高。

圖2　活動期與緩解期IBD患者外周血CD4+ T細(xì)胞中Th17細(xì)胞比率比較

本研究結(jié)果顯示，CD和UC患者外周血CD4+T細(xì)胞中產(chǎn)生IL-17的Th17細(xì)胞比率均顯著高于對照組，其中UC組又顯著高于CD組，與Kobayashi等[7]對IBD患者腸黏膜固有層IL-17 mRNA的檢測結(jié)果一致，提示盡管Th17細(xì)胞參與了這兩種疾病的發(fā)生、發(fā)展過程，但在UC發(fā)病中可能起更重要的作用。Fujino等[8]的研究發(fā)現(xiàn)，活動期CD和UC患者病變黏膜中可檢測到IL-17 mRNA表達(dá)，IL-17+細(xì)胞數(shù)量顯著多于緩解期患者，本研究對CD和UC患者外周血的檢測結(jié)果與之相符，表明外周血Th17細(xì)胞比率的檢測可能對評估IBD疾病活動度有一定臨床意義。

ESR和血清CRP能反映IBD腸黏膜炎癥反應(yīng)的強弱和組織損傷程度，對判斷疾病臨床活動度及其嚴(yán)重程度具有重要意義[11]。為進(jìn)一步評價Th17細(xì)胞與IBD的關(guān)系，本研究分析了活動期CD和UC患者外周血CD4+T細(xì)胞中的Th17細(xì)胞比率與ESR和CRP的相關(guān)性，結(jié)果顯示Th17細(xì)胞比率與ESR、CRP均呈正相關(guān)。隨著腸道炎癥的進(jìn)展，ESR和CRP呈升高趨勢，外周血Th17細(xì)胞比率同步上升，與疾病活動度相一致。

綜上所述，本研究結(jié)果提示Th17細(xì)胞參與了IBD的發(fā)生、發(fā)展過程，在UC發(fā)病中的作用可能更為重要，有可能成為IBD免疫學(xué)治療的新靶點，而檢測外周血Th17細(xì)胞比率可能有助于IBD疾病活動度的評估。考慮到本研究樣本量偏小，上述結(jié)論尚需擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步驗證。

參考文獻(xiàn)

1 Zheng Y, Danilenko DM, Valdez P, et al. Interleukin-22, a T(H)17 cytokine, mediates IL-23-induced dermal inflammation and acanthosis[J]. Nature, 2007, 445 (7128): 648-651.

2 Sutton C, Brereton C, Keogh B, et al. A crucial role for interleukin (IL)-1 in the induction of IL-17-producing T cells that mediate autoimmune encephalomyelitis[J]. J Exp Med, 2006, 203 (7): 1685-1691.

3 Rafa H, Saoula H, Belkhelfa M, et al. IL-23/IL-17A axis correlates with the nitric oxide pathway in inflammatory bowel disease: immunomodulatory effect of retinoic acid[J]. J Interferon Cytokine Res, 2013, 33 (7): 355-368.

4 Komiyama Y, Nakae S, Matsuki T, et al. IL-17 plays an important role in the development of experimental autoimmune encephalomyelitis[J]. J Immunol, 2006, 177 (1): 566-573.

5 Langrish CL, Chen Y, Blumenschein WM, et al. IL-23 drives a pathogenic T cell population that induces autoimmune inflammation[J]. J Exp Med, 2005, 201(2): 233-240.

6 H?ltt? V, Klemetti P, Sipponen T, et al. IL-23/IL-17 immunity as a hallmark of Crohn’s disease[J]. Inflamm Bowel Dis, 2008, 14 (9): 1175-1184.

7 Kobayashi T, Okamoto S, Hisamatsu T, et al. IL23 differentially regulates the Th1/Th17 balance in ulcerative colitis and Crohn’s disease[J]. Gut, 2008, 57 (12): 1682-1689.

8 Fujino S, Andoh A, Bamba S, et al. Increased expression of interleukin 17 in inflammatory bowel disease[J]. Gut, 2003, 52 (1): 65-70.

9 中華醫(yī)學(xué)會消化病學(xué)分會炎癥性腸病協(xié)作組. 中國炎癥性腸病診斷治療規(guī)范的共識意見[J]. 中華內(nèi)科雜志, 2008, 47 (1): 73-79.

10Harrington LE, Hatton RD, Mangan PR, et al. Interleukin 17-producing CD4+ effector T cells develop via a lineage distinct from the T helper type 1 and 2 lineages[J]. Nat Immunol, 2005, 6 (11): 1123-1132.

11Solem CA, Loftus EV Jr, Tremaine WJ, et al. Correlation of C-reactive protein with clinical, endoscopic, histologic, and radiographic activity in inflammatory bowel disease[J]. Inflamm Bowel Dis, 2005, 11 (8): 707-712.

(2015-05-12收稿；2015-06-26修回)

Clinical Significance of Peripheral Blood Th17 Cells in Evaluating Disease Activity of Inflammatory Bowel DiseaseGAONan1,DAIJuan1,ZHANGGuangbo2,LIYueqin1,LIRui1,CHENWeichang1.1DepartmentofGastroenterology,2KeyLaboratoryofMedicineandClinicalImmunologyofJiangsuProvince,theFirstAffiliatedHospitalofSoochowUniversity,Suzhou,JiangsuProvince(215006)

Correspondence to: CHEN Weichang, Email: weichangchen@126.com

Background: Th17 cells play important roles in immuno-inflammatory responses. The relationship between Th17 cells and inflammatory bowel disease (IBD) is a new hot spot of related studies. Aims: To investigate preliminarily the role of Th17 cells in the pathogenesis of IBD and the clinical significance of peripheral blood Th17 cells in evaluating disease activity. Methods: Peripheral blood mononuclear cells were collected in 81 IBD patients recruited from 5 hospitals, including 39 Crohn’s disease (CD) and 42 ulcerative colitis (UC), and also 40 healthy volunteers. The proportion of Th17 cells in peripheral blood CD4+T cells was detected with flow cytometry after stimulated by PMA and ionomycin. Simultaneously, two clinical inflammatory markers, ESR and serum CRP were measured. Results: The proportion of peripheral blood Th17 cells was significantly higher in CD group (2.51%±1.59%) and UC group (4.15%±2.75%) than in control group (1.44%±0.73%,Pall <0.05), and that in UC group was significantly higher than in CD group (P<0.01). Furthermore, the proportion of peripheral blood Th17 cells in IBD patients was significantly higher in active stage than in remission stage (CD: 3.39%±1.56%vs. 1.48%±0.81%,P<0.01; UC: 5.77%±2.77%vs. 2.18%±0.59%,P<0.01). In Spearman rank correlation coefficient analysis, the proportion of peripheral blood Th17 cells in active stage CD and UC was correlated significantly with ESR (rs=0.851, P<0.05; rs=0.817,P<0.05) and CRP (rs=0.793, P<0.05; rs=0.873,P<0.05). Conclusions: Th17 cells might be involved in the pathogenesis and development of IBD, especially UC. Measurement of the proportion of peripheral blood Th17 cells is beneficial for the evaluation of disease activity of IBD.

Key wordsInflammatory Bowel Disease;Th17 Cells;Erythrocyte Sedimentation Rate;C-Reactive Protein

通信作者&本文，Email: weichangchen@126.com

DOI:10.3969/j.issn.1008-7125.2015.12.003