CHO-K1細胞株的建立及其在藥物安全性篩選方面的應(yīng)用

張之東,陳 慧,郝六平,魏 轉(zhuǎn),李麗娟

(河北化工醫(yī)藥職業(yè)技術(shù)學(xué)院制藥系,河北石家莊 050026)

CHO-K1細胞株的建立及其在藥物安全性篩選方面的應(yīng)用

張之東,陳 慧,郝六平,魏 轉(zhuǎn),李麗娟

(河北化工醫(yī)藥職業(yè)技術(shù)學(xué)院制藥系,河北石家莊 050026)

研究了穩(wěn)定表達h ERG基因的CHO-K1(中國倉鼠卵巢細胞)細胞株及其在藥物研發(fā)安全性篩選方面的應(yīng)用。使用Lipofectamine 2000系統(tǒng)將hERG基因轉(zhuǎn)染入CHO-K1細胞,用Western Blot檢測其表達,并進一步通過 FluxORTMThallium A ssay Kits驗證;同時使用 FluxORTMThallium A ssay Kits檢測Cisap ride和Dofetilide對hERG通道的抑制性。建立了4株穩(wěn)定表達hERG基因的CHO-K1細胞株,Cisap ride和Dofetilide對hERG通道的 IC50分別為86.7 nmol·L-1和28.1 nmol·L-1。hERG基因成功地在CHO-K1細胞株實現(xiàn)了穩(wěn)定表達,此細胞株可用于FluxORTMThallium A ssay Kits系統(tǒng),用于藥物研發(fā)安全性篩選,以評估化合物潛在的心臟毒性。

hERG;中國倉鼠卵巢細胞;FluxORTM

人類的hERG基因(human ether-a-go-go-related gene)編碼產(chǎn)物是一種電壓門控式的鉀離子通道。hERG基因是1994年由WARM KE等用小鼠 EAG(ether-a-go-go-related gene)基因同源染色體篩選人類海馬cDNA文庫分離得到的,同年JIANG等通過候選基因定位法確定了hERG是先天性長QT綜合征(long Q-T symp tom,LQ TS)的致病基因之一[1]。人們對hERG基因的關(guān)注源于其編碼的鉀離子通道,在心臟動作電位復(fù)極過程中發(fā)揮重要的作用?；蛲蛔兓蛩幬镆鹪撏ǖ赖墓δ墚惓？赡軙鹦呐KQT間期延長,進而可引起尖端扭轉(zhuǎn)型室性心動過速(torsades de pointes,TdP)、心室纖顫甚至猝死。TdP是可以致命的,因此誘導(dǎo)TdP的危險導(dǎo)致了藥物的撤銷和不被批準。hERG鉀通道已作為評價化合物潛在心臟毒性的分子靶標,進行候選化合物hERG的安全性篩選,廣泛用于新藥研發(fā)的早期階段,以利于有效地降低新藥研發(fā)成本和風險。

FluxORTMThallium Assay Kits試劑盒是Invitrogen公司于近期推出的最新的hERG通道高通量篩選試劑盒,該試劑盒滿足了藥物研發(fā)過程中化合物對hERG通道的安全性篩查。較之傳統(tǒng)意義上的膜片鉗技術(shù)耗時、耗力、耗資,該方法省時、省力、成本低,并且能在真正意義上達到藥物研發(fā)過程中的高通量篩選要求。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑及裝置

DM EM培養(yǎng)基,胎牛血清,Lipofectamine 2000系統(tǒng),FluxORTMThallium A ssay Kits和 G418,購于 Invitrogen公司;Protease Inhibito r Cocktail,Monoclonal Anti-Actin,Cisap ride和 Dofetilide,購于 Sigma-A ldrich公司;質(zhì)粒抽提試劑盒,購于 Q IAGEN;蛋白 M arker,購于B IO-RAD;Anti-M yc Tag,購于 M illipo re;A nti-mouse IgG,HRP-Linked Antibody,購于CELL SIGNAL ING公司;Western及IP細胞裂解液,購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司;ECL Western Blot分析裝置,購于 GE公司。

1.1.2 菌種和細胞

大腸桿菌 Top-10及CHO-K1細胞,均為本實驗室保存;表達載體pCMV-EN TRY-HERG(phERG)購于ORIGENE公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

CHO-K1細胞培養(yǎng)基為DM EM補加10%(體積分數(shù))胎牛血清(FBS),溫度為37℃,于5%(體積分數(shù))CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞復(fù)蘇之后,在25 cm2方瓶中傳代培養(yǎng)。細胞長滿瓶底面積約90%時,用0.25%(質(zhì)量分數(shù))胰酶消化,1∶10進行傳代。轉(zhuǎn)染前1日,對消化后細胞計數(shù),稀釋細胞數(shù)至1×105個/mL,轉(zhuǎn)移至6孔板,2 mL/孔,培養(yǎng)至第2天匯合度大約在60%左右,備用。

1.2.2 質(zhì)粒準備

質(zhì)粒抽提使用無內(nèi)毒素質(zhì)粒抽試劑盒。提取后,采用核酸電泳確定分子質(zhì)量的大小,同時使用微量核酸定量儀ND-1000(Nano Drop Technologies公司提供)測定A260/A280,比值為1.80～1.95方可使用,同時進行質(zhì)粒定量。

1.2.3 轉(zhuǎn)染過程

A液:分別使用無血清的DM EM 250μL,稀釋1,2,4μg質(zhì)粒DNA。B液:使用無血清的DM EM 250 μL,加入Lipofectamine 2000 10μL,室溫放置5 min。將A液和B液混合,溫和吹打均勻,室溫放置20 min。將混合液逐滴沿培養(yǎng)孔的邊緣加入到6孔培養(yǎng)板中,前后搖動混合均勻,放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。6 h后,棄去培養(yǎng)液,添加2 m L新鮮的含10%(體積分數(shù))FBS的DM EM。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后,消化培養(yǎng)孔內(nèi)細胞,使用含G418(800μg/m L)的DM EM完全培養(yǎng)基吹打,后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中培養(yǎng),3 d換液1次。

1.2.4 單克隆篩選

標記疑似單克隆位置處,用0.25%(體積分數(shù))Trypsin-EDTA消化液浸濕濾紙(濾紙尺寸<5 mm×5 mm),置于所標記克隆位置處,20 s左右放入已經(jīng)含有 G418選擇培養(yǎng)基2 mL的溶液中,涮洗濾紙塊數(shù)次,以使黏附的細胞脫落。預(yù)先對96孔板除第1排之外的所有孔加含10%(體積分數(shù))胎牛血清的細胞培養(yǎng)液,0.1 m L/孔。將上述細胞液接種于96孔板的第1排,0.2 m L/孔,從中吸取0.1 m L細胞溶液接種于第2排,混合后,從第2排中吸取0.1 mL接種于第3排……一直到第8排,最后一排丟棄0.1 m L細胞液。培養(yǎng)2周左右,轉(zhuǎn)移至24孔板中擴大培養(yǎng),繼續(xù)6孔板,待細胞長密之后,計數(shù),通過有限稀釋法,至細胞數(shù)為5個/m L,鋪96孔板,每孔0.1 m L,將剩余細胞凍存。培養(yǎng)2周左右,轉(zhuǎn)移至24孔板中擴大培養(yǎng),采用Western Blot分析裝置驗證。

1.2.5 免疫印跡分析

樣品經(jīng)10%(體積分數(shù))SDS-PAGE凝膠電泳,100 V轉(zhuǎn)膜2 h,將蛋白轉(zhuǎn)移至孔徑為0.45μm的PVDF膜。在封閉液(PBST+5%(體積分數(shù))BSA)中于37℃孵育1 h。加入用封閉液稀釋5 000倍的一抗,于37℃孵育2 h;使用 PBS洗膜3次,每次10 min,用封閉液稀釋2 500倍的 HRP標記二抗,于37 ℃孵育1 h。使用 PBS洗膜3次,每次10 min,浸于 Western Blot分析裝置3 min,曝光,洗片。

1.2.6 FluxORTMThallium A ssay

實驗前1日下午鋪96孔板2行,前3個孔為 W T-CHO-K1細胞(野生型),其余為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染hERG的CHO-K1細胞。

2 結(jié)果與分析

2.1 CHO-K1細胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染

2.1.1 G418最佳篩選質(zhì)量濃度的確定

在進行轉(zhuǎn)染時,由于Lipofectam ine對細胞膜有損害作用,因而在轉(zhuǎn)染過程中使用的培養(yǎng)基中均未加入雙抗(轉(zhuǎn)染后的后續(xù)培養(yǎng)過程中也不加入,因為鏈霉素和 G418均為氨基糖苷類抗生素)。由于每種細胞對G418的敏感程度是不一樣的,一般變動范圍為100～1 000μg/m L,而不同廠家生產(chǎn)的相同質(zhì)量濃度的G418的活性可能也不盡相同,因而在做轉(zhuǎn)染之前需進行最佳篩選質(zhì)量濃度的確定。分別使用100,200,400,600,800,1 000μg/m L,配制篩選質(zhì)量濃度,鋪6孔板,細胞數(shù)為20 000個/孔。根據(jù)培養(yǎng)基的顏色和細胞生長情況,每3 d左右更換一次培養(yǎng)基,10～14 d能夠殺死所有細胞的最小 G418的質(zhì)量濃度即為最佳篩選質(zhì)量濃度。由實驗得知最佳篩選質(zhì)量濃度為800μg/m L。

2.1.2 CHO-K1的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后的Western Blot鑒定

96孔板中細胞長至孔內(nèi)1/10左右時,轉(zhuǎn)移至24孔板,長滿后消化取2/3裂解,剩余繼續(xù)傳代。細胞裂解提取總蛋白的過程全部在4℃進行,裂解上清液分裝并立即凍存于超低溫冰箱。取部分裂解上清液進行Western Blot分析,結(jié)果見圖1。

由圖1可見2條帶大小均在120 kD左右。據(jù)文獻報道,hERG基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的 HEK293細胞,Western Blot分析結(jié)果顯示為2條帶,大小分別為135 kD和155 kD,這是由于不同的糖基化位點造成的[2-3]。1B12,1G5,3H3,4F8為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CHO-K1細胞系;空白為野生型CHO-K1細胞。將50μL粗蛋白用6倍的樣品緩沖液稀釋,用10%(體積分數(shù))丙烯酰胺凝膠進行SDS-PAGE電泳,免疫印跡結(jié)果用化學(xué)發(fā)光法進行檢測。

2.2 FluxORTM Thallium Assay Kits在藥物研發(fā)安全性篩選中的應(yīng)用

2.2.1 Cisap ride對hERG鉀離子通道的抑制作用

Cisap ride(西沙必利),化學(xué)名為(+/-)-順式-4-氨基-5-氯-N-[1-[3-(4-氟苯氧基)丙基]-3-甲氧基-4-哌啶基]-2-甲氧基苯甲酰胺,為胃腸激動劑,促進胃腸動力作用極強,療效顯著。但在1996年出現(xiàn)了心臟毒性的報道,其原因是它能抑制hERG鉀離子的通道。FDA在1998年已經(jīng)發(fā)出用藥警告,2000年7月起該藥在英國、美國和加拿大被停用。法國盡管對該藥有一定限制,但仍允許該藥繼續(xù)用于兒科。Cisap ride為hERG鉀離子通道,臨床上可引起QT間期延長,甚至?xí)炟屎托脑葱遭馈?/p>

在FluxORTMThallium A ssay Kits系統(tǒng)中,使用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染hERG基因的CHO-K1細胞為模型,W TCHO-K1細胞為空白對照,檢測Cisap ride對hERG鉀離子通道的抑制作用,見圖2,其中箭頭指示位置表示施加 TI+/K+刺激,熒光激發(fā)光波長為490 nm,吸收光波長為525 nm。

圖1 Western Blo t分析Fig.1 Western Blot analysis

如圖2所見,在 W T-CHO-K1細胞中,在加入 TI+/K+刺激液后,熒光值沒有發(fā)生顯著變化;而在CHO-K1-hERG(未加入抑制劑Cisap ride)細胞中,加入 TI+/K+刺激液后熒光值發(fā)生顯著變化,在90 s左右,幾乎達到了基底值的3倍。這是因為hERG通道對 TI+/K+的通透性引起的,而在W T-CHO-K1細胞中通透性很低。在加入Cisap ride后,由于其對hERG通道的抑制,降低了hERG通道對 TI+/K+的通透,熒光值顯著降低。隨著 Cisap ride濃度的增大,熒光值變小,呈濃度依賴性,當 濃度達到 1 000 nmol/L和3 000 nmol/L時,幾乎與W T-CHO-K1細胞平齊,抑制率接近100%。Cisap ride對hERG通道IC50為 86.7 nmol/L,參見圖 3,其中ΔF/F=(熒光值-基線值)/基線值,基線值=平均值(4次),熒光激發(fā)光波長為490 nm,吸收光波長為525 nm。據(jù)文獻報道,使用膜片鉗技術(shù)測定的 IC50為 6.5～44 nmol/L[1,4-5],與本系統(tǒng)接近。

2.2.2 FluxORTMThallium Assay Kits在藥物研發(fā)安全性篩選中的應(yīng)用舉例

圖2 在 FluxORTM Thallium A ssay Kits系統(tǒng)中Cisap ride對h ERG鉀離子通道的抑制Fig.2 Cisap ride’s inhibition of the hERG potassium channel in FluxORTM Thallium Assay Kits

以Dofetilide(多非利特)為例,說明 Flux-ORTMThallium A ssay Kits在藥物研發(fā)安全性篩選中的應(yīng)用。Dofetilide為選擇性 I型鉀離子通道阻滯劑,是由美國 Pfizer公司開發(fā)的抗心律失常藥物,主要用于治療心衰、心律失常和心房顫動,2000年5月獲 FDA批準在美國首次上市(商品名為 Tikosyn),化學(xué)名為 N-[4-[2-[甲基[2-[4-(甲磺酰胺基)苯氧基]乙基]氨基]乙基]苯基]甲磺酰胺。Dofetilide直接作用于hERG通道,抑制 K+內(nèi)流。Dofetilide可作為陽性化合物檢測FluxORTMThallium A ssay Kits系統(tǒng)的穩(wěn)定性。

在FluxORTMThallium A ssay Kits系統(tǒng)中,不同濃度的Dofetilide對 hERG通道的作用見圖4,其中ΔF/F=(熒光值-基線值)/基線值,基線值=平均值(4次);c為多非利特濃度;熒光激發(fā)光波長為490 nm,吸收光波長為525 nm。如圖4所示,當Dofetilide的濃度大于1 000 nmol/L時,其對hERG通道的抑制率接近100%,完全抑制。據(jù)文獻報道,Dofetilide對 hERG的 IC50為 10～110 nmol/L[6-8],可以認為與本系統(tǒng)相同。FluxORTMThallium A ssay Kits系統(tǒng)可取代膜片鉗技術(shù)用于藥物研發(fā)安全性篩選。

3 討 論

通過Lipofectamine 2000系統(tǒng)對CHO-K1細胞株轉(zhuǎn)染,并經(jīng)過Western Blot鑒定檢測,確定已經(jīng)成功構(gòu)建了穩(wěn)定表達hERG基因的4株CHO-K1細胞株。1994年研究人員發(fā)現(xiàn)了遺傳性心律失常LQT的2個新的基因位點,分別位于染色體7q35—7q36和3p21—3p24,其中hERG基因位于7q35—7q36,與LQT2位于同一染色體同一部位并與之緊密連鎖?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)在hERG上有200多個不同的突變位點,這些突變均導(dǎo)致LQTS。一些抗心律失常藥物如第3類抗心律失常藥通過抑制hERG鉀通道引起獲得性LQ T2,一些非抗心律失常藥物如三環(huán)類抗抑郁藥(丙米嗪、阿米替林)、5-羥色胺攝取抑制劑、組胺受體拮抗劑、氟喹諾酮類抗生素、某些抗腫瘤藥物等亦可通過改變hERG鉀通道結(jié)構(gòu)及功能而引起LQ T2。因此hERG相關(guān)的獲得性LQ T2已成為評價新藥安全性的一個重要指標,一些藥物由于抑制了hERG鉀通道誘發(fā)心律失常而被禁止銷售,如西沙比利、特那非丁、格雷沙星等[9]。所以穩(wěn)定表達hERG基因的CHO-K1細胞可以用于FluxORTMThallium A ssay Kits系統(tǒng),用于藥物研發(fā)安全性篩選。

Cisap ride和Dofetilide對hERG通道的IC50分別為86.7 nmol/L和28.1 nmol/L,與文獻報道的使用膜片鉗技術(shù)的測定值接近。構(gòu)建的穩(wěn)定表達hERG基因的CHO-K1細胞株能檢測Cisap ride和Dofetilide的穩(wěn)定性,基因轉(zhuǎn)染的方法有多種類型,如經(jīng)典的磷酸鈣沉淀法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法和電穿孔法[10]。陽離子脂質(zhì)體表面帶正電荷,與帶負電荷的基因結(jié)合成復(fù)合物,此復(fù)合物吸附于細胞表面并將DNA釋放進入細胞。陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染具有轉(zhuǎn)染效率高、重復(fù)性好、相對安全、細胞毒性小等優(yōu)點。采用此方法構(gòu)建的穩(wěn)定表達hERG基因的CHO-K1細胞株在藥物研發(fā)安全性篩選中發(fā)揮了重要作用[11]。

4 結(jié) 語

建立了4株穩(wěn)定表達hERG基因的CHO-K1細胞株,并可成功地用于FluxORTMThallium A ssay Kits系統(tǒng),用于藥物研發(fā)安全性篩選。Cisap ride和Dofetilide對hERG通道的 IC50分別為86.7 nmol/L和28.1 nmol/L,與文獻報道的使用膜片鉗技術(shù)的測定值接近。以表達hERG基因的 CHO-K1細胞株為基礎(chǔ),FluxORTMThallium A ssay Kits系統(tǒng)可用于藥物研發(fā)安全性篩選,以評估化合物潛在的心臟毒性。

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Establishment of CHO-K1 cell lines and its app lication in drug safety screening

ZHANG Zhi-dong,CHEN Hui,HAO Liu-ping,W EIZhuan,L ILi-juan
(Department of Pharmacy,Hebei Chemical and Pharmaceutical Vacation College,Shijiazhuang Hebei 050026,China)

CHO-K1(Chinese hamster ovary cell)cell lines stably exp ressing hERG gene and its app lication in drug R&D safety screening were studied.hERG gene was transfected into CHO-K1 cellw ith Lipofectamine 2000,and the exp ression of hREG was detected by using Western Blot technology and FluxORTMThallium Assay Kits,p roving the inhibition of hERG by detecting Cisap ride and Dofetilide.Four cell lines stably exp ressing hERG gene was established,and ICTMare,respectively,86.7 nmol·L-1,28.1 nmol·L-1of Cisap ride and Dofetilide.h ERG is transfected into CHO-K1 cell lines successfully,and the cell lines can be used to drug R&D safety screening in FluxORTMThallium Assay Kits.

hERG;CHO-K1;FluxORTM

TQ464;Q81

A

1008-1542(2010)02-0137-05

2009-11-03;責任編輯:張士瑩

張之東(1971-),男,河北東光人,講師,主要從事化學(xué)制藥方面的研究。

陳 慧,E-mail:chenhuisjz@126.com