眼針與體針對急性腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織T N F-α表達(dá)的差異研究

井歡，于丹，高原，王哲，王瑩，潘茜，關(guān)洪全

（1．遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 病理學(xué)教研室，遼寧 沈陽 110847；2．遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫與病原生物學(xué)教研室，遼寧 沈陽 110847）

眼針與體針對急性腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織T N F-α表達(dá)的差異研究

井歡1，于丹1，高原1，王哲1，王瑩1，潘茜1，關(guān)洪全2△

（1．遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 病理學(xué)教研室，遼寧 沈陽 110847；2．遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫與病原生物學(xué)教研室，遼寧 沈陽 110847）

目的分別觀察眼針與體針療法對缺血再灌注損傷24 h后大鼠腦組織中TNF-α表達(dá)的影響，探討眼針與體針不同療法對免疫效應(yīng)表達(dá)的差異，為眼針療法的臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。方法線栓法制備SD大鼠大腦中動脈梗死（middle cerebral artery occlusion，MCAO）再灌注模型。將48只 SD大鼠隨機(jī)分為正常對照組、體針組、模型組、假手術(shù)組、眼針穴區(qū)組與眼針穴區(qū)外組(n=8)。模型組、眼針穴區(qū)組、眼針穴區(qū)外組與體針組均采用改良的線栓法制備SD大鼠大腦中動脈梗死（middle cerebral artery occlusion，MCAO）再灌注模型。采用ZeaLonga評分法進(jìn)行大鼠神經(jīng)功能評分；ELISA方法檢測缺血再灌注24 h后大鼠血清TNF-α含量；實時定量PCR方法檢測缺血再灌注24 h后大鼠腦皮質(zhì)TNF-αmRNA的表達(dá)；Western Blot法檢測缺血再灌注24 h后大鼠腦皮質(zhì)TNF-α蛋白的表達(dá)。結(jié)果腦缺血再灌注24 h后，眼針穴區(qū)組和體針組大鼠神經(jīng)功能缺損評分均較模型組大鼠評分降低（P＜0.01），但兩者相比無統(tǒng)計學(xué)差異，眼針穴區(qū)外組大鼠評分與模型組相比較無統(tǒng)計學(xué)差異；眼針穴區(qū)組、體針組和和眼針穴區(qū)外組大鼠血清TNF-α含量均較模型組顯著減少（P＜0.01），但以眼針穴區(qū)組與體針組減少更明顯，眼針穴區(qū)組與體針組比較無統(tǒng)計學(xué)差異；眼針穴區(qū)組、體針組和眼針穴區(qū)外組大鼠腦組織TNF-αmRNA含量和蛋白質(zhì)含量均較模型組顯著下調(diào)（P＜0.01），眼針穴區(qū)組與體針組比較無統(tǒng)計學(xué)差異。結(jié)論眼針與體針在改善急性腦缺血再灌注損傷中的免疫效應(yīng)相當(dāng)，且兩種療法的作用機(jī)制可能均與腦組織TNF-α的表達(dá)下調(diào)有關(guān)。

急性腦缺血再灌注損傷；腫瘤壞死因子；眼針療法；體針療法

缺血性腦血管病約占全部腦血管病的70%～80%，腦血管疾病已經(jīng)成為嚴(yán)重危害人類生命和健康的一類疾病。近年來提出了治療急性腦缺血的一種新方法——神經(jīng)保護(hù)，該法是以腦缺血級聯(lián)反應(yīng)的過程作為干預(yù)治療的靶點(diǎn)。腦缺血再灌注后，腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）是最早出現(xiàn)并發(fā)揮作用的細(xì)胞因子，是炎癥反應(yīng)的始動因素之一，在缺血再灌注后的腦組織損傷中發(fā)揮重要作用。眼針療法是在眼眶周圍用針刺等刺激防治疾病的一種微針療法，對于急性缺血性腦血管病等多種疾病療效顯著[1-2]。而目前臨床體針曲池、足三里兩穴對于急性腦缺血療效顯著，有實驗顯示能有效的減少腦梗死的面積并對梗死邊緣區(qū)神經(jīng)細(xì)胞呈現(xiàn)一定的保護(hù)作用[3]。本研究是通過急性腦缺血再灌注損傷（cerebral ischemia reperfusion injury，CIRI）模型，觀察針刺眼針穴區(qū)、眼針穴區(qū)外與體針對CIRI大鼠24 h后神經(jīng)功能缺損評分及血液、腦組織TNF-α表達(dá)變化的影響，旨在探討眼針療法與體針療法對急性CIRI模型大鼠效應(yīng)的差異性，為眼針療法的臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 健康SD大鼠48只，雌雄不拘，體重（280±20）g。實驗動物購自北京維通利華實驗動物中心[動物許可號：SCXK（京）2007-0001]。適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后實施標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料喂養(yǎng)，動物實驗室內(nèi)保持相對濕度45%，22℃。將實驗用SD大鼠以每組8只隨機(jī)分為正常對照組、假手術(shù)組、模型組、眼針穴區(qū)組、眼針穴區(qū)外組與體針組，共計6組。

1.2 模型的制備與模型評分 采用改良的線栓法[4-7]制作大鼠大腦中動脈缺血再灌注損傷動物模型，模型組、眼針穴區(qū)組、眼針穴區(qū)外組與體針組均需復(fù)制。模型成功采用標(biāo)準(zhǔn)為：腦組織缺血2 h后進(jìn)行再灌注，同時參照ZeaLonga評分標(biāo)準(zhǔn)[8]進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評分，評分為5分制：無癥狀記0分；不能完全伸展對側(cè)前爪記1分；向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈記為2分；向?qū)?cè)傾倒記為3分；不能自發(fā)行走，意識喪失記為4分。

實驗對象納入標(biāo)準(zhǔn)：評分1～3分的動物。

假手術(shù)組術(shù)式同模型組，操作標(biāo)準(zhǔn)為釣魚線插入深度控制為0.5～1 cm，其他手術(shù)術(shù)式同模型組。正常組不處理。

1.3 眼針取穴及刺法 眼針穴區(qū)組取穴：取肝區(qū)、上焦區(qū)、下焦區(qū)、腎區(qū)針刺，用31號13 mm毫針，參照人體取穴方法定位[9-11]（見圖1 A）。采用眶上橫刺法，于大鼠眶緣處，按照穴區(qū)定位線1→8的順序（見圖1 B），從該穴區(qū)定位線一端進(jìn)針，橫刺進(jìn)針3 mm，到另一定位線，留針20 min，10 min時刮針1次，刮針5下。 治療時間：于腦缺血再灌注后立即進(jìn)行眼針治療，之后每12 h針刺1次，取材前30 min進(jìn)行最后一次眼針治療。

眼針穴區(qū)外組取穴：選擇同名穴區(qū)的外3 mm處為眼針針刺部位，刺法與眼針穴區(qū)相同。

1.4 體針取穴及刺法 體針取穴：以動物比較學(xué)方法定位，參照人體相關(guān)穴位，按照《中國獸醫(yī)針灸學(xué)》的方法取穴。取穴位：曲池穴（肘關(guān)節(jié)前外側(cè)凹陷中，直刺5 mm）、足三里穴（膝關(guān)節(jié)后外側(cè)、腓骨小頭下約直刺5 mm處，針法為斜刺1 cm）。

圖1 眼針定位示意圖（左眼）Fig.1 The locations of acupoint of eye acupuncture (left eye)

1.5 試劑及實驗用藥 親和純化TNF-α多克隆抗體(兔抗鼠)購自武漢博士德生物工程有限公司。TNF-α及β-actin引物由北京華大基因公司制備合成。實時定量PCR試劑盒購自TaKaRa大連寶生物。

1.6 ELISA方法 針刺治療結(jié)束后，麻醉狀態(tài)下腹主動脈取5 mL，離心分離血清，-70℃保存?zhèn)溆?；參照試劑盒產(chǎn)品說明書進(jìn)行TNF-α檢測。利用全自動酶標(biāo)儀，測定各孔的OD值（450 nm處），采用Curve Expert 1.3繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算濃度值。

1.7 Western blot法 取實驗動物缺血再灌注24 h后的腦組織。采用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，斷頭后取腦組織，加入裂解液（腦組織∶裂解液=1∶10），制作腦組織樣品勻漿，離心15 min（12000 g），取上清即為總蛋白。等量的細(xì)胞蛋白提取物通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis， SDSPAGE）電泳分離，并轉(zhuǎn)移到PVDF(polyvinylidene fluoride)膜上。在室溫下，PVDF膜在封閉緩沖液中封閉2 h，孵育一抗緩沖液（TNF-α 1∶500），4℃過夜。次日，室溫下孵育HRP-標(biāo)記的二抗緩沖液（1∶3000）2 h。O-dianidine，β-萘酯磷酸鈉顯色；掃描儀掃描NC(nitrocellulose filter membrane)膜，分析結(jié)果。

1.8 實時定量RT-PCR方法 采用Trizol試劑提取腦組織總RNA，應(yīng)用Quant Reverse Transcriptase逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。以適量cDNA為模板，以β肌動蛋白（β-actin）為內(nèi)參照，PCR擴(kuò)增TNF-α基因片段，TNF-α上游引物：5′CCACGCTCTTCTGTCTACTG 3′；TNF-α下游引物：5′GCTACGGGCTTGTCACTC 3′。β-actin引物分別為：5′CGTGCGTGACATTAAAGAG 3′，5′TTGCCGATAGTGATGACCT 3′。檢測ABI Prism 7500 HT系統(tǒng)中所有產(chǎn)物的序列。以β-actin為內(nèi)參，以擴(kuò)增倍數(shù)為比較依據(jù)，讀CT值，△CT=CT目的基因-CTβ-actin，△△CT=△CT實驗-△CT對照，擴(kuò)增倍數(shù)= 2-△△CT。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 11.5軟件統(tǒng)計分析，正態(tài)計量數(shù)據(jù)采用“x±s”表示，使用單因素方差分析法進(jìn)行組間比較。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能缺損評分結(jié)果 正常組與假手術(shù)組均無神經(jīng)功能障礙表現(xiàn)；模型組表現(xiàn)出行走向?qū)?cè)旋轉(zhuǎn)、傾倒或提尾時左側(cè)前肢不能伸直等不同程度的神經(jīng)功能障礙表現(xiàn)。表明腦缺血再灌注損傷大鼠模型復(fù)制成功。與模型組比較，眼針穴區(qū)組和體針組大鼠神經(jīng)功能缺損癥狀減輕（P＜0.01），但兩組之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義；眼針穴區(qū)外組評分接近模型組，與眼針穴區(qū)組、體針組差異顯著（P＜0.01，見表1）。

表1 缺血再灌注損傷24 h后各組大鼠腦神經(jīng)缺損評分Tab. 1 Comparison of the scores of neurologic impairments 24 h after cerebral ischemia reperfusion injury in rats of different groups

2.2 腦缺血再灌注損傷24 h后各組大鼠血清TNF-α含量的變化 ELISA方法檢測大鼠血清TNF-α含量，模型組大鼠血清中TNF-α含量明顯高于正常組和假手術(shù)組（P＜0.01），而穴區(qū)組、體針組和穴區(qū)外組TNF-α含量均較模型組明顯下降，但以穴區(qū)組、體針組下降更明顯（P＜0.01，見表2）。

表2 腦缺血再灌注損傷24 h后各組大鼠血清TNF-α含量的變化（pg/mL）Tab. 2 Expression of TNF-α in the serum in rats of different groups 24 h after cerebral ischemia reperfusion(pg/mL)

2.3 腦缺血再灌注損傷24 h后各組大鼠腦組織TNF-α蛋白的表達(dá) 采用蛋白質(zhì)印記方法檢測大鼠腦組織TNF-α蛋白，以β-actin為內(nèi)參，模型組大鼠腦組織TNF-α蛋白表達(dá)明顯高于正常組和假手術(shù)組（P＜0.01）。與模型組比較，眼針穴區(qū)組、體針組和眼針穴區(qū)外組大鼠腦組織TNF-α蛋白表達(dá)均下調(diào)（P＜0.01），但眼針穴區(qū)組和體針組與眼針穴區(qū)外組相比下調(diào)更加顯著（P＜0.01），而眼針穴區(qū)組和體針組之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（見表3）。

表3 腦缺血再灌注損傷24 h后各組大鼠腦組織TNF-α蛋白的表達(dá)Table 2 Expression of TNF-α protein in the brain tissue in rats of different groups 24 h after cerebral ischemia reperfusion

2.4 各組大鼠缺血再灌注損傷24 h后腦組織TNF-α mRNA的表達(dá) 腦組織TNF-αmRNA表達(dá)的結(jié)果見表4，本實驗選用β-actin作為內(nèi)參，β-actin基因擴(kuò)增產(chǎn)物為132 bp，TNF-α基因擴(kuò)增產(chǎn)物大小為145 bp。

表4 腦缺血再灌注24 h后各組大鼠腦組織TNF-α mRNA的表達(dá)Table 4 Expression of TNF-α mRNA levels in the brain tissue in rats of different groups 24 h after cerebral ischemia reperfusion

大鼠腦組織中TNF-αmRNA的表達(dá)結(jié)果，模型組較正常組和假手術(shù)組顯著增加（P＜0.01）。與模型組相比，眼針穴區(qū)組和體針組大鼠腦組織TNF-α mRNA表達(dá)均顯著降低（P＜0.01），但眼針穴區(qū)組與體針組之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。而眼針穴區(qū)外組大鼠腦組織TNF-α蛋白表達(dá)也較模型組顯著降低（P＜0.01，見圖2)，但其TNF-αmRNA表達(dá)仍顯著高于眼針穴區(qū)組和體針組（P＜0.01）。

圖2 各組大鼠腦缺血再灌注損傷24 h后腦組織TNF-α蛋白的表達(dá)1.正常組；2.假手術(shù)組；3.模型組；4.眼針穴區(qū)組；5.體針組；6.眼針穴區(qū)外組Fig. 2 Comparison of the expression of TNF-α protein in the brain tissue in rats of different groups 24 h after cerebral ischemia reperfusion1.control group；2.sham operation group；3.model group；4.eye-acupuncture in point area group； 5.eye-acupuncture outside point area group； 6. body acupuncture group

3 討論

腦缺血再灌注后引起的腦組織損傷是急性腦缺血致死的主要原因之一，因而早期進(jìn)行神經(jīng)保護(hù)性治療大大改善了臨床缺血性腦血管病的不良預(yù)后。

TNF-α是一種參與機(jī)體免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)的多肽細(xì)胞因子，其具有多種生物活性。腦缺血后，腦組織TNF-α表達(dá)增加。TNF-α可由循環(huán)性巨噬細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、缺血腦組織的神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞及小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生。在腦缺血再灌注后的炎癥反應(yīng)中TNF-α可以激活細(xì)胞因子在炎癥的產(chǎn)生及發(fā)展過程中發(fā)揮級聯(lián)放大反應(yīng)作用。并通過激活NF-κB降解微血管基底膜；還可以趨化炎癥細(xì)胞，進(jìn)而促進(jìn)活化的炎癥細(xì)胞釋放氧自由基，加重血腦屏障受損，誘發(fā)腦細(xì)胞水腫[5-6]。TNF-α高表達(dá)具有加速神經(jīng)細(xì)胞的死亡的神經(jīng)毒性[7-8]。因此，在腦缺血再灌注急性損傷后，TNF-α的表達(dá)受抑可以減輕腦細(xì)胞和腦血管的損傷[9-12]。

缺血性腦血管疾病屬于中醫(yī)學(xué)中風(fēng)的范疇。針灸治療中風(fēng)療效顯著。眼針療法是由我院名老中醫(yī)彭靜山先生首先創(chuàng)立。其方法為在眼眶周圍針刺用來治療全身疾病的一種微針療法，是一種特殊針灸施術(shù)針法，經(jīng)過長期臨床實踐，結(jié)合眼與臟腑、經(jīng)絡(luò)的關(guān)系療效顯著。中醫(yī)理論中眼與腦通過經(jīng)絡(luò)密切相關(guān)。《證治準(zhǔn)繩》記載“目形類丸，內(nèi)有大絡(luò)六，謂心、肺、脾、肝、腎，命門各主其一；中絡(luò)八，謂膽、胃，大小腸，三焦、膀胱各主其一；外有旁支細(xì)絡(luò)莫知其數(shù)，皆懸貫于腦?！盵13-15]《靈樞·大惑論》曰：“五臟六腑之精氣，皆上注于目，而為之晴。精之窠為眼，其窠氣之精為白眼，肌肉之精為約束。裹擷筋骨血?dú)庵c脈并為系，上屬于腦，后出于項中，故邪入于項，因逢其身之虛，其入深，則隨目系以入腦?！闭f明眼與腦生理上相互協(xié)調(diào)，也是病邪傳變的途徑。

中醫(yī)學(xué)肝腎陰虛為中風(fēng)病的基本病機(jī)之一，氣血運(yùn)行不暢，淤血滯于腦部絡(luò)脈，引起肢體偏癱。偏癱的上肢和下肢分別歸屬上焦和下焦不同區(qū)域。取眼穴肝區(qū)、腎區(qū)針刺可以滋補(bǔ)肝腎；針刺上焦區(qū)、下焦區(qū)可以活血通絡(luò)。本研究結(jié)果顯示：眼針穴區(qū)組和體針組大鼠在CIRI 24 h后的神經(jīng)缺損評分均較模型組明顯降低，表明眼針和體針均可改善CIRI動物的一般狀態(tài)。而眼針穴區(qū)外組大鼠的神經(jīng)缺損評分與模型組接近，表明針刺眼針穴區(qū)外無法改善CIRI動物的神經(jīng)損傷，只有針刺眼針穴區(qū)才可發(fā)揮治療作用。TNF-α的檢測結(jié)果表明：眼針穴區(qū)組和體針組大鼠伴隨著神經(jīng)缺損評分的下降，大鼠血液和腦組織的TNF-α表達(dá)也明顯地同步下調(diào)，表明眼針和體針均通過降低TNF-α表達(dá)以減輕對腦組織的損傷作用，兩種針刺療法可能通過相同的途徑治療CIRI。與神經(jīng)缺損評分的結(jié)果一致，針刺眼針穴區(qū)外的大鼠血液和腦組織的TNF-α的含量并有所下調(diào)，但針刺眼針非穴區(qū)對TNF-α表達(dá)影響遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于針刺眼針穴區(qū)和體針。本實驗結(jié)果提示，眼針與體針的療效相近，但眼針療法因其取穴少，安全方便，易于掌握而具有更大的臨床應(yīng)用空間。

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The study of differences between eye acupuncture therapy and body acupuncture therapy on tumor necrosis factor-α expression in rats with acute cerebral ischemia reperfusion

JING Huan1, YU Dan1, GAO Yuan1, WANG Zhe1, WANG Ying1, PAN Qian1, GUAN Hong-quan2△
(1. Department of Pathology, College of Basic Medical Sciences of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Shenyang, 110847, China; 2. Department of Immunology and Pathogenic Biology, College of Basic Medical Sciences of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Liaoning province, Shenyang 110847, China)

ObjectiveTo observe the effects of eye acupuncture and body acupuncture on tumor necrosis factor-α (TNF-α) expression in the cerebral cortex of rats after ischemia-reperfusion injury,in order to investigate the differences in therapeutic function between eye acupuncture and body acupuncture against acute cerebral ischemia-reperfusion injury。Method48 Rats established by suture method were randomly divided into control group,sham operation group,model group,eye-acupuncture in point area group,eye-acupuncture outside point area group and body acupuncture group. After reperfusion 24 h,the neurophysical behaviours were accessed by ZeaLonga neurophysical impairment marks; the levels of plasma TNF-α were determined by ELISA method; the expression of ischemic cerebral cortex TNF-α mRNA was measured by RT-PCR method; the expression of ischemic cerebral cortex TNF-α protein was detected by western blot。ResultsAfter reperfusion 24 h,compared with control group,neurologic impairment marks of eye-acupuncture therapy in point area group and body acupuncture group both decreased obviously (P＜0.01),however there were no signi fi cant differences between the eye-acupuncture in point area group and body acupuncture group ; the levels of plasma TNF-α in rat cerebral cortex after the eye acupuncture therapy and body acupuncture therapy were obviously decreased (P＜0.01),however there were no signi fi cant differences between the eye-acupuncture in point area group and body acupuncture group; the expressions of TNF-α mRNA and protein in rat cerebral cortex after the eye acupuncture therapy and body acupuncture therapy were also obviously down-regulated (P＜0.01),however there were no signi fi cant differences between the eye-acupuncture in point area group and body acupuncture group.Conclusion The eye and body acupuncture therapy show the same effects on treating cerebral ischemia reperfusion. The mechanisms of these two therapies may be related to up regulatingTNF-α expression in rat cerebral cortex with ischemia-reperfusion injury.

acute ischemia-reperfusion injury; tumor necrosis factor-α; eye acupuncture therapy;body acupuncture therapy

R 245.329

A

1005-1678(2014)01-0022-04

國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃項目(2007 CB 512702)；遼寧省博士啟動基金項目(20131073)

井歡，女，博士，副教授，研究方向：中藥免疫調(diào)節(jié)機(jī)制研究，E-mail：huanj 99@163.com；關(guān)洪全，通信作者，男，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：中醫(yī)藥對免疫的調(diào)控，E-mail：hongquanguan@sina.com。