HPLC法測定通經(jīng)活絡(luò)噴霧劑中丹參酮ⅡA的含量

何廣俊 李詩慧 王利勝 盧 映 李 周

（1 廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006；2 廣東省中醫(yī)院藥學(xué)部，廣東 廣州 510120）

通經(jīng)活絡(luò)噴霧劑處方由丹參、蘆薈、黃連、黃芪、貓爪草等九味中藥組成，具有活血止痛，舒經(jīng)活絡(luò)，清熱解毒等功效，主要用于頸肩肌肉酸痛等癥。通經(jīng)活絡(luò)噴霧劑處方中，丹參為君藥，丹參酮ⅡA（TanⅡA）是丹參的主要脂溶性有效成分，具有明顯的抗炎作用，對(duì)急性、亞急性關(guān)節(jié)腫有抑制作用[1]。為了控制通經(jīng)活絡(luò)噴霧劑質(zhì)量，建立相應(yīng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，本試驗(yàn)參照2010版中國藥典[2]，同時(shí)結(jié)合通經(jīng)活絡(luò)噴霧劑本身的特點(diǎn)建立了高效液相色譜法，用于測定君藥丹參中丹參酮ⅡA的含量。

1 材 料

KQ5200DE型數(shù)控超聲清洗器（江蘇省昆山市超聲儀器有限公司）；Waters高效液相色譜儀（美國Waters 公司，515泵，2487紫外檢測器）；N3000色譜工作站（浙江大學(xué)）；DLB200電子天平（日本島津）；丹參酮ⅡA對(duì)照品（中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)：0756-9908）；通經(jīng)活絡(luò)噴霧劑（自制，批號(hào)：121011、121012、121013）；陰性樣品（自制）；色譜純乙腈（迪馬公司）；水為純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件：色譜柱：Diamonsil C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-水（75∶25）；檢測波長為270 nm；流速：1 mL/min；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量20 μL；出峰時(shí)間20.69 min；理論板數(shù)按丹參酮ⅡA峰計(jì)算不低于3000。色譜圖見圖1。

2.2 對(duì)照品儲(chǔ)備液的制備：精密稱取丹參酮ⅡA對(duì)照品1.2 mg，置100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為12 μg/mL的儲(chǔ)備液。

2.3 供試品與陰性樣品溶液制備[3]：精密量取本品2 mL，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇20 mL，稱定重量，超聲處理30 min，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，取上清液，用0.45 μm的微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液；陰性溶液的制備是按處方中藥味的比例，自配不含丹參的群藥，按通經(jīng)活絡(luò)噴霧劑的制備工藝制成空白樣品，其余操作與供試品的制備方法相同。

圖1 通經(jīng)活絡(luò)噴霧劑的HPLC圖

2.4 線性關(guān)系考察：取2.2項(xiàng)下丹參酮ⅡA儲(chǔ)備液0.1、0.2、0.4、1.0、5.0 mL分別放入10 mL容量瓶中，定容并搖勻，制成濃度為0.12、0.24、0.48、1.2、6 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，精密吸取上述系列標(biāo)準(zhǔn)溶液20 μL，按照2.1項(xiàng)下色譜條件，依次進(jìn)樣，每個(gè)樣品進(jìn)樣3次，以平均峰面積（Y）對(duì)濃度（X）進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=102959X-4680，r=0.9997。結(jié)果表明丹參酮ⅡA在0.12～6 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 精密度試驗(yàn)：取1.2 μg/mL的對(duì)照品溶液20 μL，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次，測得藁本內(nèi)酯峰面積并計(jì)算其RSD值。結(jié)果RSD為1.23%，表明儀器的精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一批樣品（批號(hào)：121011），照前述方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件分別在0、2、4、8、12 h測定溶液中藁本內(nèi)酯的峰面積，測得的峰面積并計(jì)算其RSD值。結(jié)果RSD值為2.32%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.7 回收率試驗(yàn)：取通經(jīng)活絡(luò)噴霧劑樣品（批號(hào)121011）6份，精密量取1 mL，精密稱定，依次分別每組精密丹參酮ⅡA對(duì)照品溶液（6 μg/mL×355 μL），依法制成供試品溶液，測定，計(jì)算回收率，平均回收率為99.94%，RSD為2.5%。由此可以得知該方法的回收率良好，適合含量測定的要求。

2.8 樣品含量測定：按照2.3項(xiàng)下制備供試品溶液和2.1項(xiàng)下色譜條件測定3批樣品，樣品的含量測定結(jié)果為：批號(hào)分別為121011、121012、121013，測得的丹參酮ⅡA含量分別為2.134、2.156、2.273 μg/mL，RSD含量分別為0.98%、0.87%、0.75%。由此可見，3批通經(jīng)活絡(luò)噴霧劑成品中丹參酮ⅡA的含量相差較小，為了使制定的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)具有更好的適用性，因此規(guī)定通經(jīng)活絡(luò)噴霧劑中每1 mL含丹參含量以丹參酮ⅡA（C19H18O3）的總量計(jì)，不得少于0.15 μg。

3 討 論

2010版中國藥典及相關(guān)文獻(xiàn)[4]中用HPLC法丹參酮ⅡA測定時(shí)，流動(dòng)相為甲醇：水（75∶25），但是本試驗(yàn)用此流動(dòng)相對(duì)丹參酮ⅡA進(jìn)行測定時(shí)，丹參酮ⅡA峰型不是非常對(duì)稱，因此本試驗(yàn)將流動(dòng)相換成乙腈∶水（75∶25）進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)丹參酮ⅡA分離效果好，峰型對(duì)稱，沒有拖尾現(xiàn)象，因此最后選擇的流動(dòng)相為乙腈∶水（75∶25）。

在供試品的制備時(shí)，嘗試過將通經(jīng)活絡(luò)噴霧劑直接過微孔濾膜，HPLC法測定，但是發(fā)現(xiàn)雖然用微孔濾膜過濾，供試品還是會(huì)有些堵塞預(yù)柱，可能是痛經(jīng)活絡(luò)噴霧劑是由中藥復(fù)方提取制成，仍然存在一些大分子物質(zhì)，因此本試驗(yàn)參考相關(guān)文獻(xiàn)[4]將樣品用甲醇處理以除去一些大分子物質(zhì)，結(jié)果所得供試品溶液進(jìn)行HPLC法進(jìn)行測定時(shí)，柱壓穩(wěn)定，不再堵塞色譜柱。

[1]吳杲,何招兵,吳漢斌,等.丹參酮的藥理作用的研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志,2005,14(10)：1382-1385.

[2]國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典一部[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社,2010：70-71.

[3]王希東,郝少君,李文俊,等.HPLC法測定益復(fù)康口服液中阿魏酸的含量[J].河南中醫(yī),2014,34(1)：154-155.

[4]吳俊洪,羅惠都,何麗冰,等.丹參酮Ⅱ納米囊的制備及其性能評(píng)價(jià)[J].中藥新藥與臨床藥理,2013,24(1)：101-103.