桑葉清熱解毒顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

何振洋+鐘婷+許士杰+和東亮+趙珊珊+胡冬華

摘要：對桑葉清熱解毒顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進行了研究，采用薄層色譜法對桑葉清熱解毒顆粒進行定性鑒別，采用紫外可見分光光度法對桑葉清熱解毒顆粒中總黃酮進行含量測定。結(jié)果表明：桑葉總黃酮線性范圍是8～48mg/L，平均回收率是98.57%，RSD是0.52%，該方法可行，重現(xiàn)性比較好，能有效地控制桑葉清熱解毒顆粒的質(zhì)量。

關(guān)鍵詞：桑葉清熱解毒顆粒;桑葉總黃酮;質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

中圖分類號：R917

文獻標(biāo)識碼：A文章編號：1674-9944（2014）12-0228-04

1引言

桑葉，?？浦参锷涞娜~，全國大部分地區(qū)均有生產(chǎn)，不喜光，耐寒，耐旱，不喜水濕。英文名稱Mulberry。桑葉完整葉片呈寬卵形，是蠶的主要食物，長約15cm，寬約10cm，葉柄長約4cm，葉片基部呈現(xiàn)心臟形，頂端微尖，邊緣有鋸齒，握之扎手。氣淡，味微苦澀。藥用一般認為霜后采者質(zhì)佳。有清熱解毒、抗炎、降血糖血脂等功效?！度杖A子本草》中記載利五臟，通關(guān)節(jié)，下氣，煎服，除風(fēng)痛出汗，并補損淤血，并蒸后署，蛇蟲蜈蚣咬，鹽捋敷上。

桑葉中主要含有黃酮類化合物、生物堿類、植物甾醇、γ-氨基丁酸和桑葉多糖等，其中黃酮類化合物是植物界中莖葉含量最多的一類植物[9，12]。桑葉具有很高的藥用價值：①清熱解毒，疏散風(fēng)熱，用于治療風(fēng)熱感冒以及目赤腫痛;②清肝明目，用于肝火目赤，頭暈眼花;③清肺潤燥，用于肺熱咳嗽。桑葉清熱解毒顆粒是以中藥飲片為原料，通過現(xiàn)代制藥技術(shù)，提取、濃縮、分離、干燥、制粒，包裝精制而成。筆者參見2010版《中國藥典》對桑葉清熱解毒顆粒進行了質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究，現(xiàn)報道如下。

2儀器與試劑

2.1儀器

TU-1810型紫外-可見分光光度計（北京普析通用儀器有限公司）;AL104型電子分析天平（十萬分之一）梅特勒托利多（上海有限公司）。

2.2試劑與試藥

超純水;其他試劑均是分析純。

2.3樣品與對照品

供試樣品：桑葉清熱解毒顆粒（批號：20130104、20130105、20130106、20130107、20130108、20130109、20130110、20130111、20130112、20130113）。

對照品：蘆丁對照品（批號：101180-201301 ，供含量測定用，規(guī)格：25mg，購買于中國藥品生物制品檢定所）;桑葉對照藥材（批號： ZS298145，供含量測定用，規(guī)格：200mg，購買于中國藥品生物制品檢定所）。

3實驗方法與結(jié)果

3.1定性鑒別

3.1.1供試品溶液制備

桑葉清熱解毒顆粒5g，加甲醇25mL，超聲處理15min，過濾后，把濾液蒸干，將殘渣加水10mL使溶解，加正丁醇振搖并提取2次，每次25mL，合并正丁醇液，蒸干后，將殘渣加甲醇1mL使溶解，作為供試品溶液，以備后用。

3.1.2陰性對照溶液的制備

本品制備過程中以赤蘚糖醇作為輔料，故將赤蘚糖醇，按照供試品處理方法作為陰性對照溶液，以備后用。

3.1.3對照品溶液的制備

稱取桑葉對照藥材1g，加甲醇25mL，[6]超聲處理10min，過濾，將濾液蒸干，殘渣加水10mL，使溶解，加正丁醇振搖并提取2次，每次用25mL，最后合并正丁醇液，蒸干，殘渣加甲醇1mL，使之溶解，作為對照品溶液。

3.1.4薄層色譜條件

吸附劑：以硅膠G為吸附劑。

展開劑：正丁醇-冰醋酸-水（4∶1∶5），取上層，作為展開劑。

顯色劑：10%AlCl3乙醇溶液。

檢視方式：在UV365nm下進行檢視[13]。

3.1.5薄層色譜鑒別結(jié)果

以蘆丁為對照品，稱取0.5g，按照桑葉清熱解毒顆粒供試品處理方法處理，作為標(biāo)準(zhǔn)對照溶液。薄層色譜鑒別結(jié)果如圖1。

圖1薄層色譜鑒別結(jié)果

從左向右依次編號為1、2、3、4、5號，1號是陰性對照溶液，2號是蘆丁對照品溶液，3號是桑葉對照藥材溶液，4和5號是桑葉清熱解毒顆粒溶液。

3.2含量測定

3.2.1對照品溶液的制備

取蘆丁對照品，在105℃干燥至恒重，精密稱定2mg，置于10 mL量瓶中，加入一定量甲醇（分析純，4mL）溶解并稀釋至刻度，搖勻后，即得0.2mg/mL。

3.2.2供試品溶液的制備

精密稱取本品1.2g，加入超純水20mL使之溶解，通過聚酰胺柱，用100mL超純水洗脫至濾液無色。最后用100mL乙醇（分析純）分3次洗脫，收集洗脫液，濃縮至干，殘渣加一定量超純水溶解后，轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中，加超純水至100mL刻度線，再取1 mL，置于100 mL容量瓶中，加入超純水定容至100 mL，作為供試品溶液。

3.2.3測定波長的選擇

取蘆丁對照品溶液，甲醇（分析純）作為空白溶液[10，11，15]，置于紫外-可見分光光度計上，在700～400nm可見光波長范圍內(nèi)進行掃描，結(jié)果顯示，在510nm波長處有最大吸收，所以選定檢測波長為510nm。

3.2.4含量測定

取10批桑葉清熱解毒顆粒樣品，按照上述方法制備成供試品溶液，每批制備2份，分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液，各1ml，參照標(biāo)準(zhǔn)曲線項下方法進行顯色，以紫外-可見分光光度法，在510nm處測定吸光度，并用吸光度來計算10批樣品中桑葉總黃酮的含量，實驗結(jié)果見表1。

3.3方法學(xué)考察

3.3.1線性關(guān)系考察endprint

精密吸取0.2mg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液0.4、0.8、1.2、1.6、2.0和2.4 mL，分別置于10 mL的容量瓶中，分別加一定量超純水至2.4 mL， 然后加入5%亞硝酸鈉溶液0.4 mL，搖勻后靜置6 min，加入10%硝酸鋁溶液0.4 mL， 搖勻， 再靜置6 min， 然后加入4.3%氫氧化鈉溶液4.0 mL，最后加入超純水定容至刻度線，充分搖勻，靜置15 min后，得8、16、24、32、40和48 mg/L系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取1.0 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液放入比色皿中[5，7，8]，以空白溶液作參比，測定各個濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度。以各標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，以各吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1）。標(biāo)準(zhǔn)曲線表明標(biāo)準(zhǔn)溶液在8～48mg/L的范圍內(nèi)，濃度與吸光度呈線性關(guān)系，并得到回歸方程：Y=0.0144X+0.1012，r2=0.9988。試驗結(jié)果可見表2和圖2。

3.3.2穩(wěn)定性試驗

精密吸取同一供試品溶液和對照品溶液各1mL，依上述方法處理，然后按照紫外-可見分光光度法，在檢測波長510nm處，每隔20min分別依法測定各個吸光度，以蘆丁對照品的吸光度為指標(biāo)，測定供試品的穩(wěn)定性，試驗結(jié)果在表3中記錄。

穩(wěn)定性考察結(jié)果表明：對照品溶液和供試品溶液在2h內(nèi)測定結(jié)果的RSD（%）分別為0.91%、0.68%，供試品溶液經(jīng)顯色后在120min內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.3.3精密度試驗

精密吸取供試品溶液和蘆丁對照品溶液各1mL，按照上述方法處理后，依照紫外-可見分光光度法[16]，在檢測波長510nm處，分別依法測定各自吸光度6次，并且以蘆丁吸光度為指標(biāo)，計算并考察精密度，試驗考察結(jié)果記錄在表4。

精密度考察試驗結(jié)果表明：對照品溶液和供試品溶液經(jīng)過連續(xù)測定，各自結(jié)果的RSD（%）分別為0.12%、1.94%，儀器、方法的精密度良好。

3.3.4重現(xiàn)性試驗

精密稱取同一批樣品6份，按照供試品溶液制備項下方法制備溶液，進行依法顯色，分別獨立進行測定，并且[17]計算樣品中桑葉總黃酮的含量，來考察本法的重現(xiàn)性，試驗結(jié)果記錄在表5。

3.3.5加樣回收率試驗

精密稱取同法測定的已知含量供試品6份，分別精密加入相同對照品一定量，依法分別進行測定，計算各自的回收率，試驗結(jié)果見表6。

加樣回收率試驗結(jié)果表明：平均回收率為98.57%，RSD（%）為0.52%，本法的準(zhǔn)確性較好，并且本方法可行。

4小結(jié)與討論

（1）定性鑒別過程中，對桑葉清熱解毒顆粒的總提取物，采用的是超聲提取法，以甲醇（分析純）為溶劑，對桑葉總黃酮采用正丁醇分次提取，具體方法是取桑葉清熱解毒顆粒5g，加甲醇25mL，超聲處理時間是15min，過濾，濾液蒸干，殘渣用超純水溶解，加正丁醇振搖并提取2次，每次用正丁醇25mL，合并正丁醇提取液，蒸干后，殘渣加甲醇1mL使之溶解，作為供試品溶液。實驗表明，超聲提取法不僅使定性鑒別結(jié)果好，而且實驗效率高。

（2）在含量測定過程中，筆者采用聚酰胺柱層析分離法分離純化得到桑葉總黃酮，超純水洗脫至濾液無色，最后用乙醇（分析純）洗脫，收集合并洗脫液，濃縮干后，殘渣加一定量超純水，溶解并轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中，加超純水至100mL刻度線，再精取其中1 mL置于100 mL容量瓶中，加超純水定容至100 mL，作供試品溶液。方法學(xué)考察實驗證明：這個方法能有效地提取分離出桑葉總黃酮，并且方法的可行性和重現(xiàn)性良好。

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