厭氧及好氧條件下鹽度對海桿菌NY—9生長及反硝化能力的影響

巫亮，李榮鵬，訾小利，胡南

摘要：從鹽城市射陽鹽場分離篩選出的一株中度嗜鹽兼性厭氧海桿菌（Marinobacter）NY-9，該菌在厭氧及好氧條件下均表現(xiàn)出高效的反硝化能力。研究考察了厭氧及好氧條件下鹽度對一株海桿菌NY-9生長及反硝化能力的影響。結(jié)果表明，菌株該菌株的厭氧及好氧生長鹽濃度范圍分別為0%～16%及0%～12%，最適生長鹽度均為8%，該鹽度下培養(yǎng)72 h，OD600 nm值分別達(dá)到了0.38及1.12。在最適鹽度條件下，該菌株均取得了最高的厭氧及好氧反硝化效率，在NO3-起始濃度為100 mg/L的反硝化溶液中培養(yǎng)72 h，其總氮去除率分別達(dá)到了87.6%及62.5%。

關(guān)鍵詞：反硝化;高鹽廢水;海桿菌（Marinobacter）;耐鹽性

中圖分類號(hào)：Q935 ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ? ? ? ?文章編號(hào)：0439-8114（2014）23-5705-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.23.021

生物脫氮是去除廢水中氮素污染的有效技術(shù)之一，生物脫氮工藝因具有處理效果好、處理成本低、操作管理方便等優(yōu)點(diǎn)而得到廣泛的應(yīng)用[1-3]。在石油、化工、海產(chǎn)品養(yǎng)殖等行業(yè)中，排除的含氮廢水大多是高鹽含氮廢水。然而，傳統(tǒng)的生物脫氮工藝難以處理高鹽廢水。高鹽廢水是指總鹽質(zhì)量濃度超過10 g/L的廢水[4]，由于高鹽廢水中含有大量的Cl-、SO42-、Na+、Ca2+等離子，其滲透壓較高，超出了微生物細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜所能承受的壓力范圍，對于微生物的生長有一定的影響，因此高鹽廢水對常規(guī)的生物脫氮工藝中微生物的代謝起著抑制作用[5]。鹽度升高時(shí)，水的滲透壓也隨之升高，非嗜鹽微生物的細(xì)胞會(huì)發(fā)生質(zhì)壁分離，從而抑制微生物的生長繁殖和新陳代謝，甚至導(dǎo)致死亡[6]。因此，利用生物脫氮法處理高濃度的含鹽廢水時(shí)，需要進(jìn)行稀釋使鹽濃度降低，然而這會(huì)造成水資源的浪費(fèi)，成本增大，同時(shí)，難以使出水達(dá)到廢水排放標(biāo)準(zhǔn)的要求，因此影響了海水直接利用的范圍和程度。

海桿菌（Marinobacter）是目前國外報(bào)道較多的一類能夠耐高鹽環(huán)境的反硝化微生物[7-9]，具有潛在的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值，本實(shí)驗(yàn)室也曾在鹽城市的新灘鹽場分離到一株海桿菌NY-4，最適生長的鹽度為8%[10]。本研究報(bào)道了一株從鹽城市射陽鹽場分離篩選出的海桿菌NY-9在不同鹽濃度反硝化能力的變化，以期為實(shí)現(xiàn)海桿菌在高鹽廢水生物脫氮上的工業(yè)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 ?材料與方法

1.1 ?菌株來源及種類

菌株從鹽城市射陽鹽場分離篩選得到，能耐受一定鹽濃度，在厭氧和好氧條件下有較好的反硝化效果，命名為NY-9。結(jié)合NY-9的菌落形態(tài)特征、生理和生化特征，將所測16S rDNA序列通過 BLAST比對，鑒定其為海桿菌。

1.2 ?培養(yǎng)基

高鹽的LB培養(yǎng)基：酵母粉5.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 80.0 g，KCl 5.0 g，MgSO4·7H2O 2.5 g，加去離子水定容至1 L，調(diào)節(jié)pH 7.0～7.5，121 ℃濕熱滅菌20 min。

高鹽反硝化培養(yǎng)基：NaNO3 0.6 g，檸檬酸三鈉 4.1 g，NaCl 80.0 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，KH2PO4 1.5 g，微量元素溶液1 mL，加去離子水定容至1 L，調(diào)pH到7.0～7.5，121 ℃濕熱滅菌20 min。

微量元素溶液：Na2EDTA 63.7 g，ZnSO4 2.2 g，CaCl2 5.5 g， MnCl2·4H2O 5.1 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 5.0 g，Na2MoO4·4H2O 1.1 g，CuSO4·5H2O 1.6 g，CoCl2·6H2O 1.6 g，加去離子水定容至1 L，調(diào)pH 7.0。

1.3 ?不同鹽度下菌株NY-9生長及反硝化能力的測定

1.3.1 ?厭氧條件下不同鹽度下菌株NY-9生長及反硝化能力測定 ?在250 mL的三角瓶中，裝入150 mL的反硝化培養(yǎng)液，培養(yǎng)液的鹽度分別設(shè)為0%、4%、8%、12%和16%，121 ℃滅菌20 min。接入培養(yǎng)至對數(shù)期的細(xì)菌菌液，使其初始的OD600 nm值為0.1，在培養(yǎng)液的上方加入已滅菌的液體石蠟進(jìn)行液封，隔絕空氣，用封口膜封口，30 ℃靜置培養(yǎng)72 h。每組設(shè)3個(gè)平行，每隔12 h取樣2 mL，測定培養(yǎng)液中的OD600 nm、NO3--N、NO2--N和TN的濃度。

1.3.2 ?好氧條件下不同鹽濃度下菌株NY-9生長及反硝化能力測定 ?在500 mL的三角瓶中，裝入200 mL的反硝化培養(yǎng)液，培養(yǎng)液的鹽度分別設(shè)為0%、4%、8%、12%和16%，保持C/N為10，121 ℃滅菌20 min。接入培養(yǎng)至對數(shù)期的細(xì)菌菌液，使其初始的OD600 nm值為0.1，30 ℃、120 r/min搖床振蕩培養(yǎng)72 h。每組設(shè)3個(gè)平行，每隔12 h取樣2 mL，測定培養(yǎng)液中的OD600 nm、NO3--N、NO2--N和TN的濃度。

1.4 ?分析方法

菌體生長測定采用比濁法（OD600 nm），硝酸鹽氮（NO3--N）的測定采用紫外分光光度法（參考標(biāo)準(zhǔn)HZ-HJ-SZ-0138），亞硝酸鹽氮（NO2--N）的測定采用N-（1-萘基）-乙二胺光度法（參考國家標(biāo)準(zhǔn)GB 7493-1987），總氮（TN）的測定采用堿性過硫酸鉀消解-紫外分光光度法（參考國家標(biāo)準(zhǔn)GB 118

94-1989）。

2 ?結(jié)果與分析

2.1厭氧條件下鹽度對菌株NY-9生長及反硝化能力的影響

2.1.1 ?厭氧條件下鹽度對菌株NY-9生長的影響 從圖1可以看出，隨著鹽度的增加，菌體的生長呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢。鹽度為0%時(shí)菌體生長72h的OD600 nm為0.16，鹽度為8%時(shí)菌體的OD600 nm達(dá)到最大，為0.38。鹽度繼續(xù)增加，菌體的OD600 nm迅速降低，鹽度為16%時(shí)菌體的OD600 nm為0.23。

2.1.2 ?厭氧條件下鹽濃度對菌株NY-9反硝化能力的影響 ?由圖2、圖3可知，隨著鹽度的增加菌株NY-9的脫氮率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。菌株NY-9在鹽度為4%、8%和12%時(shí)均有好的脫氮效果，脫氮率分別為43.5%、87.6%和52.6%，整個(gè)過程中沒有NO2--N的積累。因此，菌株NY-9在鹽度為8%的培養(yǎng)基中的脫氮率最高，這一結(jié)果與Yoshie等[11]的試驗(yàn)結(jié)果比較相近。Yoshie等從處理含高鹽廢水的活性污泥中篩選出菌株Halomonas sp.，該菌株在反應(yīng)器中進(jìn)行反硝化作用的最適鹽度為7%。菌株NY-9在不含鹽的環(huán)境中的生長量較小導(dǎo)致該菌株幾乎沒有反硝化作用。在鹽度為12%時(shí)菌株NY-9的菌體生長和反硝化效果均呈下降趨勢，鹽度增加到16%后，菌體的生長和脫氮率都受到明顯的抑制。因?yàn)辂}度過高會(huì)使溶液的滲透壓增高，從而使微生物細(xì)胞脫水導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生原生質(zhì)分離，最終影響菌體的生長和脫氮效果[12]。

2.2 ?好氧條件下鹽度對菌株NY-9生長及反硝化能力的影響

2.2.1 ?好氧條件下鹽度對菌株NY-9生長的影響 從圖4可以看出，好氧條件下，隨著鹽度的增加，菌體生長呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢。鹽度為0%時(shí)菌體生長72 h的OD600 nm為0.19，鹽度為8%時(shí)菌體OD600 nm達(dá)到最大，為1.12。鹽度繼續(xù)增加，菌體的OD600nm迅速降低，鹽度為16%時(shí)菌體幾乎不生長?？芍闚Y-9在鹽度為0%～12%均可生長，最適鹽度為8%。

2.2.2 ?好氧條件下鹽度對菌株NY-9反硝化能力的影響 ?從圖5、圖6可知，菌株NY-9在鹽度為8%時(shí)的總氮去除率最高，可達(dá)到62.5%，鹽度為4%和12%時(shí)的脫氮率分別為52.7%和44.5%，整個(gè)過程中沒有NO2--N的積累。菌株鹽度為16%時(shí)，菌體幾乎不生長，由于菌株的脫氮活性與菌株的生長密切相關(guān)，因此，NY-9在鹽度為16%時(shí)也幾乎沒有反硝化作用。因此，選擇鹽度為8%作為菌株NY-9進(jìn)行好氧反硝化的最適鹽度。

3 ?結(jié)論

本研究從鹽城市射陽鹽場分離出一株中度嗜鹽海桿菌NY-9，在厭氧條件下，菌株NY-9能在鹽度為0%-16%的培養(yǎng)液中生長，在鹽度為4%、8%和12%均有較好的脫氮效果，脫氮率分別為43.5%、87.6%和52.6%。好氧條件下，菌株NY-9能在鹽度為0%-12%的培養(yǎng)液中生長，同樣，在鹽度為8%時(shí)總氮的去除率最高，可達(dá)到62.5%。上述結(jié)果表明海桿菌NY-9在高鹽廢水的厭氧、好氧脫氮處理中具有很好的應(yīng)用前景。

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