基質(zhì)細胞衍生因子-1及Wnt信號對肌成纖維細胞生物特性的影響

邵帥，蔡文瑋，盛凈，陸平

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院老年病科，上海 200011)

·基礎(chǔ)研究·

基質(zhì)細胞衍生因子-1及Wnt信號對肌成纖維細胞生物特性的影響

邵帥，蔡文瑋，盛凈，陸平

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院老年病科，上海 200011)

[摘要]目的探討基質(zhì)細胞衍生因子-1(SDF-1)及Wnt信號通路對誘導(dǎo)生成的肌成纖維細胞的生物學(xué)特性的影響。方法首先體外誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)分化為肌成纖維細胞(MF)，然后改變SDF-1及(或)Wnt信號，通過劃痕實驗觀察MF遷移能力的變化，qRT-PCr檢測Ⅰ型膠原(ColⅠ)、α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)表達的改變。結(jié)果轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β)及高濃度血清等條件的誘導(dǎo)，可使BMSCs分化為MF。阻斷SDF-1或Wnt信號時，會顯著抑制MF的遷移及Col-Ⅰ的分泌，阻斷Wnt信號可明顯抑制BMSCs向MF的分化。結(jié)論SDF-1與Wnt信號參與調(diào)節(jié)MF的遷移及ColⅠ分泌，Wnt信號對BMSCs向MF分化具有重要作用。

[關(guān)鍵詞]肌成纖維細胞；趨化因子CXCL12;Wnt信號通路;膠原Ⅰ型

The influence of sdf-1 and wnt signal pathway on the biological features of myofibroblastShaoShuai,CaiWenwei,ShengJing,LuPing(DepartmentofGeriatrics,ShanghaiNinthPeople'sHospitalAffiliatedtoSchoolofMedicine,ShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai200011,China)Correspondingauthor:CaiWenwei,Email:wodafeidebaobei@126.com

[Abstract]ObjectiveTo explore the impact of SDF-1 and wnt signal pathway on the biological characteristics of Myofibroblast .MethodsFirstly the BMSCs were induced to differentiate into MF,then after the change of SDF-1 and (or) Wnt signal pathway ,the MF's type Ⅰ collagen(ColⅠ) and α-smooth muscle actin(α-SMA) mRNA expression were detected and the migration ability of MF was evaluated by scratch experiments.Results (1) BMSCs could be induced to differentiation into MF in the condition of culture medium including transforming growth factor-β(TGF-β) and high concentration of serum in vitro;(2)When SDF-1/CXCR4 or Wnt signal pathway were blocked ,the migration ability of MF and secretion of ColⅠwas inhibited significantly;(3)The BMSCs differentiation into MF can be inhibited by blocking Wnt signal pathway.ConclusionSDF-1 and Wnt signal pathway play an important role in the regulation of MF migrationand ColⅠ secretion ,and Wnt signal pathway involves in the regulation of BMSCs differentiation into MF.

[Key words] Myofibroblasts;Chemokine CXCL12;Wnt signaling pathway;Collagen type I

肌成纖維細胞(MF)在纖維化的過程中起著核心的作用[1-2]，它既有成纖維細胞的特性，可分泌Ⅰ型膠原(ColⅠ)，又有類似平滑肌細胞功能，可分泌α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)。骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)是體內(nèi)MF的重要來源之一。基質(zhì)細胞衍生因子-1(SDF-1)及Wnt (wingless related proteins )信號通路在組織損傷的纖維化修復(fù)及纖維化病變中起著重要作用[3-4]。通過從SDF-1/CXCR4與wnt信號聯(lián)合研究，將會發(fā)現(xiàn)它們對MF細胞遷移、ColⅠ及α-SMA分泌等細胞特性的影響，為臨床治療、預(yù)防纖維化提供可能的治療靶點。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物3周齡SD大鼠購自上海斯萊克實驗動物有限公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(滬)2004-2005，使用許可證號：SYXK(滬)2007-0007。

1.1.2試劑 L-DMEM、H-DMEM(Hyclone公司，美國)，胎牛血清、胰蛋白酶(Gibco公司，美國)，多克隆抗體α-SMA(abcam公司，美國)，單克隆抗體CD29FITC、CD45FITC、CD90FITC(bdbiosciences公司，美國)，轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)(Peprotech公司，美國)，人重組SDF-1因子(Peprotech公司，美國)，AMD3100(Sigma公司，美國)，ICG-001(Selleck公司，美國)。

1.1.3儀器 倒置相差顯微鏡(Olympus IMT-2，日本)，CO2恒溫孵箱(ThermoForma公司，美國)，熒光定量PCR儀(美國STRATAGNNE)。

1.2方法

1.2.1大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的分離培養(yǎng)及鑒定3周齡SD大鼠頸椎脫臼處死，75%乙醇浸泡30 min。無菌條件下分離股骨和脛骨，去除骨骺端，用L-DMEM反復(fù)沖洗骨髓腔，經(jīng)200目濾網(wǎng)過濾后，1500 r/min 37 ℃離心5 min，使用含10%胎牛血清(FBS)、100 u/mL青霉素、鏈霉素的L-DMEM重懸后，種植于100 mm培養(yǎng)皿中，在37℃、5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)，密度達95%時，用2.5 g/L的胰酶消化，按1∶2傳代。取P3代細胞用于后續(xù)試驗。

對培養(yǎng)的BMSCs采用流式細胞術(shù)鑒定其純度，取P3代BMSCs，0.25%胰酶消化、終止后，細胞計數(shù)，每個指標(biāo)所用細胞量5×105個，分別加入單克隆抗體CD29-FITC、CD45-FITC、CD90-FITC，室溫避光孵育45 min，含2%血清的PBS作為工作液漂洗2次，500 μL工作液重懸細胞，流式細胞儀上機檢測。

1.2.2骨髓間充質(zhì)干細胞向肌成纖維細胞的誘導(dǎo)及細胞免疫熒光鑒定[5]P3代BMSCs經(jīng)胰酶消化、終止后，按每孔5×104個細胞的密度種植于6孔板上，分別給予不同的處理，誘導(dǎo)組加入含20%FBS、5 μg/LTGF-β1因子的H-DMEM，對照組加入常規(guī)含10%FBS的L-DMEM，連續(xù)誘導(dǎo)2周，分別用細胞免疫熒光及qRT-PCR方法鑒定后，使用誘導(dǎo)成功的骨髓源性的肌成纖維細胞(B-MF)進行后續(xù)實驗。

如細胞量過多，可先將其消化，并重新種植于60 mm培養(yǎng)皿中，生長1 d后，PBS沖洗5 min，行2次，4%多聚甲醛固定10 min，PBS沖洗5 min，行3次，triton破膜15 min，抗體封閉液60 min，加入兔抗大鼠α-SMA抗體(1∶100)，4℃過夜，PBS沖洗5 min，行3次，加抗兔熒光二抗，37℃孵育1 h，PBS沖洗，DAPI染核45 s，PBS清洗，熒光倒置顯微鏡觀察、拍照。

1.2.3細胞遷移實驗B-MF以每盤0.5×106個細胞種植在35 mm的培養(yǎng)皿上，達到90%融合度時進行劃痕實驗，用200 μL的無菌槍頭在培養(yǎng)皿中部劃出一條直線，即用顯微鏡拍照(0 h)，然后將細胞培養(yǎng)在含1%FBS的DMEM，分為6組，分別給予如下處理：①空白對照組，加入PBS；②SDF-1因子100 μg/L；③SDF-1 100 μg/L，SDF-1受體CXCR4抑制劑(AMD3100)500 μg/L；④SDF-1 100 μg/L，wnt信號阻滯劑(ICG-001)500 μg/L；⑤SDF-1 100 μg/L，AMD3100 500 μg/L，ICG-001 500 μg/L；⑥AMD3100 500 μg/L，ICG-001 500 μg/L。分別于12 h、24 h、36 h、48 h通過顯微鏡觀察并拍照細胞遷移和劃痕愈合情況。

1.2.4 檢測SDF-1/CXCR4、Wnt信號對BMSCs向B-MF分化的影響將已誘導(dǎo)成功的BMSCs分為6組，除基礎(chǔ)培養(yǎng)條件為20%FBS+5 μgTGF-β+H-DMEM，分組及各組處理同細胞遷移實驗。連續(xù)處理3 d后，收集細胞，行PCR檢測各組ColⅠ及α-SMA的mRNA的表達量。

1.2.5實時定量RT-PCR(qRT-PCR)按照RNA提取試劑盒說明書提取B-MF總RNA，紫外分光檢測所提取RNA的純度和濃度，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書以O(shè)ligo為引物反轉(zhuǎn)錄RNA(2 μg)為cDNA(20 μL體系)。采取定量PCR技術(shù)，檢測各組目的基因mRNA表達的相對量。ColⅠ及α-SMA基因序列如下，Col Ⅰ：F 5′-GGAGAGAGTGCCAACTCCAG-3′，R 5′-GTGCTTTGGAAAATGGTGCT-3′(182bp)；α-SMA：F 5′-CCGAGATCTCACCGACTACC-3′，R 5′-TCCAGAGCGACATAGCACAG-3′(120bp)。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理運用SPSS17.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1BMSCs的培養(yǎng)及鑒定結(jié)果顯示，培養(yǎng)的第3代大鼠BMSCs高表達CD29和CD90陽性率分別達84.3%和 94.2%，為間充質(zhì)干細胞的特征性抗原，而造血干細胞表面抗原CD45陽性率為6.2%，BMSCs純度滿足實驗需要。

2.2BMSCs向B-MF的誘導(dǎo)及鑒定免疫細胞熒光染色結(jié)果顯示：與BMSCs組相比，TGF-β誘導(dǎo)組α-SMA的陽性率達到95%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。qRT-PCR檢測誘導(dǎo)組和BMSCs組的ColⅠ及α-SMA的mRNA表達情況，可見誘導(dǎo)組的ColⅠ及α-SMA 的mRNA表達明顯高于BMSCs組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。表明BMSCs向B-MF誘導(dǎo)成功，可用于后續(xù)實驗(圖1，2)。

2.3SDF-1/CXCR4軸對B-MF細胞遷移的影響劃痕實驗48h后觀察結(jié)果顯示，與對照組相比，SDF-1處理組明顯促進了B-MF的遷移(P<0.05)，而在同時使用AMD3100阻斷SDF-1/CXCR4處理組，細胞遷移作用受到抑制(P<0.05)，當(dāng)同時使用ICG-001阻斷Wnt信號時，B-MF的遷移作用也會受到一定的抑制作用，但ICG-001對細胞遷移的抑制明顯弱于AMD3100(圖3)。

2.4SDF-1/CXCR4及Wnt信號對BMSCs向B-MF細胞分化及膠原分泌的影響qRT-PCR檢測ColⅠmRNA，與對照組相比，加入AMD3100或ICG-001處理組的ColⅠ相對mRNA含量顯著降低(P<0.05)，而在聯(lián)合使用AMD3100及ICG-001處理時，與兩者單獨處理相比，ColⅠmRNA含量有顯著降低(P<0.05)。檢測α-SMA結(jié)果顯示，與對照組相比，加入ICG-001的各組的α-SMA mRNA含量顯著降低(P<0.05)，AMD3100則沒有這樣的效果(圖4)。

3討論

MF在組織纖維化的過程中起著核心的作用，組織中MF有兩大來源，一是間質(zhì)中成纖維細胞活化，繼而成為MF，二是BMSCs誘導(dǎo)分化成MF，并在趨化因子的作用遷移定植于組織，合成并分泌ColⅠ[6]，從而造成相應(yīng)器官組織的纖維化，破壞器官組織結(jié)構(gòu)的同時，嚴(yán)重影響功能的發(fā)揮。因此，若能采取措施抑制BMSCs向MF分化、抑制BMSCs分化的MF(B-MF)進入組織、抑制B-MF分泌ColⅠ，則可能預(yù)防減緩或治療纖維化的進程，改善臟器功能。

SDF-1是重要的趨化因子，在干細胞招募及遷移過程中起著重要作用，SDF-1的生物學(xué)作用主要通過受體CXCR4起作用。研究發(fā)現(xiàn)心肌缺血與心肌梗死時，缺氧可上調(diào)SDF-1表達，促進BMSCs進入缺血區(qū)域，促進新生血管的形成，改善心臟功能[7]；研究還表明，在輻射誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化模型中，SDF-1/CXCR4的表達增高明顯，而在使用CXCR4的抑制劑后，輻射造成的肺部纖維化程度明顯改善[8]；CXCR4也可以介導(dǎo)BMSCs到大鼠腎臟損傷部位，參與修復(fù)[9]。因此，認(rèn)為SDF-1介導(dǎo)了MSCs的纖維化修復(fù)，但其纖維化效果對于組織功能的減退也有影響。

Wnt信號是細胞增殖、分化的強效調(diào)節(jié)因子[10]。有研究表明Wnt信號通路廣泛參與組織纖維化過程，但其具體調(diào)節(jié)機制尚不明確，De Langhe[11]對Wnt信號的抑制分子分泌型卷曲相關(guān)蛋白-1(SFRP1)研究發(fā)現(xiàn)，在體外它可以顯著抑制TGF-β誘導(dǎo)的纖維母細胞ColⅠmRNA的表達，但體內(nèi)情況下，SFRP1對組織的纖維化似乎沒有影響，而Matsuyama[12]研究發(fā)現(xiàn),SFRP1基因敲出的小鼠，腎組織纖維化程度顯著高于野生型小鼠，研究結(jié)果尚存爭議，因此Wnt信號對組織器官的纖維化的影響的具體機制有待進一步深入研究。

在本實驗中，通過聯(lián)合或分別阻斷SDF-1及Wnt信號通路，觀察B-MF遷移能力的改變及ColⅠ、α-SMA分泌量的變化。結(jié)果表明SDF-1可以增強B-MF的遷移能力，這一作用可以被CXCR4抑制劑AMD3100阻斷，Wnt信號的抑制劑ICG-001可以部分抑制B-MF的遷移作用，但抑制效應(yīng)明顯弱于AMD3100的抑制效應(yīng)，AMD3100與ICG-001聯(lián)合使用，并沒有進一步減弱細胞的遷移能力，因此我們推斷Wnt信號對B-MF遷移的調(diào)節(jié)受SDF-1/CXCR4的調(diào)控；對誘導(dǎo)成功的BMSCs細胞，分別給予不同的處理后，檢測ColⅠ的mRNA發(fā)現(xiàn)，ICG-001對B-MF ColⅠ的分泌有明顯的抑制效應(yīng)，而AMD3100也對ColⅠ分泌有部分抑制作用，兩者聯(lián)合使用可以進一步降低ColⅠmRNA水平。因此，我們可以認(rèn)為SDF-1/CXCR4和Wnt信號對MF細胞分泌ColⅠ具有協(xié)同的抑制作用。ICG-001及AMD3100對BMSCs向B-MF分化過程的影響,檢測結(jié)果表明，α-SMA在ICG-001處理的各組降低較為顯著，而AMD3100并沒有這樣的作用，因此推測Wnt信號參與調(diào)節(jié)BMSCs向B-MF的分化。

綜上所述，SDF-1/CXCR4與 Wnt信號共同參與調(diào)節(jié)B-MF的遷移及Col-Ⅰ的分泌，同時Wnt信號廣泛參與BMSCs向MF的分化，兩信號對B-MF生物學(xué)特性的影響存在協(xié)同作用，共同影響B(tài)-MF從而參與組織纖維化，其具體明確的機制尚需進一步深入研究，相信這些研究將為纖維化預(yù)防、治療提供理論支持和可能。

(本文圖1~4見插圖4-4)

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(收稿日期:2015-01-10)

通信作者：蔡文瑋，博士，副主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，Email:wodafeidebaobei@126.com

作者簡介：邵帥，碩士在讀，Email: shaomao8822@163.com

中圖分類號：R38

文獻標(biāo)識碼：A

DOI:10.3969/J.issn.1672-6790.2015.02.021