末端病大鼠跟腱修復(fù)中膠原表達(dá)的研究

張 林，沈勇偉，齊紅梅

末端病的發(fā)病率在運(yùn)動(dòng)員中較高，其多發(fā)在四肢遠(yuǎn)端及關(guān)節(jié)部位，其中又以跟腱末端病患者居多。跟腱末端區(qū)的結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，其病變呈現(xiàn)多樣性，使得眾多學(xué)者對(duì)于末端病的認(rèn)識(shí)不統(tǒng)一，因而末端病的發(fā)病機(jī)制尚無定論。跟腱病變是末端結(jié)構(gòu)的主要病變，而肌腱是乏細(xì)胞和乏血管的組織，代謝慢，愈合也較慢，而且通常是瘢痕愈合，因此損傷的肌腱可能不能恢復(fù)到健康和正常的肌腱功能水平。盡管近年來對(duì)肌腱損傷修復(fù)的研究有了一定的進(jìn)展，但在臨床上尚未找到預(yù)防和治療肌腱損傷的特效方法，為了彌補(bǔ)肌腱低效率的愈合過程，很多研究者嘗試了各種治療策略。由于人們逐漸認(rèn)識(shí)到肌腱具有一定的代謝活動(dòng)和良好的適應(yīng)能力，因此通過對(duì)肌腱損傷機(jī)制的研究，能為肌腱損傷的修復(fù)提供重要的理論依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)以末端病大鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，通過觀察末端病大鼠跟腱修復(fù)過程中膠原I和膠原III基因表達(dá)和蛋白含量的動(dòng)態(tài)變化，探討膠原在末端病大鼠跟腱修復(fù)中的作用及其機(jī)制，為完善末端病的發(fā)病機(jī)制及促進(jìn)肌腱損傷的恢復(fù)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

4周齡健康清潔級(jí)雄性Wistar大鼠56只（由蘇州大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供），均體重為（108±7.8）g，適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后隨機(jī)分組：（1）空白對(duì)照組（N=8）；（2）模型對(duì)照組（N=8）；（3）模型自然愈合組40只，按取材時(shí)間點(diǎn)不同分為1 d組、2 d組、3 d組、7 d組、14 d組，每組8只。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組情況見表1。

Wistar大鼠每籠4只進(jìn)行飼養(yǎng)，自由進(jìn)食與飲水，用國家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動(dòng)物飼料進(jìn)行喂養(yǎng)。保持動(dòng)物房溫度為18～24℃、相對(duì)濕度為45%～55%，充足的自然光照。

表1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組TableⅠ Groups of the Rats for Experiment

1.2 研究方法

1.2.1 造模方法

用電刺激跳躍法造模：造模組的大鼠放在造模裝置里，每15 s通電一次，共持續(xù)20 min，休息10 min，再持續(xù)20 min。每天造模1次，每周6次，持續(xù)5周。通電電壓由小逐步加大，直到大鼠出現(xiàn)有效跳躍為止，一般在50 V左右，個(gè)別情況下達(dá)到80～100 V。

1.2.2 指標(biāo)測(cè)試方法

（1）ELISA法測(cè)定跟腱內(nèi)膠原I和膠原III的含量。

（2）實(shí)時(shí)定量PCR方法測(cè)定跟腱內(nèi)膠原ImRNA和膠原IIImRNA的表達(dá)情況。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)分析

結(jié)果采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（X±SD）表示，所有數(shù)據(jù)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件包處理，采用方差分析，顯著性水準(zhǔn)為0.05。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 大鼠跟腱膠原I測(cè)試結(jié)果

2.1.1 跟腱末端病模型對(duì)照組與正常對(duì)照組比較

模型對(duì)照組與正常對(duì)照組比較，膠原ImRNA的表達(dá)和膠原I蛋白的合成量明顯下降，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性意義（見表2）。

表2 正常對(duì)照組與跟腱末端病模型對(duì)照組膠原I合成量比較(N=8)TableⅡ Comparison between the Quantity of Collagen-I Synthesis of the Control Group and the Group of Achilles Tendon Enthesiopathy Model (N=8 )

2.1.2 跟腱末端病自然愈合組大鼠跟腱膠原ImRNA和膠原I蛋白含量變化

測(cè)試結(jié)果顯示，隨著愈合時(shí)間的延長，跟腱末端病模型自然愈合組的膠原ImRNA的表達(dá)逐漸增加。與造模對(duì)照組比較，自然愈合1 d組、2 d組、3 d組、7 d組都沒有顯著性的差異（P＞0.05）。

膠原I的變化出現(xiàn)了先小幅降低而后增加的過程（見表3）。在自然愈合組，與造模對(duì)照組相比，第1 d、2 d、3 d、7 d膠原Ⅰ呈下降的趨勢(shì)，直到第14 d才出現(xiàn)顯著性增加（P＜0.05），提示在第14 d時(shí)，膠原I參與跟腱修復(fù)能力顯著增強(qiáng)。

表3 膠原I m R N A表達(dá)和膠原I蛋白含量變化TableⅢ Collagen-ImRNA Expression and Protein Content Variation of Collagen-I (N=8 )

2.2 大鼠跟腱膠原III測(cè)試結(jié)果

2.2.1 模型對(duì)照組與正常對(duì)照組大鼠跟腱膠原IIImRNA和膠原III合成量

跟腱末端病模型對(duì)照組與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠跟腱膠原IIImRNA表達(dá)迅速上調(diào)，膠原III的合成量增加，兩者與正常對(duì)照組比較均具顯著性差異（P＜0.05）。測(cè)試結(jié)果如表4。

表4 正常對(duì)照組與造模對(duì)照組膠原IIIm R N A和膠原III合成量比較 (N=8)TableⅣ Comparison between Collagen-IIImRNA and the Quantity of Collagen-III Synthesis of the Control Group and the Model Group(N=8 )

2.2.2 跟腱末端病自然愈合組大鼠跟腱膠原IIImRNA和膠原III蛋白含量變化

由測(cè)試結(jié)果發(fā)現(xiàn)，跟腱末端病自然愈合組大鼠跟腱膠原III變化規(guī)律是：隨著愈合時(shí)間的推移，膠原IIImRNA的表達(dá)和膠原III的合成呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。

跟腱末端病自然愈合組大鼠與造模對(duì)照組大鼠比較，第1 d、2 d、3 d，跟腱膠原IIImRNA表達(dá)和膠原III的含量逐漸增加，差異非常顯著（P＜0.01），此后膠原IIImRNA表達(dá)開始迅速增加，并在第7 d達(dá)到峰值（P＜0.01），之后開始下降，但在第14 d仍高于對(duì)照組（P＜0.05），而膠原III的合成仍顯著增加（P＜0.05），至14 d增加非常明顯（P＜0.01）。測(cè)試結(jié)果如表5。

3 討論

3.1 末端病大鼠跟腱膠原ImR NA和膠原I蛋白含量變化規(guī)律

膠原I是肌腱細(xì)胞外基質(zhì)強(qiáng)度的重要承擔(dān)著，其含量占肌腱干重的60%左右，在正常肌腱的膠原中占95%，另外5%為膠原III及少量的V型。膠原I的結(jié)構(gòu)是由排列緊密的粗膠原原纖維組成，因而具有強(qiáng)度大彈性低的特點(diǎn)，起穩(wěn)定組織的作用。跟腱的功能主要靠膠原來維持，因此測(cè)定膠原I含量的變化能較好地反應(yīng)跟腱的機(jī)能狀態(tài)。

表5 膠原I I I m R N A表達(dá)和膠原I I I含量變化的比較TableⅤ Comparison between Collagen-IIImRNA Expression and Content Variation of Collagen-III (N=8 )

有關(guān)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)肌腱膠原I含量及其基因表達(dá)影響的研究已見報(bào)道。Olesen等[1]通過去除腓腸肌和比目魚肌及部分跟腱后給跖肌牽拉，并測(cè)定加載后1 d、2 d、4 d、8 d和16 d后跖肌腱中前膠原Iα1 mRNA的水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)1 d后前膠原Iα1 mRNA水平顯著降低，在8 d和16 d后其表達(dá)顯著上升，前膠原Iα1 mRNA降低的具體機(jī)制目前還不清楚，可能與其開始載荷時(shí)其降解有關(guān)，其后基因水平的上調(diào)表明在8 d、16 d后膠原I和合成加快，有利于受損肌腱的修復(fù)。李敏[2]的研究表明，一次性跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)后即刻、12 h、72 h時(shí)前膠原I α 1 mRNA水平與對(duì)照組相比無顯著性變化，表明一次性跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)不能在轉(zhuǎn)錄水平上上調(diào)肌腱膠原Ⅰ的表達(dá)，在轉(zhuǎn)錄水平上上調(diào)肌腱膠原I的合成，可能需要較大的強(qiáng)度負(fù)荷和時(shí)間負(fù)荷。但在一次性跑臺(tái)后即刻和12 h時(shí)跟腱中膠原I蛋白含量顯著降低，表明一次性跑臺(tái)后可抑制跟腱膠原的合成，其原因可能是由于不適應(yīng)負(fù)荷作用下暫時(shí)的抑制或清除膠原的能力的增加，也可能是運(yùn)動(dòng)時(shí)肌腱腱周液體的溢出等緣故。因而他們的研究結(jié)果具有相同的觀點(diǎn)：在運(yùn)動(dòng)載荷后12 h內(nèi)膠原I的合成被抑制。本研究中末端病大鼠跟腱內(nèi)的膠原ImRNA表達(dá)和膠原I含量明顯下降，且具有顯著性差異（P＜0.05），表明末端病大鼠跟腱膠原Ⅰ在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)和蛋白水平的合成量都下降，這正說明膠原代謝被抑制，分析其原因，筆者認(rèn)為在造模過程中過載的負(fù)荷誘導(dǎo)腱細(xì)胞的凋亡以及膠原合成和分泌被抑制所致，也可能是受損的跟腱破裂造成膠原流失的原因。因此本研究的結(jié)果表明在造模后膠原I水平的下降與上述的報(bào)道是一致的。

從末端病大鼠跟腱中膠原I蛋白和膠原ImRNA的表達(dá)動(dòng)態(tài)變化來看，隨著時(shí)間的推移，跟腱中的膠原ImRNA的表達(dá)逐漸增加，但膠原I蛋白的合成第1 d、2 d、3 d出現(xiàn)了小幅下降，隨后開始逐漸增加，說明受損跟腱恢復(fù)早期膠原I合成代謝被抑制，這和李敏[2]的研究結(jié)果相一致，但是在隨后的恢復(fù)過程中這種抑制作用逐漸減弱，表現(xiàn)出隨時(shí)間增加而逐步增長的規(guī)律，也預(yù)示著被受損的跟腱逐漸被修復(fù)的過程。造成這種變化的原因，筆者認(rèn)為，其一是在恢復(fù)早期，受損的跟腱中膠原合成代謝被不適宜的運(yùn)動(dòng)載荷的抑制未被解除。二是膠原I合成代謝被其它因素的制約，包括：（1）可能是膠原III合成的快速增加代償了膠原Ⅰ的下降；（2）酶活性的改變，如MMP-1 mRNA的表達(dá)和MMP-1蛋白含量的明顯增加導(dǎo)致膠原降解；（3）細(xì)胞因子的激活，如TGF-β 1具有明顯的促進(jìn)膠原合成的作用；（4）某些代謝產(chǎn)物增多等。三是膠原從受損的肌腱中溢出等。這些原因造成了膠原的含量出現(xiàn)暫時(shí)下降的現(xiàn)象，但隨著載荷取消后恢復(fù)時(shí)間的延長，跟腱中血液供應(yīng)逐步得到恢復(fù)，腱細(xì)胞又被激活，合成和分泌到基質(zhì)中的膠原蛋白和蛋白多糖也增多，從而穩(wěn)固了肌腱組織的結(jié)構(gòu)，有利于肌腱的重塑。

3.2 末端病大鼠跟腱膠原IIImR NA和膠原III蛋白含量變化規(guī)律

與膠原I相比，肌腱中膠原III的含量很少，不足10%，其形成的纖維與膠原I明顯不同，纖維較細(xì)但彈性較高。肌腱中膠原III主要分布在腱內(nèi)膜和腱鞘，也分布在衰老的肌腱或承受高應(yīng)力肌腱的附著處。Eriksen等的研究表明，當(dāng)肌腱受到損傷進(jìn)行修復(fù)時(shí)，會(huì)出現(xiàn)膠原Ⅲ的暫時(shí)表達(dá)［3］，從而促進(jìn)膠原III的合成，膠原III合成的增加是組織代謝活躍的標(biāo)志［4］，因而可用膠原III代謝水平的變化來評(píng)價(jià)肌腱的功能狀態(tài)。

有關(guān)末端病大鼠跟腱對(duì)膠原III表達(dá)的研究至今未見報(bào)道。但運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)跟腱膠原III影響的研究已有相關(guān)的報(bào)道。李敏［2］在研究一次性跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠跟腱影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)后24 h膠原III含量開始增加，至72 h顯著增加，膠原III型α 1鏈在轉(zhuǎn)錄后水平也顯著增加，而膠原III合成的增加標(biāo)志著組織代謝的活躍，提示一次性跑臺(tái)后跟腱組織內(nèi)代謝活躍，它可刺激跟腱在轉(zhuǎn)錄前或后水平上調(diào)膠原III的合成和裝配。任洪峰［5］對(duì)大鼠進(jìn)行為期8周的中等強(qiáng)度的強(qiáng)化訓(xùn)練，并用免疫組化方法測(cè)定其訓(xùn)練1周、2周后跟腱膠原III的表達(dá)，結(jié)果顯示在第1周膠原III含量升高。這表明運(yùn)動(dòng)刺激促進(jìn)膠原III的表達(dá)呈現(xiàn)訓(xùn)練早期增強(qiáng)，訓(xùn)練早期膠原III的含量增加提示應(yīng)力作用下膠原代謝活動(dòng)加速，促進(jìn)組織結(jié)構(gòu)發(fā)生改建。Olesen等［1］通過去除腓腸肌和比目魚肌及部分跟腱后給跖肌加載，研究加載后2 d、4 d、8 d和16 d后跖肌腱中前膠原IIIα2 mRNA的水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)1 d后其表達(dá)顯著增加，同樣表明膠原Ⅲ在運(yùn)動(dòng)載荷后早期表達(dá)增加。艾進(jìn)偉［6］的研究發(fā)現(xiàn)中等強(qiáng)度的負(fù)荷沒有引起膠原III含量的顯著性變化，但強(qiáng)化訓(xùn)練組豚鼠跟腱膠原III含量顯著增加，與前述不一致，提示運(yùn)動(dòng)后引起肌腱組織中膠原III與應(yīng)激的強(qiáng)度有關(guān)。以上研究的結(jié)果雖然有所不同，但大多數(shù)的研究都支持了運(yùn)動(dòng)載荷導(dǎo)致跟腱中膠原III在早期表達(dá)增加的觀點(diǎn)。本研究結(jié)果顯示，末端病大鼠造模后跟腱中無論是膠原IIImRNA在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)還是膠原Ⅲ在蛋白水平的合成都表現(xiàn)出明顯增加，且具有顯著性差異（P＜0.05），提示在受損跟腱中膠原III的表達(dá)增加，與上述的運(yùn)動(dòng)引起早期階段膠原III含量增加的結(jié)果相一致。作者認(rèn)為，末端病大鼠跟腱膠原III表達(dá)的提高與運(yùn)動(dòng)后早期引起膠原III表達(dá)增加具有相同的原因，可能是運(yùn)動(dòng)應(yīng)激增加了跟腱內(nèi)的損傷速率，限制了膠原原纖維自我裝配的末端肽的切除，使原膠原III快速形成分子內(nèi)、分子間交聯(lián)，從而快速合成膠原原纖維，加上分子間雙硫鍵的存在，對(duì)肌腱內(nèi)組織起著堅(jiān)實(shí)的固定作用，因此重塑性膠原III合成的增加預(yù)示著組織修復(fù)的增強(qiáng)。

末端病大鼠跟腱中膠原III變化規(guī)律呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。造模后大鼠跟腱膠原IIImRNA表達(dá)迅速上調(diào)，膠原III的合成量也增加，兩者與對(duì)照組相比都具有顯著性的差異（P＜0.05），第1 d、2 d、3 d，膠原IIImRNA表達(dá)和膠原III的含量逐漸增加，與對(duì)照組相比，差異非常顯著（P＜0.01），此后膠原IIImRNA表達(dá)開始迅速增加，并在第7 d達(dá)到峰值（P＜0.01），之后開始下降，但在第14 d仍高于對(duì)照組（P＜0.05），而膠原III的合成仍顯著增加（P＜0.05），至14 d增加還是明顯（P＜0.05）。這種變化也說明膠原Ⅲ在跟腱修復(fù)的早期階段起著十分重要的作用，與上述相關(guān)研究的結(jié)果和觀點(diǎn)相一致。

4 結(jié)論

4.1 在末端病大鼠跟腱早期修復(fù)過程中膠原I的表達(dá)被抑制。

4.2 在末端病大鼠跟腱修復(fù)的早期階段膠原III起著十分重要的作用，這種作用在修復(fù)的前7 d效果非常明顯。

4.3 末端病大鼠跟腱修復(fù)初期膠原III能代償被抑制合成的膠原I，積極參與肌腱的再生，直至膠原I代謝被激活后，兩者共同促進(jìn)肌腱的修復(fù)。

[1]Olesen JL,Heinemeier KM,Haddad F, et al. (2006). Expression of insulin-like growth factor I,insulin-like growth factor binding proteins,and collagen mRNA in mechanically loaded plantaris tendon.[J ]. Appl Physiol,101(1):183-188.

[2]李敏.跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠跟腱的及其機(jī)制研究[D].中國學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫.2008

[3]Eriksen HA, Plajala A, Leppilahti J, et al. (2002). Increased content of type Ⅲ Collagen at the rupture site of human Achilles tendon[J ]. J Orthop Re, 20(6):1352-1357.

[4]艾進(jìn)偉.強(qiáng)化訓(xùn)練隊(duì)跟腱塑形改建影響的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和人群干預(yù)研究[D]. 中國學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫.2005

[5]任洪峰.不同訓(xùn)練方式對(duì)大鼠跟腱改建影響的實(shí)驗(yàn)研究[D].中國學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫.2005

[6]艾進(jìn)偉,黃昌林,呂榮,等. 制動(dòng)對(duì)豚鼠跟腱基質(zhì)的影響[J]. 中國骨與關(guān)節(jié)損傷雜志, 2005，（05）：123-126.