慢性乙肝患者外周血中Th22、Th17細(xì)胞及其細(xì)胞因子濃度水平的變化與意義

戴小波　薛長山　周文英　黃小燕　唐文志　黃凱晨(珠海高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東　珠?！?9000)

慢性乙肝患者外周血中Th22、Th17細(xì)胞及其細(xì)胞因子濃度水平的變化與意義

戴小波1薛長山周文英2黃小燕1唐文志1黃凱晨1
(珠海高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東珠海519000)

〔摘要〕目的探討輔助T淋巴細(xì)胞(Th) 22細(xì)胞、Th17細(xì)胞及其細(xì)胞因子在慢性乙型肝炎患者外周血中的表達(dá)及意義。方法選取2013 年6月至2014年3月在我院就診患者或體檢者共101例，其中慢性乙型肝炎患者25例，乙肝病毒攜帶者21例，非病毒性肝炎35例。另選取同期20例健康體檢者為正常對照組。用流式細(xì)胞術(shù)分別檢測各組外周血中Th22細(xì)胞、Th17細(xì)胞所占比例。用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)分別檢測各組外周血中白細(xì)胞介素(IL) -22、IL-17的血清濃度。結(jié)果與正常對照組比較，慢性乙型肝炎組Th22細(xì)胞及IL-22、IL-17明顯降低(P＜0.05)，但Th17細(xì)胞無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05) ;與乙肝病毒攜帶者比較，慢性乙型肝炎組IL-22、IL-17明顯降低(P＜0.05)，Th17細(xì)胞明顯升高(P＜0.05)，但Th22細(xì)胞無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05) ;與非病毒性肝炎組相比，慢性乙型肝炎組Th22、Th17細(xì)胞及IL-22、IL-17均明顯降低(P＜0.05) ;與正常組比較，乙肝病毒攜帶者Th22、Th17及IL-17均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，但I(xiàn)L-22明顯降低(P＜0.05)。結(jié)論Th22細(xì)胞數(shù)量減少或功能減退，IL-22濃度降低，使慢性乙型肝炎患者肝細(xì)胞失去IL-22的保護(hù)作用，是慢性乙型肝炎發(fā)病的重要因素;而Th17細(xì)胞及IL-17可能未參與慢性乙型肝炎的慢性期炎癥。

〔關(guān)鍵詞〕慢性乙型肝炎; Th22細(xì)胞; Th17細(xì)胞;白細(xì)胞介素22;白細(xì)胞介素17

1廣東省中醫(yī)院珠海醫(yī)院檢驗(yàn)科

2中山大學(xué)第五附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室

第一作者:戴小波(1978-)，男，副主任技師，主要從事感染與免疫方面的研究。

研究認(rèn)為輔助T淋巴細(xì)胞(Th)細(xì)胞分化失衡是介導(dǎo)慢性乙型肝炎病情變化的主要機(jī)制〔1〕，但是失衡的原因還不清楚。Th17、Th22細(xì)胞是最近發(fā)現(xiàn)的新型Th，Th17細(xì)胞及其細(xì)胞因子在免疫炎癥的早期發(fā)揮關(guān)鍵作用，而Th22細(xì)胞數(shù)量及功能的變化與免疫炎癥也關(guān)系密切。本研究擬初步探討Th22、Th17及其細(xì)胞因子在慢性乙型肝炎中的變化及意義。

1　材料與方法

1.1研究對象選取2013年6月至2014年3月在我院就診患者或體檢者共101例，其中慢性乙型肝炎患者25例，年齡55～75〔平均(59.6±4.2)〕歲，其中男14例，女11例;乙肝病毒攜帶者21例，年齡57～76〔平均(61.5±3.9)〕歲，其中男13例，女8例。慢性乙型肝炎及攜帶者的診斷標(biāo)準(zhǔn)參考《慢性乙型肝炎防治指南(2010)》〔2〕及《病毒性肝炎防治方案(2000)》〔3〕，非病毒性原因造成的肝細(xì)胞損傷(非病毒性肝炎) 35例，年齡56 ～74〔平均(60.4±5.9)〕歲，其中男20例，女15例。排除自身免疫性疾病、急性炎癥、其他系統(tǒng)慢性炎癥，6個(gè)月內(nèi)未接受過免疫抑制劑、抗病毒治療者。正常對照組為20例健康體檢者，年齡15～58歲，其中男12例，女8例，排除各種病毒性肝炎、自身免疫性疾病、皮膚病者。肝功等各項(xiàng)生化指標(biāo)正常。各組在年齡、性別等方面均具有可比性。

1.2主要試劑及檢測方法Th22細(xì)胞及Th17細(xì)胞檢測:檢測方法參照參考文獻(xiàn)〔4〕，利用Beckman Coulter XL四色流式細(xì)胞儀檢測Th17細(xì)胞、Th22細(xì)胞占CD4+T淋巴細(xì)胞的比值。試劑來源: CD4(ECD標(biāo)記)熒光標(biāo)記抗體由貝克曼公司提供，CCR4 (Percp/cy5.5標(biāo)記)、CCR6(FITC標(biāo)記)、CCR10(PE標(biāo)記)熒光標(biāo)記抗體由Biolegend公司提供。檢測方法:將相應(yīng)抗體分別加入100 μl EDTA抗凝外周血中，充分混勻，4℃避光反應(yīng)20 min。在全血樣本管中加溶血劑1 ml，混勻避光放置5 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，沉淀用200 μl PBS懸浮，上流式細(xì)胞儀(BECKMAN COULTER XL)檢測。白細(xì)胞介素(IL) -22、IL-17測定:用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)方法檢測，檢測試劑盒由Bio-swamp公司提供。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS16.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、Spearman線性相關(guān)分析。

2　結(jié)果

2.1Th22細(xì)胞及IL-22檢測結(jié)果與正常對照組〔Th22細(xì)胞(2.29±0.014) ％; IL-22(88.3±51.2) pg/ml〕比較，慢性乙型肝炎組Th22細(xì)胞〔(0.95±0.015 ) ％〕及IL-22〔(12.8± 25.7) pg/ml〕明顯降低(t = 3.004，P = 0.004; t = 6.429，P = 0.000) ;與乙肝病毒攜帶者〔IL-2(38.8±28.7) pg/ml，Th22細(xì)胞(1.73±0.009) ％〕比較，慢性乙型肝炎組IL-22明顯降低(t = 3.228，P=0.002)，但Th22細(xì)胞無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t = 2.020，P = 0.053) ;與非病毒性肝炎組〔Th22細(xì)胞(3.11±0.018) ％，IL-22 (168.4±118.9) pg/ml〕比較，慢性乙型肝炎組Th22細(xì)胞及IL-22都明顯降低(t= 4.764，P= 0.000; t= 6.429，P= 0.000) ;與正常對照組比較，乙肝病毒攜帶者Th22細(xì)胞無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t = 1.540，P=0.132)，但I(xiàn)L-22明顯降低(t=3.847，P=0.000)。

2.2Th17細(xì)胞及IL-17檢測結(jié)果與正常對照組〔Th17 (1.09±0.012) ％，IL-17(25.4±51.6) pg/ml〕比較，慢性乙型肝炎組IL-17〔(2.4±6.8) pg/ml〕明顯降低(t= 2.216，P= 0.032)，但Th17細(xì)胞〔(1.87±0.015) ％〕無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t = 1.862，P = 0.069) ;與乙肝病毒攜帶者〔Th17細(xì)胞(1.02±0.007) ％，IL-17(23.0±39.7) pg/ml〕比較，慢性乙型肝炎組Th17細(xì)胞明顯升高(t=2.301，P= 0.026)，而IL-17較攜帶者明顯降低(t = 2.552，P=0.014) ;與非病毒性肝炎組〔Th17細(xì)胞(3.55±0.023) ％，IL-17(232.7±365.2) pg/ml〕比較，慢性乙型肝炎組Th17細(xì)胞及IL-17均明顯降低(t=3.153，P= 0.003; t= 3.144，P= 0.003) ;與正常對照組比較，乙肝病毒攜帶者Th17細(xì)胞及IL-17均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=0.206，P=0.837; t=0.173，P=0.864)。

2.3Th22、IL-22、Th17、IL-17與ALT的相關(guān)性非病毒性肝炎組Th22、IL-22、Th17、IL-17與ALT的相關(guān)系數(shù)分別為－0.11，－0.04，0.02，0.14;慢性乙型肝炎組Th22細(xì)胞比值與ALT呈正相關(guān)(r = 0.65，P＜0.05)。Th17、IL-22與ALT的r值分別為0.23，－0.22，－0.29。

3　討論

Th22細(xì)胞是最近在研究銀屑病等皮膚炎癥過程中發(fā)現(xiàn)的不同于Th1、Th2細(xì)胞的一類新型Th細(xì)胞〔4〕，細(xì)胞表面表達(dá)CCR6+、CCR4+、CCR10+〔5〕。Th22功能的喪失或數(shù)量減少都可以導(dǎo)致慢性炎癥疾病惡化，另一方面，Th22細(xì)胞數(shù)量過多或功能過度活躍也可導(dǎo)致免疫炎癥加重〔6〕。Th22細(xì)胞主要通過分泌IL-22發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。體外實(shí)驗(yàn)表明，IL-22對肝細(xì)胞免疫炎性損傷具有保護(hù)作用，在對小鼠急性肝損傷模型的研究中發(fā)現(xiàn)，IL-22能明顯減輕ConA對小鼠的肝損傷〔7〕，IL-22 mRNA以及IL-22在ConA誘導(dǎo)的肝炎中顯著高表達(dá)，IL-22的中和抗體可以加重肝損傷，給予重組IL-22后可以減輕肝損傷的過程〔8〕;另一方面IL-22還是肝細(xì)胞的存活因子，能減輕T細(xì)胞介導(dǎo)的肝損傷及抑制肝細(xì)胞凋亡〔8〕，這與IL-22能夠誘導(dǎo)組織修復(fù)途徑，以限制組織損傷和過度炎癥反應(yīng)有關(guān);因此IL-22對T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫性肝損傷具有一定的抑制作用〔9〕，IL-22對肝細(xì)胞的保護(hù)作用與Th22細(xì)胞在數(shù)量過多時(shí)可能造成免疫損傷學(xué)說相矛盾。

Th17細(xì)胞表面表達(dá)CD4、CCR4、CCR6，其分化路徑與Th1、Th2明顯不同〔10，11〕，Th1、Th2型細(xì)胞因子干擾素(INF) -γ、IL-4都能抑制Th17細(xì)胞的分化。Th17細(xì)胞主要通過分泌IL-17發(fā)揮生物學(xué)作用，目前研究認(rèn)為，Th17細(xì)胞及IL-17處于固有免疫及獲得性免疫的交界面，能夠通過募集和激活中性粒細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞聚集從而介導(dǎo)早期免疫排斥〔12〕及其他免疫性炎癥反應(yīng)，因此Th17細(xì)胞與Th1細(xì)胞功能的區(qū)別之一是二者作用的時(shí)間點(diǎn)不同，Th17細(xì)胞產(chǎn)生迅速，在免疫炎癥的急性期發(fā)揮作用，而Th1細(xì)胞則在延長或促進(jìn)后期免疫炎癥反應(yīng)方面發(fā)揮主導(dǎo)作用〔13〕。本研究說明慢性乙型肝炎患者在Th細(xì)胞分化過程中，Th22細(xì)胞分化及分泌IL-22的功能都受到抑制，導(dǎo)致IL-22及Th22下降，也可以推測IL-22及Th22細(xì)胞的減少或功能缺失是慢性乙型肝炎發(fā)病的原因之一，另一方面，慢性乙型肝炎患者由于缺乏IL-22對肝細(xì)胞的保護(hù)與修復(fù)作用，導(dǎo)致肝炎反復(fù)發(fā)作，遷延不愈。上述數(shù)據(jù)說明，慢性乙型肝炎患者的Th細(xì)胞分化偏移，Th22細(xì)胞數(shù)量減少或功能減退，可能是慢性乙型肝炎肝細(xì)胞損傷的原因之一，Th22細(xì)胞在慢性乙型肝炎的發(fā)病過程中可能未發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，而是通過IL-22起到保護(hù)肝細(xì)胞的作用。

本研究與余雪平等〔14〕研究結(jié)果不同，這可能與慢性乙型肝炎患者的病程、發(fā)病機(jī)制及Th17、Th1細(xì)胞分化特征有關(guān)，在乙肝的急性期，IL-17可能增多，通過招募與激活中性粒細(xì)胞及單核細(xì)胞發(fā)揮免疫損傷作用，而在乙肝的慢性期，肝細(xì)胞損傷主要與Th1型細(xì)胞損傷有關(guān)，Th1型細(xì)胞因子IFN-γ能抑制Th17細(xì)胞的分化，課題組收集的標(biāo)本庫主要為慢性乙型肝炎反復(fù)發(fā)作的患者，都處于慢性期。上述結(jié)果也說明，在慢性乙型肝炎反復(fù)發(fā)作的慢性期，Th17細(xì)胞及IL-17軸不是肝細(xì)胞損傷的主要原因。

4　參考文獻(xiàn)

1汪云，李紅霞，馮濤，等.不同病毒載量慢性乙型肝炎患者樹突狀細(xì)胞B7-H1表達(dá)及對免疫功能的影響〔J〕．現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2014; 14(6) : 1029-32，1061.

2中華醫(yī)學(xué)會肝病學(xué)會，中華醫(yī)學(xué)會感染病學(xué)會.慢性乙型肝炎防治指南(2010年版)〔J〕．肝臟，2011; 16(1) : 2-16.

3中華醫(yī)學(xué)會傳染病與寄生蟲學(xué)分會，中華醫(yī)學(xué)會肝病學(xué)分會.病毒性肝炎防治方案〔J〕．中華傳染病雜志，2001; 19(1) : 56-62.

4 Trifari S，Kaplan CD，Tran EH，et al．Identification of a human helper T cell population that has abundant p roduction of interleukin 22 and is distinct from Th-17，TH1 and TH2 cells〔J〕．Nat Immunol，2009; 10(8) : 864-71.

5 Duhen T，Geiquer R，Jarrossay D，et al．Production of interleukin 22 but not interleukin 17 by a subset of human skin homing memory T cells〔J〕．Nat Immunol，2009; 10(8) : 857-63.

6 Eyerich S，Eyerich K，Pennino D，et al．Th22 cells represent a distinct human T cell subset involved in epidermal immunity and remodeling〔J〕．J Clin Invest，2009; 119(1) : 3573-85.

7蔡欣，楊永昌，王園園，等.白細(xì)胞介素22對T細(xì)胞介導(dǎo)的小鼠肝損傷的治療作用及初步機(jī)制探討〔J〕．中國實(shí)驗(yàn)動物學(xué)報(bào)，2009; 17 (2) : 138-42．

8 Radaeva S，Sun R，Pan HN，et al．Interleukin 22(IL-22) plays a protective role in T cell-mediated murine hepatitis: IL22 is a survival factor for hepatocytes via STAT3 activation〔J〕．Hepatology，2004; 39(5) : 1332-42．

9 Zenewicz LA，Yancopoulos GD，Valenzuela DM.Interleukin-22 but not interleukin-17 provides protection to hepatocytes during acute liver inflammation〔J〕．Immunity，2007; 27(4) : 647-59.

10 Park H，Li Z，Yang XO，et al．A distinct lineage of CD4 T cells regulates tissue inflammation by producing interleukin 17〔J〕．Nat Immunol，2005; 6(11) : 1133-41.

11 Harrington LE，Hatton RD，Mangan PR，et al．Interleukin 17-producing CD4+effector T cells develop via a lineage distinct from the T helper type 1 and 2 lineages〔J〕．Nat Immunol，2005; 6(11) : 1123-32.

12戴小波，孫萬邦，張磊，等.重組人IL-10對皮膚移植家兔血清中IL-17家族水平的影響〔J〕．臨床檢驗(yàn)雜志，2012; 30(5) : 351-4.

13 Korn T，Reddy J，Gao W，et al．Myelin-specific regulatory T cells accumulate in the CNS but fail to control autoimmune inflammation〔J〕．Nat Medicine，2007; 13(4) : 423-31.

14余雪平，蘇智軍，郭如意等.慢性乙型肝炎患者外周血Treg/Th17檢測及其意義〔J〕．福建醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2012; 46(2) : 123-6.

〔2015-01-20修回〕

(編輯袁左鳴/滕欣航)

基金項(xiàng)目:珠海市衛(wèi)計(jì)局立項(xiàng)項(xiàng)目(2013091)

〔中圖分類號〕R512.6+2

〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2015) 16-4583-02;

doi:10.3969/j.issn.1005-9202.2015.16.075