豬繁殖與呼吸綜合征診斷方法的研究進(jìn)展

孫明潭，袁萬(wàn)哲，2，孫繼國(guó)，2

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，河北 保定 071001；2.河北省獸醫(yī)生物技術(shù)工程技術(shù)研究中心，河北 保定 071001）

豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起的一種豬繁殖障礙和呼吸道癥狀的傳染病，又稱豬藍(lán)耳病。PRRS的傳播速度非?？?，我國(guó)各省相繼報(bào)道PRRS的發(fā)生，并分離到毒株。2006年春、夏季首次暴發(fā)由高致病性PRRSV引起的“豬無(wú)名高熱癥”，給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失。

我國(guó)將PRRS列為二類傳染病，高致病性豬藍(lán)耳病列為一類傳染病。包括我國(guó)在內(nèi)的世界各國(guó)都投入大量的人力物力對(duì)該病進(jìn)行研究，但是對(duì)其致病機(jī)制和自身復(fù)制機(jī)制還未能完全明確。因此，快速準(zhǔn)確的檢測(cè)該病顯得尤為重要。目前檢測(cè)的技術(shù)手段有：病毒分離（VI），血清學(xué)檢測(cè)，分子生物學(xué)檢測(cè)等方法。本文就PRRSV主要檢測(cè)技術(shù)的最新研究進(jìn)展作一綜述。

1 臨床診斷

感染PRRSV的豬群會(huì)有不同的臨床癥狀,母豬：發(fā)熱、厭食、沉郁、昏睡，呼吸困難、咳嗽；流產(chǎn)、死胎、弱仔或早產(chǎn)；產(chǎn)仔率降低、推遲發(fā)情、屢配不孕或不發(fā)情等，產(chǎn)后無(wú)乳等癥狀。育成豬：雙眼腫脹、結(jié)膜炎，有眼屎或膿性分泌物，并出現(xiàn)呼吸困難，耳尖發(fā)紫、沉郁、昏睡等癥狀。公豬：感染后表現(xiàn)咳嗽、精神沉郁、食欲不振、呼吸急促，暫時(shí)性精液減少和活力下降。仔豬：以1月齡內(nèi)仔豬最易感染，體溫可達(dá)40℃以上，呼吸困難、有時(shí)腹式呼吸，厭食，腹瀉，耳尖至耳根皮膚發(fā)紺，出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，如肌肉震顫，呆立，前肢伸開呈八字腳，運(yùn)動(dòng)失調(diào)，后肢麻痹，眼瞼水腫，死亡率高達(dá)80%。對(duì)于感染高致病性豬藍(lán)耳病的豬群，多突然發(fā)病，且傳播迅速。

在病理變化上，藍(lán)耳病會(huì)呈現(xiàn)典型的間質(zhì)性肺炎，腎臟淤血、腫大，病死豬全身淋巴結(jié)充血、水腫，脾臟腫大、有出血性丘疹。目前豬群中疾病多為混合感染，僅根據(jù)臨床癥狀和剖檢很難確診，因此仍需實(shí)驗(yàn)室方法做出最終診斷。

2 實(shí)驗(yàn)室診斷

2.1 病毒分離 病毒分離是PRRS最為確切的實(shí)驗(yàn)室診斷方法。根據(jù)發(fā)病豬的生長(zhǎng)階段，病料應(yīng)選取死胎和發(fā)病仔豬的肺、腦、脾、淋巴結(jié)、血液等組織勻漿的混合物，母豬的血液，公豬的精液。PRRSV對(duì)溫度和pH值敏感，因此選取病毒含量高的病料并注意保存和及時(shí)送檢成為病毒分離的關(guān)鍵。

目前用于分離PRRSV的細(xì)胞有：豬原代肺泡巨噬細(xì)胞（PAM）、CL-2621、猴腎細(xì)胞系Marc-145或MA104。目前主要應(yīng)用Marc-145進(jìn)行病毒分離，高致病性PRRSV和部分經(jīng)典毒株初次分離即可適應(yīng)Marc-145細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞病變（CPE）。而有些經(jīng)典毒株需先適應(yīng)PAM之后，才能適應(yīng)Marc-145細(xì)胞，并且不易產(chǎn)生細(xì)胞病變（CPE）。因此，在進(jìn)行病毒分離的同時(shí)，還應(yīng)結(jié)合其他實(shí)驗(yàn)室方法進(jìn)行鑒定。并且病毒分離費(fèi)時(shí)費(fèi)力，因而不能成為普遍應(yīng)用的方法。

2.2 血清學(xué)技術(shù)

2.2.1 免疫過(guò)氧化物酶細(xì)胞單層試驗(yàn)（IPMA）與間接熒光抗體試驗(yàn)（IFA） IPMA需在PAM、Marc-145、CL2621等敏感細(xì)胞上進(jìn)行，特異性和敏感性較好，可以用于PRRSV抗原檢測(cè)、病毒鑒定、血清抗體檢測(cè)。但I(xiàn)PMA需配備專門技術(shù)人員和相關(guān)儀器設(shè)備，結(jié)果判定受主觀因素影響較大，易出假陽(yáng)性。IFA與IPMA方法基本相似，因此這兩種方法沒有廣泛的應(yīng)用于臨床。

2.2.2 中和試驗(yàn)（VN） VN使用Marc-145細(xì)胞在96孔微量板上進(jìn)行，其特異性較高，可以區(qū)分不同病毒類型和確定病毒滴度。由于PRRSV特異性中和抗體產(chǎn)生較晚，導(dǎo)致VN敏感性較低，因此不適宜PRRS早期檢測(cè)，常用于科研工作中。

2.2.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA） ELISA特異性和敏感性高，具有操作簡(jiǎn)單、標(biāo)準(zhǔn)化、快速、經(jīng)濟(jì)、結(jié)果判斷客觀、適宜大規(guī)模檢測(cè)等特點(diǎn)，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用，并且在許多國(guó)家成為標(biāo)準(zhǔn)或法定的診斷方法。

目前PRRSV常用N蛋白和GP5蛋白作為診斷抗原，為建立多種ELISA的檢測(cè)方法。其中以GP5蛋白作為診斷抗原不僅能檢測(cè)野毒感染，而且可以彌補(bǔ)N蛋白作為抗原不能反映機(jī)體免疫狀況的缺陷[1]。同時(shí)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者相繼應(yīng)用Nsp2、Nsp7、Nsp9等非結(jié)構(gòu)蛋白建立了ELISA檢測(cè)方法；隨著唾液檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，國(guó)外學(xué)者也相繼建立了可以檢測(cè)唾液中PRRSV抗體的ELISA方法，尤其IgG抗體檢測(cè)方法已被廣泛應(yīng)用[2]。

2.2.4 膠體金免疫層析方法（GICA） GICA是20世紀(jì)90年代發(fā)展起來(lái)的一種檢測(cè)診斷技術(shù)。Cui等應(yīng)用膠體金標(biāo)記重組M、N蛋白作為捕獲蛋白，建立了膠體金抗體檢測(cè)技術(shù)，顯示了較好的特異性和敏感性[3]。Zhou等針對(duì)N蛋白的單克隆抗體D5和M蛋白的單克隆抗體E9用膠體金標(biāo)記，制備了膠體金試紙條，與RT-PCR檢測(cè)結(jié)果相比，特異性、敏感性及檢出準(zhǔn)確性的符合率達(dá)93%以上[4]。膠體金試紙條操作簡(jiǎn)便、快速，結(jié)果判定明顯、直觀，非常適宜基層現(xiàn)場(chǎng)使用，但該方法在技術(shù)上還有待突破。

2.2.5 熒光微珠免疫檢測(cè)方法（FMIA） FMIA是基于Luminex技術(shù)建立的檢測(cè)方法，目前國(guó)外學(xué)者研究較多，并被應(yīng)用到多種病毒的檢測(cè)診斷中。Langenhorst等將重組Nsp7蛋白和N蛋白共價(jià)偶聯(lián)到Luminex熒光微球上，建立的熒光微珠免疫檢測(cè)方法可以檢測(cè)豬唾液和血清中PRRSV抗體，其特異性和敏感性均高于90%[5]。Gerber等應(yīng)用FMIA與IDEXX公司ELISA試劑盒檢測(cè)同樣的樣品，結(jié)果顯示兩個(gè)方法的特異性和敏感性無(wú)顯著差異[6]。FMIA可以檢測(cè)大量樣品和多種抗體，對(duì)病毒的混合感染、疫苗免疫效果、野毒株的鑒別診斷及快速診斷方面有重要的應(yīng)用意義。

2.3 分子生物學(xué)技術(shù)

2.3.1 RT-PCR檢測(cè) 在傳統(tǒng)RT-PCR的基礎(chǔ)上，國(guó)內(nèi)外學(xué)者相繼建立了多種RT-PCR方法。Liu等建立的3重PCR能夠快速鑒別檢測(cè)CSFV、PCV-2、PRRSV3種豬繁殖與呼吸衰竭病毒，具有較高的靈敏度[7]。鄭明等通過(guò)反向PCR擴(kuò)增2對(duì)特異性探針標(biāo)記的報(bào)告基因，建立了PRRSV環(huán)介導(dǎo)間接PCR檢測(cè)方法，可對(duì)高、低致病性PRRSV進(jìn)行鑒別診斷[8]。由于該方法特異性高、檢測(cè)速度快、多種病原同時(shí)檢測(cè)、避免散毒等特點(diǎn)，在PRRS群體的檢測(cè)上意義重大。

2.3.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time PCR） 近幾年，實(shí)時(shí)熒光定量PCR廣泛應(yīng)用于PRRSV的診斷中。Chai等建立了基于SYBR Green的real-time PCR，最低檢出量為1 TCID50/0.1 mL[9]。Wernike等成功引入基于異源RNA的內(nèi)部控制后，建立了多重real-time RT-PCR，可以鑒別診斷美洲型、歐洲型以及高致病性PRRSV[10]。由于實(shí)時(shí)熒光定量PCR可以實(shí)時(shí)檢測(cè)核酸擴(kuò)增并能自動(dòng)分析，從而能避免擴(kuò)增產(chǎn)物污染和不定量的問(wèn)題。該方法特異性高、敏感性好、操作簡(jiǎn)單快速，目前成為應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室診斷PRRSV的首選方法之一。

2.3.3 逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（RT-LAMP）

RT-LAMP原理為核酸鏈通過(guò)在等溫環(huán)境條件下的循環(huán)置換擴(kuò)增，實(shí)現(xiàn)對(duì)靶序列的放大。Zhang等建立的RT-LAMP檢測(cè)方法，樣品檢測(cè)結(jié)果與病毒分離結(jié)果符合率為100%，與CSFV、PRV、PCV-2、SIV等均無(wú)交叉反應(yīng)[11]。GAO等根據(jù)M基因序列設(shè)計(jì)特異性引物建立了RT-LAMP檢測(cè)方法，其檢測(cè)的敏感性高于常規(guī)RT-PCR和real-time RTPCR[12]。RT-LAMP方法具有特異性強(qiáng)、敏感性高、無(wú)需貴重設(shè)備就能滿足反應(yīng)條件、檢測(cè)快速簡(jiǎn)便等特點(diǎn)，在PRRSV檢測(cè)診斷中應(yīng)用越來(lái)越廣泛。

2.3.4 原位雜交技術(shù)（ISH） 原位雜交技術(shù)主要采用地高辛、生物素等標(biāo)記材料插入PRRSV的基因中制成特異性探針，可用于檢測(cè)發(fā)病豬的肺臟、淋巴結(jié)等含有病毒的組織。Han等用ISH方法檢測(cè)感染歐洲PRRSV的豬組織，結(jié)果證明，接種美洲型疫苗的母豬也能感染歐洲型PRRSV，并導(dǎo)致繁殖障礙[13]。原位雜交技術(shù)為PRRSV的檢測(cè)提供了新的途徑，但由于成本較高，目前還未大規(guī)模應(yīng)用。

2.3.5 基因芯片技術(shù)（Gene chip technology） 該技術(shù)主要用于基因序列測(cè)定、基因表達(dá)譜鑒定、基因突變體的檢測(cè)分析和基因組的功能研究等方面，是近幾年新興的一項(xiàng)技術(shù)，并應(yīng)用于PRRSV的檢測(cè)。Xing等利用Affymetrix公司的基因芯片檢測(cè)樣品，與real-time RT-PCR結(jié)果一致[14]。基因芯片技術(shù)可以進(jìn)行大規(guī)模高通量的檢測(cè)，雖然目前應(yīng)用成本較高，但隨著研究的逐步深入，該技術(shù)將被廣泛應(yīng)用。

3 展望

綜上所述，PRRSV檢測(cè)技術(shù)隨著PRRS的流行在逐步發(fā)展，早期建立的檢測(cè)方法隨著國(guó)內(nèi)外學(xué)者的研究不斷改進(jìn)和提高，同時(shí)新的檢測(cè)技術(shù)也不斷建立和應(yīng)用。尤其針對(duì)PRRSV的高變異和疫苗株的鑒別診斷，為臨床的早期預(yù)防提供了重要參考。雖然每種檢測(cè)方法都有其局限性，但相信在以后的研究中會(huì)通過(guò)優(yōu)化已有方法和應(yīng)用新技術(shù)，建立全新的檢測(cè)方法，為預(yù)防PRRS的發(fā)生和消滅PRRSV提供重要技術(shù)支持。

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