攜帶漢坦病毒宿主動物分布特征研究

馬超鋒，余鵬博，吳 瑞，陳海龍，蔡正華，盧曉玲，王敬軍，李恒新

攜帶漢坦病毒宿主動物分布特征研究

馬超鋒1，余鵬博2，吳 瑞1，陳海龍1，蔡正華1，盧曉玲3，王敬軍2，李恒新1

目的 研究西安地區(qū)攜帶漢坦病毒(HV)宿主種類及分布特點。方法 夾夜法捕獲宿主動物后鑒定種類，利用熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)檢測宿主動物肺臟中HV核酸。結(jié)果 2011-2013年在監(jiān)測地域共捕獲動物2 577只，鼠密度為3.28%，在9月份達(dá)到5.6%；其中黑線姬鼠(Aa)占63.4%，小家鼠(Mm)和褐家鼠(Rn)分別占18.98%和12.88%；312份動物標(biāo)本中檢出HV核酸，其中Aa占88.78%，Rn占5.12%，Mm占4.49%，在黃胸鼠(Rf)和北小社鼩(Cs)也檢出HV核酸，在8月和9月捕獲的陽性宿主占到了全部陽性的56.73%， 野外的陽性宿主占到了總陽性的87.82%。結(jié)論 西安地區(qū)鼠密度在9月達(dá)到高峰，鼠種主要為Aa，Mm和Rn，攜帶HV的動物有Aa，Rn，Mm，Rf和Cs等，形成了在野外以Aa為主，居民區(qū)以Rn 和Mm為主,陽性宿主動物主要出現(xiàn)在野外8月9月，這對本地區(qū)防控腎綜合征出血熱(HFRS)中宿主控制方面具有指導(dǎo)意義。

漢坦病毒；宿主動物；時空分布

腎綜合征出血熱(Hamorrhage Fever with Renal Syndrome, HFRS)是一種自然疫源性疾病，是由漢坦病毒(Hantavirus, HV)感染引起的一種急性傳染病[1]。從目前發(fā)現(xiàn)的HV來看，幾乎每種HV均和一種嚙齒類動物宿主有關(guān)，病毒感染宿主后與宿主共生，一般不引起宿主動物發(fā)病。HV一般有較嚴(yán)格的宿主范圍，一種病毒只感染某一種嚙齒動物。病毒感染宿主動物后，排泄物(如尿液、糞便和唾液等)排泄在環(huán)境中，人類通過接觸宿主排泄物而感染，這一特性是HV由宿主傳給人類的關(guān)鍵。因此，宿主動物的分布界定了各種HV流行地域的不同。HV宿主動物的地理分布區(qū)與人類HFRS、HPS的自然疫源地和疫區(qū)分布基本吻合[2]。因此，檢測鼠間HV感染情況，可對HFRS的防控提供依據(jù)。近年來，陜西省成為我國HFRS病例數(shù)最多的地域，西安地區(qū)自1956年報道首例HFRS病例以來，報告病例數(shù)一直占到全省病例數(shù)的70%以上[3]。為更有針對性地進(jìn)行HFRS防控，對攜帶HV宿主在季節(jié)和空間上的分布提供依據(jù)，我們進(jìn)行了本研究。

1 實驗材料

1.1 標(biāo)本 2011-2013年分別在在西安地區(qū)HFRS疫區(qū)戶縣和長安區(qū)按照《全國腎綜合征HFRS監(jiān)測方案》(試行)，選擇監(jiān)測點，用夾夜法捕鼠后，記錄捕獲宿主動物位置，運送至實驗室進(jìn)行宿主種群鑒別、稱量體重、身長、右后足長及右耳長后，無菌解剖收集肺臟和心臟-80℃保存，肺臟分3等份分別進(jìn)行抗原、核酸和病毒分離。

1.2 主要試劑和實驗儀器 核酸提取試劑為Trizol(life technologies, 美國)，組織均質(zhì)器為Tissuelyser(Qiagen，德國)，RT-PCR試劑為一步法RT-PCR試劑(life technologies, 美國)，Biorad公司CFX96實時熒光定量PCR儀(美國)，Thermoscientific公司酶標(biāo)儀洗板機(美國)。

1.3 實驗方法 按照試劑說明RT-PCR檢測HV核酸。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 利用Openepi，SPSS13.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析。

2 結(jié) 果

2.1 2011-2013年鼠密度情況 2011年在戶縣、長安兩區(qū)縣共布鼠夾18 961只，捕獲動物331只，鼠密度為1.74%；2012年共布鼠夾18 865只，捕獲動物533只，鼠密度為2.83%；2013年共布鼠夾40 700只，捕獲動物1 584只,鼠密度為3.89%，3年中平均監(jiān)測鼠密度為3.28%，按月鼠密度分布見圖1。

2.2 2011-2013年捕獲嚙齒動物時間種類分布 2011-2013年共捕獲動物2 577只，主要鼠種為黑線姬鼠(63.40%)，小家鼠(18.98%)，褐家鼠(12.88%)，在5、8、9、10四個月捕獲的動物最多。

Aa:Apodemusagrarius; Rn:Rattusnorvegicus; Mm:Musmusculus; Md:Musdomesticus; Rf:Rattusflavipectus; Cs:Corcidurasuaveolens; Tt:Tscherskiatriton.

圖2 2011-2013年兩地宿主動物構(gòu)成按月分布情況

Fig.2 Monthly distribution of host animal from 2011 to 2013

2.3 陽性嚙齒動物種類、時間分布情況 2011-2013年共檢出HV核酸陽性標(biāo)本312份，總陽性率12.11%，其中野外鼠陽性率15.86%，居民區(qū)陽性率4.47%；黑線姬鼠陽性率16.72%，黃胸鼠12.50%，褐家鼠4.82%，小家鼠2.80%；陽性宿主中，黑線姬鼠最多(88.78%)，褐家鼠和小家鼠分別占5.12%和4.49%；具體鼠種陽性情況見下表1。在捕獲陽性動物的時間分布來看，3年中第一季度均未捕獲陽性動物，而8月、9月捕獲的陽性動物占到了全部陽性的56.73%，陽性動物按月分布情況見圖3。宿主分布統(tǒng)計顯示野外的陽性數(shù)占總陽性數(shù)的87.82%。

Aa:Apodemusagrarius; Mm:Musmusculus; Rn:Rattusnorvegicus;

Cs:Corcidurasuaveolens; Rf:Rattusflavipectus.

圖3 2011-2013年陽性動物種類按月分布情況

Fig.3 Monthly distribution of HV RNA positive animal from 2011 to 2013

3 討 論

目前，對于HV在其宿主的感染狀況調(diào)查，按照《全國腎綜合征HFRS監(jiān)測方案》(試行)要求，可使用IgG抗體、免疫熒光法檢測HV抗原和RT-PCR法檢測HV核酸。檢測IgG抗體可用抗原片法和ELISA法，抗原片法要求檢測者通過顯微鏡觀察結(jié)果，主觀性較強，加之目前抗原片供應(yīng)不足，難以大批量進(jìn)行；ELISA法檢測IgG抗體可以用來進(jìn)行大批量樣本的調(diào)查，但目前市場上沒有成熟的針對宿主動物HV IgG類抗體檢測試劑盒，目前報道的研究結(jié)果均是各個實驗室自行制備抗原包被后進(jìn)行檢測，結(jié)果的重復(fù)性和可比性較差。利用直接或間接免疫熒光法檢測鼠肺中HV抗原，方法靈敏性較低，結(jié)果的判定主觀性較強，因此也限制了本方法的使用。HV核酸檢測特異、靈敏，但檢測鼠肺中HV由于要對組織均質(zhì)，使用組織研磨器，勞動量較大，標(biāo)本之間容易交叉污染，所以限制了本方法的使用。在本次研究中，我們使用Qiagen公司生產(chǎn)的Tissuelyser組織均質(zhì)器，實現(xiàn)了大量樣本的同時操作，取得了滿意的效果。Tissuelyser利用鋼珠的上下振蕩對組織進(jìn)行均質(zhì)，操作簡便，重復(fù)性強，使用一次性離心管和鋼珠，不存在交叉污染，可對批量標(biāo)本同時處理，是組織核酸提取前處理標(biāo)本的一種較好的方法。在本研究中，我們采用核酸檢測方法對西安地區(qū)HV及其屬主進(jìn)行調(diào)查，使得大批量組織標(biāo)本進(jìn)行HV核酸檢測結(jié)果真實可信。

在3年的調(diào)查中，宿主動物密度分別為1.74%、2.83%和3.89%，可以看出鼠密度在過去3年中逐步增高。鼠密度在9月達(dá)到最高值，3年來平均為5.6%，這與氣候和農(nóng)作物的生長周期密切相關(guān)，關(guān)中地區(qū)在9月份農(nóng)作物逐漸進(jìn)入收獲季節(jié)，可為宿主動物提供更多食物，為宿主動繁衍提供條件。監(jiān)測顯示在這兩個地區(qū)優(yōu)勢鼠種均是黑線姬鼠，占到總捕獲數(shù)的64.3%；在野外捕獲的動物中黑線姬鼠占到了87.26%，居民區(qū)占到了17.65%，而居民區(qū)小家鼠和褐家鼠分別占到47.18%和31.53%。西安地區(qū)HV宿主動物在野外以黑線姬鼠，在居民區(qū)以小家鼠和褐家鼠為主，但黑線姬鼠數(shù)量占絕對優(yōu)勢。

以往的研究顯示，西安地區(qū)攜帶HV的宿主動物在1984年以前檢測到的為黑線姬鼠，在1985年、1986年、1988年分別發(fā)現(xiàn)褐家鼠、小家鼠、黃胸鼠和大倉鼠攜帶有HV抗原[4]。本次研究中我們以HV核酸為檢測物，結(jié)果顯示西安地區(qū)黑線姬鼠攜帶HV的數(shù)量遠(yuǎn)高于其他動物，形成在野外以黑線姬鼠攜帶HV為主、在居民區(qū)以小家鼠、褐家鼠攜帶HV為主的格局。時間分布顯示攜帶HV的宿主動物在8月達(dá)到高峰，因此在每年夏末秋初野外活動時加強防范是減少HV感染的關(guān)鍵。

以往的調(diào)查顯示西安地區(qū)攜帶HV的宿主有黑線姬鼠、褐家鼠、小家鼠、黃胸鼠等嚙齒動物，本次調(diào)查除在以上動物中檢出HV外，在3只鼩鼱中檢測HV核酸，其中1只經(jīng)陜西省動物研究所鑒定，根據(jù)其生理特性和體貌特征鑒定為北小麝鼩(Corcidurasuaveolens,Cs)。Cs屬于食蟲目鼩鼱科，此前在我國曾報道在臭鼩(Suncusmurinus)和普通鼩鼱(Sorexaraneus)體內(nèi)檢測到漢坦病毒抗原。由于我們利用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)未能在這3只動物標(biāo)本中分離到HV病毒，而Cs由于體型較小，我們亦未能采集到更多標(biāo)本進(jìn)行進(jìn)一步驗證，因此關(guān)于Cs攜帶HV這一論斷還需進(jìn)一步研究[5]。

根據(jù)以往的研究結(jié)果，西安地區(qū)已經(jīng)成為漢灘病毒(Hantaanvirus，HTNV)和漢城病毒(Seoulvirus，SEOV)混合疫區(qū)。2002年魏戰(zhàn)臻等報道經(jīng)對西安市戶縣1993-2000年間的233份病人血清利用血凝抑制實驗進(jìn)行病原學(xué)分型，結(jié)果顯示約5%為SEOV型，提出西安地區(qū)成為HTNV和SEOV兩型病毒共同流行的混合疫區(qū)[4]。2004年白雪帆等報道陜西省延安市爆發(fā)的HFRS疫情中擴增的HV序列經(jīng)比對與SEOV序列同源性在94%，而與HTNV同源性僅有76%，提示延安地區(qū)有可能成為新的SEOV疫區(qū)[6]。在1990年以前的監(jiān)測顯示，西安地區(qū)只有Aa攜帶HV，而在其后的監(jiān)測中，褐家鼠、黃胸鼠、小家鼠等鼠種均檢出攜帶有HV抗原[7]。由于HV與宿主之間有較嚴(yán)格的限制性，一般HTNV只在Aa中生存，而SEOV在Rn體內(nèi)寄生，由此亦推斷西安地區(qū)成為SEOV和HTNV混合疫區(qū)。我們對所有宿主動物中檢出的HV均進(jìn)行了病毒基因分型，分型結(jié)果均為HTNV型，未檢出SEOV型。同時進(jìn)行的HFRS病例標(biāo)本病毒分型全部為HTNV型(內(nèi)部資料)。

從目前發(fā)現(xiàn)的HV來看，除少數(shù)例外，幾乎每種HV均和一種嚙齒類動物宿主有關(guān)，病毒感染宿主后與宿主共生，一般不引起宿主動物發(fā)病。HV一般有較嚴(yán)格的宿主范圍，一種病毒只感染某一種嚙齒動物[8]。但后續(xù)研究顯示，這種對應(yīng)并不是非常嚴(yán)格，一種HV同樣可以暫時或永久感染其它相近宿主，這一般發(fā)生在一個區(qū)域內(nèi)生活有多種動物時，這種現(xiàn)象稱為溢出感染(Spillover infection)[9]。Klingstom等曾報道普馬拉病毒就從棕背鼠平溢出到普通田鼠和小林姬鼠，多不拉法病毒也從黃喉姬鼠溢出至小林姬鼠和Mm，我國四川省和天津市都從社鼠中分離到HTNV，也從社鼠體內(nèi)分離到新型HV大別山病毒[10-11]。Zuo等在湖南小家鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)HTNV存在；同時從貴州Rn體內(nèi)分離到HTNV，2013年我們從Rn體內(nèi)檢測HV RNA[9,12]。在這些宿主中均發(fā)生了HV的溢出感染。雖然西安地區(qū)在多種嚙齒動物體內(nèi)均檢出HV，但宿主動物體內(nèi)和病例攜帶HV分型監(jiān)測均為HTNV, 因此我們認(rèn)為西安地區(qū)仍然是HTNV的單一疫區(qū)。在實驗中顯示，黑線姬鼠攜帶的HV核酸數(shù)量明顯高于其他幾種宿主動物，因此溢出感染是一過性或可以形成新的傳播宿主值得進(jìn)一步研究。

綜上所述，監(jiān)測顯示西安地區(qū)目前HV宿主動物主要是黑線姬鼠，小家鼠和褐家鼠，在野外以黑線姬鼠為主，在居民區(qū)以小家鼠和褐家鼠為主；數(shù)量上黑線姬鼠占絕對優(yōu)勢；而攜帶HV的宿主動物在8月達(dá)到高峰。在攜帶HV的動物類型和分布來看，野外的黑線姬鼠是攜帶HV的主要宿主，而進(jìn)入居民區(qū)的黑線姬鼠也攜帶HV；小家鼠、褐家鼠和黃胸鼠以及野外的鼩鼱等也可攜帶HV，但這些宿主攜帶的HV仍然是HTNV，這種攜帶是一過性或已經(jīng)形成新的感染源頭需進(jìn)一步研究。

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Spatial and temporal distribution of hosts carrying hantaviruses

MA Chao-feng1,YU Peng-bo2,WU Rui1,CHEN Hai-long1,CAI Zheng-hua1,LU Xiao-ling2,WANG Jing-jun2,LI Heng-xin1

(1.Xi’anCentreforDiseaseControlandPrevention,Xi’an710054,China;2.ShaanxiCentreforDiseaseControlandPrevention,Xi’an710054,China;3.HuxianCentreforDiseaseControlandPrevention,Huxian710030,China)

In this study, we aimed to observe the hantavirus (HV) hosts species and distribution characteristics in Xi’an City, Shaanxi Province, China. The small animals were captured by night-trapping and HV RNA was detected by real time RT-PCR in their lung samples. In the survey area from 2011 to 2013, 2 577 animals were captured and the average rodent density was 3.28% and reached 5.6% in September in these hosts.Apodemusagrarius(Aa) accounted for 63.4% of the host animal,Musmusculus(Mm) for 18.98%, andRattusnorvegicus(Rn) for 12.88%. There were 312 HV RNA positive lung samples (Aa 88.78%, Rn 5.12%, Mm 4.49%). HV RNA was also found inRattusflavipectus(Rf) andCrocidurasuaveolens(Cs). The HV RNA positive rate of hosts captured in August and September was 56.73%. The HV RNA positive hosts in field area accounted for 87.82% of total positive ones. The host density reached to the highest point in September and the main hosts of HV were Aa, Mm and Rn; the hosts carrying HV RNA were Aa, Rn, Mm, Rf, and Cs in Xi’an from 2011 to 2013. In the field area, Aa was the main HV host, and in residential area, they were Rn and Mm. The HV RNA positive hosts mainly appeared in the field area in August and September and this conclusion was important for the control and prevention of HFRS in Xi’an, China.

hantaviruses; hosts; spatial and temporal distribution

Li Heng-xin, Email: hengxinl27@163.com

李恒新，Email:hengxinl27@163

1.西安市疾病預(yù)防控制中心，西安 710054； 2.陜西省疾病預(yù)防控制中心，西安 710054； 3.陜西省戶縣疾病預(yù)防控制中心，戶縣 710300

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.01.006

R183.5

A

1002-2694(2015)01-0026-04

2014-04-15；

2014-10-14

陜西省自然科學(xué)基金( No.2011JM4010)

Funded by the Shaanxi Science and Technology Plan Project (No. 2011JM4010)