間日瘧原蟲抗藥性研究進(jìn)展

徐 馨，劉懷鄂，劉永華，楊照青

間日瘧原蟲抗藥性研究進(jìn)展

徐 馨1，劉懷鄂1，劉永華2，楊照青1

瘧疾作為一種致死性很高的全球性寄生蟲病，一直被全世界所關(guān)注，瘧疾的控制也被列入全球三大公共衛(wèi)生問題之一。由于瘧疾抗藥性的流行和蔓延，尤其是間日瘧抗性的快速傳播，使得瘧原蟲抗性的檢測(cè)、預(yù)測(cè)以及新藥的研發(fā)成為當(dāng)前研究重點(diǎn)。針對(duì)這一系列問題，本文對(duì)當(dāng)前間日瘧抗藥性檢測(cè)方法、分子機(jī)理以及熱點(diǎn)抗間日瘧藥物做一綜述。

間日瘧原蟲；抗藥性；研究進(jìn)展

瘧疾是一種嚴(yán)重威脅人類健康的傳染病，每年有 3億 至 5億新發(fā)瘧疾病例和至少100萬人因感染瘧疾死亡。同時(shí)由于瘧原蟲抗藥性的產(chǎn)生和迅速擴(kuò)散，致使全球瘧疾發(fā)病率和死亡率迅速回升，使全球瘧疾防治面臨嚴(yán)重困難，也嚴(yán)重威脅到我國(guó)人民身體健康和社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展。由于惡性瘧原蟲感染引起的癥狀比其它種類的瘧原蟲嚴(yán)重以及間日瘧原蟲體外培養(yǎng)體系的缺乏等原因，69%的瘧疾相關(guān)研究主要放在惡性瘧疾方面。長(zhǎng)期以來，間日瘧原蟲引起的瘧疾被認(rèn)為預(yù)后是良性的，對(duì)于間日瘧原蟲的研究并沒有引起學(xué)術(shù)界的關(guān)注。但作為4種瘧原蟲中最流行的種類之一，間日瘧原蟲(Plasmodiumvivax)的分布比惡性瘧原蟲更廣[1]，并且通過近期的研究發(fā)現(xiàn)間日瘧同樣是嚴(yán)重危及生命的重要寄生蟲病。由間日瘧原蟲引起的瘧疾給人類的健康、財(cái)富、繁榮帶來巨大壓力。然而，新藥的研發(fā)速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于瘧原蟲抗藥性的產(chǎn)生速度。因此間日瘧原蟲的抗藥性研究自然成為抗瘧治療中的重要環(huán)節(jié)。

1 間日瘧原蟲抗藥性檢測(cè)方法

1.1 體內(nèi)測(cè)定 體內(nèi)測(cè)定法按服藥后瘧原蟲清除的情況判斷，據(jù)觀察時(shí)間不同分1周法和4周法。按照世界衛(wèi)生組織的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[2]，抗性可分為3個(gè)等級(jí)。一級(jí)抗性(R1)定義為服藥后7 d內(nèi)瘧原蟲無性體被清除，但在 28 d內(nèi)瘧原蟲無性體又重新出現(xiàn)者。二級(jí)抗性(RII)為服藥后 48 h瘧原蟲無性體比服藥前減少 75%以上，但 7 d內(nèi)瘧原蟲無性體不轉(zhuǎn)陰者。三級(jí)抗性(RIII)為服藥后48 h瘧原蟲無性體沒有減少到服藥前的 75%，或原蟲無性體數(shù)增加，隨后亦未見無性體原蟲轉(zhuǎn)陰者。

1.2 體外測(cè)定

1.2.1 微量測(cè)定法 WHO 推薦的Rieckmann體外微量測(cè)試法基于計(jì)數(shù)可發(fā)育為裂殖體的原蟲數(shù)目[3]。取0.2 mL 含蟲血樣，稀釋于1.8 mL培養(yǎng)基中，在測(cè)定板各井中依次加入50 μL含蟲血培養(yǎng)及混合液，在37 ℃恒溫箱內(nèi)蠟燭剛培養(yǎng)，培養(yǎng)19～37.5 h。培養(yǎng)時(shí)，瘧原蟲密度超過80 000個(gè)/μL血時(shí)，用健康人“O”型血紅細(xì)胞稀釋至20 000～50 000個(gè)/μL血。再按上述方法操作，計(jì)數(shù)厚血膜中20個(gè)無性體原蟲范圍內(nèi)3個(gè)核及以上的裂殖體數(shù)。同位素微量測(cè)試法基于檢測(cè)外源性核酸前體，同位素標(biāo)記的次黃嘌呤摻入量。此外還有瘧原蟲乳酸脫氫酶分析，瘧原蟲乳酸脫氫酶及富組氨酸蛋白酶聯(lián)免疫反應(yīng)等色度檢測(cè)方法[4-5]，以及近來發(fā)展的利用 SYBR Green Ⅰ等標(biāo)記的熒光法和流式細(xì)胞儀法。最近，有文章表明，間日瘧的檢測(cè)ex-vivo 抗藥性測(cè)定，如果不事先過濾除去白細(xì)胞，由于本底干擾較大，Rieckmann體外微量測(cè)試法成功率高于SYBR GreenⅠ[6]。

1.2.2 分子測(cè)定 分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展為確定瘧原蟲抗藥性的遺傳學(xué)基礎(chǔ)提供了新的研究工具。分子標(biāo)記作為一項(xiàng)重要的補(bǔ)充工具，并不是體內(nèi)抗藥性檢測(cè)的替代品，它適用于大規(guī)模篩查、評(píng)估及監(jiān)測(cè)瘧原蟲抗藥性。目前廣泛應(yīng)用于瘧原蟲抗藥性研究的分子標(biāo)記為單核苷酸多態(tài)性 (SNP)，這是Lander E 于 1996 年提出的第3代 DNA 遺傳標(biāo)記。DNA 芯片技術(shù)的日趨成熟使得 SNP 成為最重要最有效的分子標(biāo)記。常用的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)還包括 PCR 擴(kuò)增測(cè)序[7]、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析(RFLP)[8]等。但由于我們對(duì)間日瘧原蟲的抗藥性的機(jī)理知之甚少，目前明確的有針對(duì)性的抗藥性靶標(biāo)依然很少，需要我們加大研究力度。

2 間日瘧原蟲抗藥性的分子機(jī)理

目前，對(duì)于間日瘧原蟲抗性的研究遠(yuǎn)遠(yuǎn)滯后落后于惡性瘧原蟲的抗性研究。在間日瘧原蟲的抗藥性關(guān)聯(lián)基因研究中，目前Pvdhfr和Pvdhps的點(diǎn)突變相似于惡性瘧原蟲的，與葉酸類藥物抗性相關(guān)的研究報(bào)道較為肯定[9-10]。Pvmdr1的拷貝數(shù)的增加與甲氟喹的抗性有關(guān)系[10]，這與惡性瘧原蟲的也極為相似。而氯喹的抗藥性卻一直不清楚?？梢钥隙ǖ氖?，與惡性瘧原蟲不同的是，與Pvcrt-o的點(diǎn)突變沒有[9, 11-12]，可能與表達(dá)過量有關(guān)[10]，有研究認(rèn)為與Pvmdr1的拷貝數(shù)的增加有關(guān)系[13]，但是更多的研究認(rèn)為沒有關(guān)系，拷貝數(shù)增加只與甲氟喹的抗性有關(guān)系[11]。也有認(rèn)為與Pvmdr1的 Y976F和 F1076L位點(diǎn)的點(diǎn)突變有關(guān)系[10]，但是卻沒有進(jìn)一步得到其他研究的支持[11-12]。

3 針對(duì)間日瘧原蟲抗藥性的藥物研究

抗瘧藥物在人類與瘧原蟲幾千年的抗?fàn)幹邪l(fā)揮了極為重要的作用，但由于瘧原蟲抗藥性的迅速蔓延，多重耐藥蟲株的出現(xiàn)使得在很多瘧疾重災(zāi)區(qū),可供選擇的抗瘧藥物已十分有限，急需新藥的誕生。由于作為分布最為廣泛的間日瘧本身具有傳播快、易復(fù)發(fā)、難于治愈的特點(diǎn)，對(duì)新藥的研發(fā)提出了更高要求。在世界上大部分地區(qū)，由于惡性瘧原蟲對(duì)多種抗瘧疾藥物的廣泛抗性產(chǎn)生，青蒿素類藥物被確定為治療惡性瘧的一線藥物。為了保護(hù)青蒿素類藥物的敏感性，WHO推薦間日瘧的治療以氯喹-伯胺喹聯(lián)合為一線藥物。近70年來，氯喹-伯胺喹配伍依然是世界上大部分地區(qū)治療間日瘧疾的一線藥物。

氯喹(Chloroquine)作為最早發(fā)現(xiàn)和使用的最為有效的抗瘧藥物，挽救了大量人類瘧疾患者的生命和物質(zhì)財(cái)富。但在大規(guī)模用于瘧疾治療后，瘧原蟲陸續(xù)對(duì)它產(chǎn)生抗藥性，并且抗性蟲株在全球范圍迅速播散。針對(duì)氯喹耐藥性的出現(xiàn)，新研發(fā)的WHO推薦用藥還包括氨酚喹(Amodiaquine)、甲氟喹(Mefloquine)。目前研究較熱的上市藥物復(fù)方磷酸萘酚喹片(Arco)，在相關(guān)實(shí)驗(yàn)中證實(shí)一次服藥可以擁有更長(zhǎng)的有效血藥濃度控制時(shí)間和較少的副作用。自從 1989年在巴布亞新幾內(nèi)亞地區(qū)發(fā)現(xiàn)首列氯喹抗性株以來[14]，多個(gè)地區(qū)相繼發(fā)現(xiàn)抗性株[10,15]。在一些氯喹高抗性地區(qū)，比如索羅門群島、瓦努阿圖、巴布亞新幾內(nèi)亞、印度尼西亞等地區(qū)，由于敏感性降低的蟲株量超過30%， ACT(Artemisinin-based Combination Therapy，ACT)方案已經(jīng)取代氯喹治療方案[15]。

青蒿素(Artemisinin)及其衍生物是一種具有與含氮雜環(huán)的奎寧衍生物完全不同的分子結(jié)構(gòu)的含氧基團(tuán)的新型倍半萜內(nèi)酯類化合物。在瘧疾治療的相關(guān)實(shí)驗(yàn)證實(shí)青蒿素類藥物比起奎寧類化合物具有高效、低毒的特點(diǎn)。自從1989年首次公開報(bào)道關(guān)于間日瘧原蟲對(duì)氯喹產(chǎn)生抗性以來學(xué)術(shù)界陸續(xù)開始研發(fā)除含氮雜環(huán)類化合物的新藥物。目前WHO推薦的主要藥物除青蒿素外還包括蒿甲醚(Artemether)、青蒿琥酯(Artesunate)、雙氫青蒿素(Dihydroartemisinin)、蒿乙醚(Artemotil)。青蒿素類藥物雖然未有耐藥性報(bào)道，但是惡性瘧原蟲的體外試驗(yàn)顯示敏感性在逐漸降低，對(duì)于易發(fā)生耐藥的間日瘧產(chǎn)生抗性問題更不容忽視。由于可供選擇的抗瘧藥物種類有限，加之臨床治療過程中的不規(guī)范使用，加速了蟲株抗性的產(chǎn)生，縮短了藥物的有效期，加劇了新藥研發(fā)迫切性。

伯氨喹是目前WHO推薦治療方案中防止間日瘧復(fù)發(fā)的唯一用藥。由于氯喹和青蒿素類藥物只能作用于紅細(xì)胞內(nèi)期，而只有伯胺喹可以殺滅紅細(xì)胞外期，所以為了間日瘧防治復(fù)發(fā)，前者與后者聯(lián)用，才能取得好的效果。但是，人們除了發(fā)現(xiàn)間日瘧原蟲的氯喹抗性外[16-19]，還發(fā)現(xiàn)伯氨喹的抗性，巴西已發(fā)現(xiàn)24.5%的病例用伯氨喹防止復(fù)發(fā)失敗[20]。可喜的是，目前他非諾喹(Tafenoquine)已經(jīng)進(jìn)入臨床3期研究，取得好的效果，人們多了一些選擇。在這項(xiàng)考證他非諾喹有效性和安全性的多中心雙盲臨床藥物試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，300 mg(89.2%)和600 mg(91.9%)的單次劑量他非諾喹聯(lián)合氯喹治療間日瘧對(duì)間日瘧復(fù)發(fā)率的控制效果明顯好于單用氯喹(37.5%)和氯喹聯(lián)合伯氨喹組(77.3%)，而副作用未見增加[15]。這些報(bào)告無不敦促人們尋找新的有效治療途徑。聯(lián)合用藥便是途徑之一，聯(lián)合用藥因?yàn)椴煌幬镒饔玫陌袠?biāo)不同，因此效果優(yōu)于單獨(dú)使用，則可以提高治療效果或者延緩瘧原蟲產(chǎn)生抗性。

目前雖然已經(jīng)擁有了療效比較明確的包括ACT、氯喹聯(lián)合伯氨喹在內(nèi)的多種抗瘧方案，但由于瘧原蟲抗藥性的迅速蔓延,特別是多重抗藥性瘧疾的不斷擴(kuò)散,使得我們?cè)诤芏喁懠仓貫?zāi)區(qū)的抗瘧治療捉襟見肘，可用藥物日漸匱乏。如何能夠簡(jiǎn)單準(zhǔn)確的檢出、預(yù)測(cè)瘧原蟲的抗性，快速研發(fā)有出效的藥物是保證全球抗瘧策略成功的關(guān)鍵。尤其對(duì)于分布面積最為廣泛的間日瘧，由于過去認(rèn)識(shí)的偏差和體外培養(yǎng)條件的限制，相關(guān)的研究還處于初期階段，還有很多工作需要繼續(xù)探索與努力。

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Drug resistance ofPlasmodiumvivax

XU Xin1,LIU Huai-e1,LIU Yong-hua2,YANG Zhao-qing1

(1.DepartmentofParasitology,KunmingMedicalUniversity,Kunming650500,China;2.YunnanRuiliCenterforDiseaseControlandPrevention,Ruili678600,China)

As a high lethality and global parasitic disease, malaria has been the worldwide attention, and the control of malaria has been listed as one of the world’s three major public health problems. Prevalence and spread of drug-resistance, especially the rapid spread of resistance, becomes the research focus ofPlasmodiumdrug-resistance detection, prediction and development of new drugs forPlasmodiumvivaxmalaria. According to these series problems, the currentPlasmodiumvivaxmalaria drug resistance test method, the molecular mechanism and hot spots ofPlasmodiumvivaxmalaria drugs were reviewed in this article.

Plasmodiumvivax; drug resistance; review

Yang Zhao-qing, Email: zhaoqing92@hotmail.com

國(guó)家自然科學(xué)基金(No.31260508;No.U1202226);教育部高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金(No.20125317110001)

楊照青，Email：zhaoqing92@hotmail.com

1.昆明醫(yī)科大學(xué)寄生蟲學(xué)教研室，昆明 650500； 2.云南省瑞麗市疾病預(yù)防控制中心, 瑞麗 678600

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.01.016

R382.3

A

1002-2694(2015)01-0074-03

2014-03-07；

2014-10-02

Supported by the National Natural Science Foundation of China (Nos. 31260508 and U1202226) and the Specialized Research Fund for the Doctoral Program of Higher Education (No. 20125317110001)