P2X7 受體與基因轉錄的關系①

習德娥 韓 莉 譚 超 楊曉東 (三峽大學第一臨床醫(yī)學院，宜昌4 430001)

核酸受體P2X7 在一些炎癥、骨和神經細胞中表達，被組織損傷、炎癥和感染部位釋放的ATP 激活后引起許多細胞反應如鈣離子內流、MAPK 活化、炎癥介質釋放和凋亡，是炎癥和神經系統(tǒng)疾病的一個有希望的治療靶點和潛在的生物標志物。許多研究把焦點集中于P2X7 受體在細胞死亡和介質處理中的作用(例如炎癥小體裂解IL-1 前體)，但是P2X7 受體與基因轉錄調控的關系很少有報道。這篇綜述重點介紹P2X7 受體與基因轉錄的關系。

1 P2X7 受體的結構和功能

P2X7 受體由595 個氨基酸組成，包含一個短的胞內N 端區(qū)域，2 次跨膜域，一個大的胞外配體結合域及一個對脂質和相應的胞漿蛋白表達有重要作用的胞內C 端結構域。此受體有N-連接糖基化位點，殘基N187 位于兩個會減弱P2X7 受體功能的單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphisms，SNPs)—E186K 和L191P 附近，其糖基化對細胞表面的受體表達和正常功能的發(fā)揮至關重要［1］。P2X7 受體還包括胞內的棕櫚酰化位點，這些位點與細胞膜的耐去污劑特性有重要關系［2］。P2X7 受體與其他的P2X 家族成員不同，其C 端尾比其他的P2X 受體至少長100 個氨基酸，是P2X 受體中促進非特異性孔道形成的受體之一。P2X7 的持續(xù)性激活導致可逆的孔道(允許分子量＜900 Da 的小分子通過)的形成。在某些特定的環(huán)境中，孔道形成與凋亡的誘導有關。最近研究發(fā)現P2X7 受體受到配體的短暫刺激后，將導致基因轉錄的改變而不是細胞死亡［3，4］。

2 P2X7 受體與基因轉錄因子

P2X7 的配體能夠刺激一些轉錄因子的表達、活化和/或核易位，這些轉錄因子包括早期生長反應家族(Egr-1、Egr-2 和Egr-3)成員、活化的T 細胞核因子(NFAT)，核因子-κB(NF-κB)家族成員，循環(huán)AMP 反應成分(CRE)結合蛋白(CERB)和AP-1 家族成員c-Fos，FosB，JunB。

2.1 Egr 早期反應因子(The early growth responsive gene，Egr)為重要的核轉錄因子，激活后與靶基因啟動子上特異的結合位點作用而調控下游靶基因的轉錄表達，參與從細胞的生長增殖到分化以及凋亡等相關的多種基因的表達。鋅指轉錄因子Egr-1、Egr-2、Egr-3 是在炎癥中扮演重要角色的早期基因，在許多細胞中促有絲分裂信號能誘導其表達［5］。Egr-1 基因編碼一個80～82 kD 的鋅指轉錄蛋白，通過與特異的DNA 序列或者與轉錄復合物上的轉錄調節(jié)物作用控制基因轉錄，參與細胞生長、增殖、分化和基質修復以及B 細胞和T 細胞的活化［6-8］，但Egr-2 和Egr-3 被認為促進T 細胞的失能［9］。最近有報道稱P2X7 配體促進這些因子的表達［10］。Stefano 等［11］使用表達P2X7 的HEK293細胞證實BzATP 能通過活化ERK1/2 和轉錄因子Elk-1 促進Egr-1 轉錄的上調，支持P2X7 的活化影響基因的轉錄這一觀點。Friedle 等［10］發(fā)現BzATP 能夠誘導N9神經膠質細胞和初級神經膠質細胞中Egr-1、Egr-2、Egr-3 的表達。Egr RNAi 導入N9 神經膠質細胞后，BzATP 誘導的IL-6 的表達減少，LPS 和BzATP 共同誘導的TNF-a 的產生也減少。而且，有報道發(fā)現Egr-1 使VEGF 在肺癌細胞中的表達成為可能［12］，暗示我們觀察到的人單核細胞中的P2X7 依賴性的VEGF 表達可能通過Egr-1 的活化產生。

2.2 NFAT 活化T 細胞核因子(Nuclear factor of activated T cells，NFAT)家族(NFAT1-5)被廣泛地發(fā)現于各種免疫細胞和組織中，調控許多炎癥介質的表達。NFAT 由胞漿中鈣離子的升高激活。細胞內鈣離子的增加激活鈣調蛋白，從而激活絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶、鈣神經素。鈣神經素使NFAT 去磷酸化，暴露核輸入序列，允許轉錄因子易位入細胞核，促進基因轉錄［13］。一些研究小組已經證明NFAT 由P2X7 受體調控，因此，核酸引起的此轉錄因子家族的活化可能是P2X7 受體調控免疫調節(jié)因子表達的一個重要機制。Yip 等［14］表明Jurkat T 細胞中的P2X7RNAi 減弱NFAT 的活化和由T 細胞活化因子誘導的IL-2 的轉錄。Adinolfi 等證明P2X 抑制劑(Ox-ATP)減少外源性表達P2X7 受體的HEK293 細胞上的NFAT1 的核表達。Kataoka 等［15］表明ATP激活MG-5 神經膠質細胞上NFAT1 的表達。Ferrari等［16］報道BzATP和ATP激活N9膠質細胞的NFAT。

2.3 NF-κB 核因子-κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)是一種具有基因轉錄多項調控作用的轉錄因子，能與多種細胞基因啟動子或增強子序列特定位點發(fā)生特異性結合而促進轉錄和表達，與炎癥反應、免疫應答以及細胞的增生、轉化和凋亡等重要的病理生理過程密切相關。NF-κB 通過與抑制劑κB(IκB)的結合以未活化狀態(tài)存在于胞漿中［17］。IκB被IκB 激酶(IKK)磷酸化后，NF-κB 進入核中，促進基因轉錄。NF-κB 調控大量的免疫調節(jié)基因的誘導，包括IL-6、IL-8、TNF-a、iNOS 和COX-2［18，19］。已有報道發(fā)現P2X7 激動劑刺激NF-κB 的易位和DNA結合。Ferrari 等表明ATP 能刺激鼠膠質細胞系N9和N13 上NF-κB 結合到DNA，抗氧處理能抑制這種結合。Budagian［20］等報道ATP 能刺激Jurkat T 細胞中NF-κB 與DNA 結合。Korcok［21］等證明BzATP 能誘導鼠破骨細胞中NF-κB 的核易位，但是P2X7 被敲除的小鼠的破骨細胞不能被誘導。BzATP 誘導鼠RAW 264.7 巨噬細胞和人外周血單個核細胞中NFκB 和DNA 結合［22］。

2.4 CREB cAMP 應答元件結合蛋白(cAMP response element binding protein，CREB)作為細胞核內調控因子，通過自身磷酸化實現調節(jié)功能，從而調控細胞周期［23，24］。亮氨酸拉鏈轉錄因子在控制許多細胞生理過程中起作用，包括糖內穩(wěn)態(tài)，細胞生存和炎癥介質產生。絲氨酸133 上CREB 的磷酸化通過CREB 結合蛋白(CBP)或者p300 刺激共活化，允許CREB 與cAMP 反應性基因的啟動子上的保守的CREB 反應元素(CREs;5'-TGACGTCA-3')結合。在一些免疫調節(jié)基因如IL-2、IL-6、IL-10 和TNF-a 的啟動子里含有CREB 位點［25］。P2X7 的活化能夠引起單核細胞上CREB 激活，用P2X7 激動劑BzATP刺激細胞后會導致依賴于ERK1/2 和鈣離子的絲氨酸133 位的CREB 磷酸化［4］。P2X7 配體會導致人外周血單個核細胞、人單核細胞株THP1、鼠巨噬細胞株RAW264.7 和外源性表達P2X7 受體的HEK293 細胞上的CREB 活化。P2X7 功能缺失的RAW264.7 突變株、RAWS324F 細胞在BzATP 刺激后并不表現出CREB 磷酸化，但是LPS 或anisomycin(p38MAPK 的激動劑)刺激后會導致CREB 活化。Potucek［26］等報道BzATP 能夠激活BV-2 膠質細胞的CREB。用CREB 陰性構建體抑制CREB 的活化后，AP-1 基因c-Fos 和FosB 的表達明顯減弱，這進一步支持P2X7 在基因表達轉錄調控中起作用［3，4］。

2.5 AP-1 AP-1(Activating protein 1)是一類由立即早期基因編碼的核轉錄因子，能被紫外光、生長因子和氧化應激等許多因素激活，調控對轉移、侵蝕、分化、缺氧、血管發(fā)生、增殖和凋亡有重要作用的基因的轉錄［27-29］。這個轉錄因子家族包括c-Jun、JunB、JunD、Fra-1、Fra-2、c-Fos、FosB、ΔfosB 以及與基因啟動子中AP-1 位點結合的由它們形成的二聚體［17，30］。AP-1 家族成員含有一個基本的亮氨酸拉鏈區(qū)，此區(qū)域對該成員與其他的AP-1 成員二聚化以及與DNA 結合有重要作用。具有轉錄活性的AP-1蛋白由一個Jun 蛋白和一個Fos 家族成員組成。正常條件下，AP-1 蛋白的濃度和活性極低，分子構成以Jun 同源二聚體為主。細胞受到刺激時，AP-l 蛋白水平短暫而迅速地升高，并轉變?yōu)橐詂-Fos、c-Jun異源二聚體為主要存在形式，DNA 連接和誘導轉錄的能力也隨之迅速升高;以后隨著半衰期較短的c-Fos 的降解，AP-1 又恢復至基礎水平和惰性狀態(tài)。我們和其他研究組均發(fā)現P2X7 配體能夠誘導AP-1轉錄因子的表達和活化［3］。P2X7 配體能夠較弱地誘導c-Fos 和FosB 的表達，但是能強烈的促進巨噬細胞和成骨細胞中FosB 和ΔFosB 的產生［3］，這些激動劑刺激FosB 蛋白與DNA 的結合。FosB 和ΔFosB 是2 個研究最少的AP-1 家族成員，但是越來越多的研究支持它們在炎癥、骨更新和神經功能中充當轉錄因子的角色。

3 ATP/P2X7/FosB 路徑

FosB 和ΔFosB 由一個PEST 區(qū)(富含脯氨酸、谷氨酸、絲氨酸、蘇氨酸的序列)、一個基本區(qū)和一個亮氨酸拉鏈組成。亮氨酸拉鏈是FosB 和Jun 相互作用的主要位點［31］。ΔFosB 是FosB 被截短后的接合突變體，是全長的FosB 的轉錄激活區(qū)域中的一部分，與FosB 相比，其C 端缺少101 個氨基酸。ΔFosB 被假設為藥物成癮發(fā)展過程中的一個“分子閘門”，對正常精神行為的維持至關重要。FosB 和ΔFosB 還具有許多功能，包括調控炎癥反應和骨形成的能力。

ATP/P2X7/FosB 路徑以前未被發(fā)現，現在我們發(fā)現其存在于單核細胞和成骨細胞中，參與多個免疫調控因子的轉錄調節(jié)。P2X7 配體(BzATP、ATP)瞬間刺激后會誘導外周血單核細胞、RAW264.7 巨噬細胞、鼠骨髓衍生的巨噬細胞、前成骨細胞系MC3T3-E1 和穩(wěn)定表達P2X7 的HEK293 細胞中FosB 和ΔFosB 的表達［3］。為了進一步證實P2X7介導FosB 和ΔFosB 的產生，使用最近研發(fā)的P2X7抑制劑進行對照試驗，發(fā)現P2X7 S342F 突變(會導致P2X7 功能缺失)的RAW 264.7 細胞上BzATP 介導的FosB 和ΔFosB 的產生明顯減少。BzATP 不能誘導P2X7 缺陷的細胞株的FosB 與DNA 結合。P2X7 拮抗劑A438079 使RAW 264.7 巨噬細胞上BzATP 誘導的FosB 和ΔFosB 的產生減弱。這些說明P2X7 在核酸刺激后引起FosB 和ΔFosB 的表達。引人注意的是，低水平的BzATP(5～30 μmol/L)不能激活P2X7 介導的大多數細胞通路，例如離子通道活化和孔道形成，但是能夠誘導FosB 和ΔFosB 的表達［3］，表明FosB 和ΔFosB 是反映P2X7 活動最敏感的兩個介質。BzATP 處理細胞1 h 后FosB 和ΔFosB 均表達，FosB 持續(xù)至少3 h，但是BzATP 處理RAW264.7 細胞8 h 后FosB 和ΔFosB 大幅度降解，這與大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞(PC12)中在用20%血清處理后8 h 內FosB 和ΔFosB 降解這一結果一致［32］。

4 結語

核酸受體P2X7 是炎癥反應的一個重要調節(jié)物，大量的研究支持P2X7 是炎癥時的一個有意義的治療靶點，P2X7 拮抗劑的研發(fā)將給臨床上炎癥性疾病如類風濕性關節(jié)炎的治療帶來希望。最近大量報道支持P2X7 誘導免疫調節(jié)基因的轉錄，為P2X7控制多個生理病理反應的機制提供新觀點。P2X7的生物學研究領域正在迅速地擴大，此受體與免疫調控、骨形成和神經功能有關的許多機制還有待研究。

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