高致病性流感病毒逃逸宿主固有免疫清除作用的機制

徐建青 (復旦大學生物醫(yī)學研究院 上海市公共衛(wèi)生臨床中心，上海 201508)

人類發(fā)展的歷史是與各種疾病，特別是與由病原微生物引起的傳染病進行斗爭的歷史。從中世紀肆虐于歐洲的黑死病到上世紀初奪走5000 多萬生命的歐洲西班牙大流感，及至八十年代開始的艾滋病的蔓延均注釋著人類繁衍生息所面臨的巨大挑戰(zhàn)。2003 年發(fā)生的席卷全世界的“非典”與2004 年后發(fā)生的禽流感，以及2009 年在美洲爆發(fā)并流行于全球的甲型H1N1 流感病毒與近期個案報道的MERS 更為人類敲響了警鐘。

自2013 年3 月以來，我國又面臨著一種新型H7N9 流感的嚴重威脅。該新型流感有如下特點:(1)感染后存在4～18 d 潛伏期(上呼吸道)，其后引起嚴重下呼吸道感染，約83%(76%～90%)的病人病情嚴重，其中老年人比例偏高，需要進ICU 和使用呼吸機［1，2］;(2)重癥病例抗病毒治療(達菲)療效差，達菲治療2 d 即可發(fā)生耐藥逃逸［3］;帕拉米韋的治療效果也有限。(3)有家庭聚簇感染發(fā)生，提示存在有限的人傳人的可能［4］;(4)H7N9 在禽類中致病性低，感染H7N9 的禽類很難被發(fā)現(xiàn)和清除;同時流感病毒片段基因具有易重組的特性，使H7N9有可能正跟當?shù)卦谇蓊愔袕V泛存在的流感病毒進一步重組［5，6］。

這些特性表明:H7N9 感染人的風險將持續(xù)存在，且目前治療手段的有效性依然有限，其致病機制依然不清。研究表明:引起呼吸道臨床重癥的病毒感染均出現(xiàn)“細胞因子風暴”現(xiàn)象，比如SARS、H5N1、MERS、H7N9 以及重癥的2009 H1N1 等。推測:這些病原體存在共性的致病機制，能夠誘導炎癥因子的產(chǎn)生而同時逃逸宿主固有免疫應答的攻擊。以H7N9 為模型，解析其逃逸宿主固有免疫應答清除作用的機制，將為了解其他高致病性呼吸道病毒的致病機制提供可能。

高致病性呼吸道病毒感染誘導的固有免疫應答:SARS 冠狀病毒感染呼吸道纖毛上皮與II 型肺泡上皮細胞［7，8］，重癥的ARDS 患者肺中常高表達IL-1、IL-6、IL-8、CXCL-10 及TNF-α［9］，但I 類干擾素與干擾素刺激基因(IFN-stimulated genes，ISGs)并未同水平上調［10］，因而，SARS 也被認為是固有免疫調控失衡性疾病。在靈長類動物攻毒前給予IFN-α，可以保護動物免于SARS 的致死性攻擊［11］。目前研究顯示，在SARS 冠狀病毒感染階段，模式識別受體通過MyD-88 通路活化的固有免疫應答具有保護作用［12］，下游干擾素受體通路JAK-STAT 通路也同樣不可或缺［13，14］;目前已經(jīng)鑒定出10 種病毒編碼蛋白具有拮抗干擾素通路的功能［15］。

2012 年新發(fā)的MERS 病毒具有極強致病性，死亡率在50%以上［16］;進一步研究顯示，MERS 膜蛋白能夠有效感染人不同組織的細胞(包括巨噬細胞)，但感染受體與已知的冠狀病毒所使用的受體無關［17］，病毒攜帶蛋白具有拮抗IRF3 介導的干擾素抗病毒作用［18］，表明MERS 具備人間傳播能力，且能夠調控人固有免疫應答。

對于流感的研究結果與SARS 冠狀病毒具有相似性。高致病性H5N1 或1918 大流感H1N1 的致病性與高炎性因子、低IFN 應答有關，其中NF-κB是高致病性病毒活化的核心信號通路［19］;小鼠模型中敲除IFN 通路的IFN-γ、MxA 基因均致流感病毒的致病性升高［20，21］。有意思的是，敲除TLR4-TRIF通路能夠保護小鼠免于H5N1 感染造成的肺損傷感染［22］、而在H5N1 攻擊小鼠前使用LPS 預先刺激小鼠，可激活TLR4-TRIF 通路，進而在H5N1 感染時上調TLR3 的表達，并起到保護作用［23］;數(shù)據(jù)表明，同樣是TLR4-TRIF 通路，感染前LPS 激活具有保護作用，而感染中病毒產(chǎn)物激活卻有損傷作用，提示通過預先調控固有免疫應答可以有效干預H5N1 的感染結局，病毒產(chǎn)物可異常調控固有免疫應答。靈長類動物模型研究顯示:流感病毒感染可以造成感染早期持續(xù)性的Ⅰ類干擾素、炎性因子與其他固有免疫應答基因的上調，其致病力與對這些因子上調的水平成正相關，同時發(fā)現(xiàn)H5N1 可感染Ⅱ型肺泡上皮，而致病力弱的病毒以感染Ⅰ型上皮為主［24］。由于靈長類動物模型尚缺少動態(tài)數(shù)據(jù)，目前我們尚難以了解感染極早期的固有免疫應答情況。小鼠模型研究證明:IL7RA 敲除鼠在流感感染中存活率更好、炎性/趨化因子應答減弱，但對病毒載量影響不明顯［25］。

上述研究表明，這些病原的感染可誘發(fā)固有免疫應答，呼吸道內的失衡型固有免疫應答(高炎癥因子、低干擾素)與致病性有關，免疫干預調控固有免疫應答能夠改變病程。

H7N9 感染誘導的固有免疫應答:研究也證明H7N9 病人發(fā)生了“細胞因子風暴”［26-29］，H7N9 所引起的細胞因子水平總體上跟H5N1 相當或者稍弱，但H7N9 可以誘導比H5N1 更多的MCP-1、MIP-1β、IL-6 和IL-8［27］。我們課題組比較了死亡組和幸存組病人入院早期的細胞因子水平，發(fā)現(xiàn)IL-6、IL-8、MIP-1β 的水平與病人的預后相關，細胞因子水平越高，預后越差;同時感染者血及肺盥洗液中IFN 水平極低［29］。同時，我們對病人干擾素誘導穿膜蛋白3 (Interferon induced transmembrane protein 3，IFITM3)相關的單核苷酸多態(tài)性(SNP)rs12252 的分析表明，相對于rs12252 T/T 病人組，rs12252-C/C病人病毒復制水平較高，細胞因子水平較高而且預后很差，2/3 的rs12252-C/C 病人使用了呼吸機或者ECMO［29］。上述數(shù)據(jù)表明:H7N9 的致病性可能與高水平炎癥因子、干擾素通路抑制病毒作用低下有關。

高致病性流感逃逸宿主固有免疫應答的機制:上述研究表明，重癥流感發(fā)生的機制是由于病毒上調炎癥因子分泌而抑制干擾素通路，從而突破宿主固有免疫系統(tǒng)的防御機制，導致肺內炎癥應答不斷加劇而致肺實變，出現(xiàn)呼吸窘迫綜合征。目前已有的研究表明，重癥流感可能在以下幾個環(huán)節(jié)中均可逃逸固有免疫系統(tǒng)的抑制作用:

(1)重癥流感病毒分路調控炎癥因子與干擾素:流感病毒可以通過NF-kB 通路激活炎癥因子的應答，但并不同時上調IFN 通路，尚不清楚流感病毒如何實現(xiàn)這種分別調控的。但這一調控模式可能是重癥流感逃逸宿主固有免疫應答的最重要機制。

(2)突破IFITM3 的限制作用:流感病毒通過受體介導的內吞作用進入內體，內體進入胞漿之后病毒包膜與細胞膜融合釋放出包含的病毒RNA(vRNA)進入胞漿，這一過程可以被IFITM3(IFN-inducible trans-membrane protein 3)分子介導的作用滯留而阻斷釋放［30］。但是，流感病毒均有能力突破這一限制而進入胞漿，其機制尚未闡明。

(3)抑制RIG 通路:進入胞漿的vRNA 可以被RIG-I 受體識別，從而激活RIG-I，導致RIG-I 被TRIM25 泛素化修飾，這一修飾是RIG-I 與下游的MAVS 結合所必需的過程［31］。流感病毒可以通過NS1(非結構蛋白1)抑制TRIM25，從而阻斷RIG-I通路的活化。

(4)上調SOCS3 抑制干擾素通路:通過上調SOCS3 分子以抑制干擾素通路是流感逃逸宿主固有免疫應答作用的重要機制［32］。SOCS(Suppressors of cytokine signaling)家族有8 個成員，通過分子SH2結構域與靶分子結合，將靶分子導向泛素化并降解，不同的病毒上調的SOCS 成員并不相同，其中流感病毒主要上調SOCS3，我們的研究表明:SOCS 家族的其他成員也參與到流感逃逸的機制中。

(5)逃逸MxA 等ISG 基因的抑制作用:干擾素通路激活后，宿主眾多的ISG 分子對病毒均有抑制作用。MxA 基因可通過使病毒RNP 多聚化成環(huán)，從而阻斷病毒RNP 入核復制［33］。流感病毒可以通過突變自身NP 而逃逸MxA 的限制作用［34］。

尚未闡明的問題:回答以下四個問題將有助于進一步闡明重癥流感病毒逃逸宿主固有免疫應答的機制:①重癥流感病毒分路調控炎癥因子與干擾素是如何實現(xiàn)的?②病毒是如何逃逸IFITM3 限制的?③病毒逃逸干擾素通路抑制作用是通過哪些SOCS家族成員實現(xiàn)的?是如何實現(xiàn)的?④應急應答與表觀調控在流感病毒逃逸宿主固有免疫應答中的作用?

上述問題的闡明將對新藥研發(fā)以及臨床的免疫干預奠定理論基礎。

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