甘肅麥積山區(qū)媒介及宿主動物中萊姆病螺旋體檢測及基因型別研究

張繼軍，張 芳，李 璐，劉增加

甘肅麥積山區(qū)媒介及宿主動物中萊姆病螺旋體檢測及基因型別研究

張繼軍，張 芳，李 璐，劉增加

目的 了解甘肅麥積山景區(qū)蜱及野鼠體內萊姆病螺旋體感染及其基因分型情況。方法 采用布旗法采集蜱標本，采用夾夜法捕捉野鼠。經種類鑒定后，提取病原體DNA,應用巢式PCR擴增鼠中萊姆病螺旋體5S-23S rRNA間隔區(qū)片段,對陽性產物進行限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)分析。結果 共檢測4個蜱種1 273只蜱標本，其中若蜱1 126只，成蜱147只,若蜱分組進行處理和檢測，共分為67組，其中13組檢測到萊姆病螺旋體DNA片段；成蜱15只檢測陽性。檢測4個鼠種42只野鼠，其中10只檢測陽性，不同鼠種陽性率存在差別(χ2=16.93,P=0.00)，4個鼠種中以大林姬鼠的陽性率為最高，達到33.33%?；蚍中头治鼋Y果顯示蜱及野鼠標本中萊姆病螺旋體為B.garinii及B.afzelii基因型,其中B.garinii基因型占78.95%。結論 麥積山景區(qū)存在萊姆病螺旋體，并至少有B.garinii及B.afzelii兩種基因型。

萊姆病螺旋體；基因型；限制性片段長度多態(tài)性；蜱；野鼠

萊姆病(Lyme disease)是一種新發(fā)現的蜱傳自然疫源性疾病，其病原體為伯氏疏螺旋體(Borreliaburgdorferi)，主要通過蜱媒在動物間傳播。人被攜帶病原體的蜱叮咬而感染，可引起皮膚、神經、心臟和關節(jié)等多器官、多系統(tǒng)的損害，嚴重者造成終生殘疾，甚至死亡[1]。我國自1986 年首次報道發(fā)現萊姆病以來，血清流行病學調查表明至少在27 個省(市、自治區(qū))的人群存在伯氏疏螺旋體感染，病原學證實其中18 個省(市、自治區(qū))存在萊姆病自然疫源地，9種蜱攜帶伯氏疏螺旋體，牛、羊、狗、野兔和8 種野鼠有自然感染[2-8]。萊姆病在我國不僅嚴重危害著人們的健康，而且對農、林業(yè)經濟的發(fā)展、國防建設和旅游資源的開發(fā)都帶來不利的影響。甘肅西部及南部(甘南)地區(qū)廣泛存在伯氏疏螺旋體感染的人群及疫源地[9]，為了解天水市郊麥積山旅游區(qū)是否存在萊姆病，我們于2013年5月至2014年8月對麥積山景區(qū)作了萊姆病調查研究。

1 材料和方法

1.1 標本的采集 調查點為甘肅省天水市郊麥積山地區(qū)，采樣時間為 2013年5月。

1.2 標本的采集 蜱標本采用布旗法，分類鑒定后保存待用。鼠標本采用夾夜法，即傍晚時分放鼠夾第2 d清晨收回的方法，誘捕不同生境下的野鼠。所獲標本經鼠種鑒定后現場無菌解剖，取組織置-20 ℃保存待用。

1.3 細菌DNA的提取

1.3.1 鼠標本中病原體DNA的提取 經鼠種鑒定后，無菌操作剪取約3 mm3(約500 mg)大小的脾組織，置滅菌研磨器中加入Trizol，充分研磨后移入Eppendorf管中；通過離心分離去除RNA后，通過2次洗滌(0.1 mol/L檸檬酸鈉10%乙醇溶液)后獲得DNA沉淀，然后將其懸于75%酒精中靜置10～20 min。2～8 ℃,2 000×g離心5 min,然后將DNA沉淀溶于8 mmol/L NaOH溶液中，4 ℃過夜。最后將提取好的DNA溶于TE(0.01 mol/L,pH 8.0)中，紫外分光光度計測量DNA濃度及純度后置-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 蜱標本中病原體DNA的提取 經蜱種鑒定后，用75%酒精浸泡20 min后，用無菌濾紙吸干，再用生理鹽水，漂洗3次，用無菌濾紙吸干蜱體表水份后，置EP管中，加入DNA提取緩沖液(10 mmol/L Tris,pH 8.0,2 mmol/L EDTA,0.1% SDS,500 μg of proteinase K/mL) 200 μL,用滅菌的槍頭進行充分研磨, 后56 ℃孵育2 h, 置沸水中煮10 min 后置-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 萊姆病螺旋體的檢測 采用巢式PCR法，PCR反應總體積為20 μL,包括10 ×PCR緩沖液2 μL,引物濃度均為12.5 μmol/L，體積0.4 μL,dN TP為10 mmol/L,體積為0.4 μL，Taq DNA聚合酶0.4 μL(2.5 U/μL)，第1輪擴增用2 μL模板,第1輪產物1 μL作為第2輪的模板,用無菌雙蒸水補足20 μL。第1、2輪擴增的退火溫度分別為55 ℃和59 ℃。取PCR產物5 μL,用1.5 %的瓊脂糖膠電泳,溴化乙錠染色,于紫外燈下觀察結果。為避免污染引起假陽性反應,標本制備、反應液制備、擴增實驗和產物的電泳及觀察均在不同的房間進行；加樣與體系配制移液器分開專用；同時每次實驗都設立空白(水)對照。

1.5 RFLP分析 取陽性標本的PCR產物5 μL,用限制性內切酶Mse I (10 000 U/ mL ; New England Biolabs) 于37 ℃酶切9 h,酶切反應總體積為20 μL,其中限制性內切酶MseI 0. 5 μL, 2 μL 的10 ×NEB緩沖液,用無菌雙蒸水補足20 μL。酶切后65 ℃滅活20 min，酶切產物用5 %瓊脂糖凝膠進行電泳分離片段。

2 結 果

2.1 蜱中萊姆病螺旋體感染情況 共采集森林革蜱、草原革蜱、達吉斯坦革蜱及青海血蜱4個蜱種1 273只蜱標本，其中若蜱1 126只，成蜱147只。將若蜱按不同種類每20只左右為1組進行處理和檢測，共分為67組，有13組檢測到萊姆病螺旋體DNA片段。147只成蜱共包括4個蜱種：森林革蜱、草原革蜱、達吉斯坦硬蜱及青海血蜱，其中15只檢測陽性，成蜱總陽性率為10.20%，成蜱中不同蜱種陽性率未見明顯差別。

2.2 鼠標本中萊姆病螺旋體感染情況 共捕獲大林姬鼠、黑線姬鼠、小林姬鼠及灰倉鼠4個鼠種42只野鼠，其中10只檢測陽性，總陽性率為23.80%，不同鼠種陽性率存在差別(χ2=16.93,P=0.00)，4個鼠種中以大林姬鼠的陽性率為最高，達到33.33%，具體見表1。

2.3 陽性標本中萊姆病螺旋體基因型 對15只PCR檢測陽性的成蜱標本及10份野鼠標本的5S-23S rRNA 基因間隔區(qū)片段進行基因分型，15份蜱標本中9份標本成功分型，所有陽性鼠標本均得到預期結果。陽性標本經Mse I 酶切后共產生3種酶切帶型：107,95,51、107,57,51,38及107,68,51,20，其中前兩種帶型屬于B.garinii基因型，后者屬于B.afzelii基因型。19份標本中15份屬于B.garinii基因型，占78.95%，其中：鼠標本9份，蜱標本6份；4份為B.afzelii基因型：蜱標本3份，鼠標本1份。不同基因型在不同標本中的分布見表2。

3 討 論

萊姆病是一種人獸共患病，主要通過其傳播媒介的吸血活動在動物及人間傳播，現已查到全溝硬蜱、嗜群血蜱、長角血蜱、二棘血蜱、臺灣角血蜱、微小牛蜱、粒形硬蜱、森林革蜱等9種蜱攜帶萊姆病螺旋體?，F已證實在我國北方林區(qū)全溝硬蜱是主要生物媒介，南方林區(qū)的粒形硬蜱和二棘血蜱是重要的傳播媒介。有關西北地區(qū)萊姆病螺旋體的主要傳播媒介目前尚未定論，雖然已有相關研究從森林革蜱、草原革蜱體內檢測到病原體DNA，但傳播動力學實驗不支持其媒介作用，因此無法準確確定其在疾病傳播過程中的地位，目前尚不清楚西北地區(qū)萊姆病螺旋體的主要媒介蜱種。本研究從天水市區(qū)麥積山景區(qū)進行選點采樣，捕獲了大量的不同發(fā)育階段的蜱標本，不僅從4種成蜱(森林革蜱、草原革蜱、青海血蜱及達吉斯坦硬蜱)體內檢測到病原體DNA，亦從若蜱組(森林革蜱、草原革蜱及青海血蜱)中檢測到目的片段，值得注意的是本研究中，對青海血蜱是首次從成蜱及若蜱體內同時檢測到目的片段，這在一定程度上可能能說明了該蜱種在甘肅省境內，至少是在調查點內具有充當傳播媒介的潛能，在今后的工作中我們將對其進行進一步實驗驗證。

萊姆病螺旋體的儲存宿主比較多，北美東部主要是白足鼠，其次是花粟鼠、松鼠、地鼠和鹿鼠，其它嚙齒動物也可做為主要貯存宿主，如稻田鼠、棉鼠、棉小鼠、棉尾兔等。我國已從黑線姬鼠、大林姬鼠、小林姬鼠、花鼠、普通田鼠、白腹鼠、白腹巨鼠、社鼠、黃毛鼠、褐家鼠和華南兔等嚙齒動物中分離到萊姆病螺旋體，從自然種群數量和感染率分析，我國北方萊姆病主要貯存宿主可能是姬鼠類。本研究捕獲的野鼠主要為姬鼠類，占78.57%，經檢測3種姬鼠(大林姬鼠、黑線姬鼠、小林姬鼠)均攜帶有病原體DNA，事實上前期我們在甘肅境內(迭部地區(qū))開展的相關工作亦有類似結果，本研究中大林姬鼠的陽性率為最高，達到33.33%，在一定程度上顯示出了大林姬鼠作為貯存宿主的作用，后期我們將對其重點開展病原體分離工作，以驗證其作為貯存宿主的作用。

不同地域的伯氏疏螺旋體菌株具有遺傳多態(tài)性和抗原異質性，目前伯氏疏螺旋體至少分為10個普遍公認的基因型，其中4個為致病基因型。在我國至少存在4個基因型的伯氏疏螺旋體，包括3個致病基因型Borreliaburgolorferisensustricto(B.b.s.s.),B.garinii(B.g.)，B.afzelii(B.a.)和一個非致病基因型B.valaisiana(B.v.)。不同基因型的病原體與地理分布，傳播媒介分布、宿主、臨床表現甚至是診斷方法的建立和疫苗研制都密切相關。因此對伯氏疏螺旋體基因型的甄別鑒定對流行病學、臨床診斷和治療以及疫苗研制等多個方面具有重要的指導意義。伯氏疏螺旋體的 5S-23S rRNA 基因間隔區(qū)是高變區(qū)，積累了較多的型間變異，這一片段的PCR/RFLP 分析快速簡便，已廣泛用于伯氏疏螺旋體的基因分型。基于該方法，本研究樣本中萊姆病螺旋體有兩種基因型，B.garinii(B.g.)，及B.afzelii(B.a.)，這兩種基因型是重要的致病基因型，由此我們可以推斷當地居民或游客有受感染的機會，由于該調查點為重要的旅游景區(qū)，且當地氣候溫潤，一年四季該地游人如織，該病應引起當地衛(wèi)生部門的重視，相關的人群血清學及流行病學應開展。兩種基因型中，B.garinii基因型雖然在數量上占多數，但不能說B.garinii基因型就是當地的主要基因型，因為研究中部分標本分型并不成功，另外本研究中標本數量有限，而且目前我們尚未從該地分離獲得萊姆病螺旋體菌株，因此也無法建立起基因型與蜱種、野鼠種類間的聯(lián)系。

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Borrelia burgdorferi infection and their genotypes in ticks and rodents collected from Maijishan region, Gansu Province, China

ZHANG Ji-jun,ZHANG Fang,LI Lu,LIU Zeng-jia

(Center for Disease Control and Prevention of Lanzhou Command, Lanzhou 730020, China)

We investigatedBorreliaburgdorferiinfection in ticks and rodents captured in Maijishan region and identified their genotypes in this study. Ticks were collected by dragging a cloth over the vegetation, rodents were collected by snaps. After species identification, DNA of pathogen was isolated from samples and detected by nested PCR targeting 5S-23S rRNA intergenic spacer ofBorreliaburgdorferi. Positive samples were further analysed by restriction fragment length polymorphism (RFLP). Results showed that a total of 1 273 ticks including 1 126 nymphal ticks and 147 adult ticks in 4 species; 42 rodents including 4 species were tested for evidence ofBorreliaburgdorferiby nested PCR; 15 adult tick samples, 9 rodents samples and 13 groups of nymphal ticks showed positive. The positive rates were different among the different rodent species, withApodemusagrariushaving the highest positive rates. RFLP analysis indicated thatBorreliaburgdorferiin samples belonged to the genotype eitherB.gariniiorB.afzelii. It's suggested thatBorreliaburgdorferiexists in Maijishan region and there were at least two genotypes.

Borreliaburgdorferi; genotype; restriction of fragment length polymorphism (RFLP); tick; rodents

Liu Zeng-jia, Email:lzj540125@126.com

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.04.014

劉增加，Email：lzj540125@126.com

蘭州軍區(qū)疾病預防控制中心, 蘭州 730020

R377

A

1002-2694(2015)04-0357-04

2014-08-21；

2015-03-17

全軍科研計劃“十一五”專項課題(08Z003)、蘭州軍區(qū)指令性課題(LZ13GY11)和甘肅省科技支撐計劃(1011FKCA154)

Supported by the Eleventh Five-Year Plan for Medical Science Development of PLA (No. 08Z003), the Special Funds for Military Medical Research of Lanzhou Military Command(No.LZ13GY11),Supporting Program for Sci Tech Research of Gansu Province(No. 1011FKCA154)