腸道病毒71型VP1蛋白研究進展

張志勤，項國仕(綜述)， 黃孝天(審校)

腸道病毒71型VP1蛋白研究進展

張志勤，項國仕(綜述)， 黃孝天(審校)

腸道病毒71型(Enterovirus71，EV71)為手足口病的主要病原體。目前，手足口病的發(fā)病機制并不完全清楚，臨床上缺乏有效的疫苗及特異性治療藥物。作為EV71主要衣殼蛋白，VP1在EV71的吸附和穿入過程中起著重要作用。另一方面，VP1上存在特異性中和性抗原表位，在EV71疫苗研究中占有重要地位。本文主要概括EV71 VP1結構、功能及與之相關疫苗的研究進展。

手足口病;腸道病毒71型;衣殼蛋白

據2013年國際病毒分類委員會最新分類，EV71屬于小RNA病毒科腸道病毒屬A種腸道病毒。病毒顆粒呈球形, 無包膜, 衣殼為二十面體立體對稱, 由60個相同的亞單位構成, 每個亞單位均包含VP1、VP2、VP3、VP4四種結構蛋白。EV71為手足口病的主要病原體之一，由EV71引起的手足口病大部分是輕微及自限性的，但仍有部分患者的病情進展為重癥神經系統(tǒng)疾病及致命性腦炎。Yu[1]等通過2008-2012年中國手足口病流行病學調查顯示，80%以上的重癥病例以及90%以上的死亡病例由EV71感染所致。VP1作為EV71的結構蛋白，且EV71主要的中和抗原決定簇集中于VP1上，因此具有重要的研究意義。

1 EV71 VP1結構

EV71 VP1蛋白包含297個氨基酸(amino acid, aa)，大小為32 kD。晶體結構顯示，VP1具有 “果凍卷”型的β-桶狀結構，這種桶狀結構包括8個β-折疊，分別排列于2個β-片層中，每個片層包含4個β折疊，其中1、8、3、6 β-折疊 形成一個β片層，而2、7、4、5 β-折疊形成另外一個β片層。VP1中還包括另一個重要的結構：疏水性口袋因子。此結構在EV71和其他腸道病毒中存在不同，在EV71中，口袋因子有約40 ?2的表面積，主要暴露在VP1五聚體周圍的峽區(qū)的表面，并經VP1 β桶狀結構直達深處，其中包含天然脂質成分[2-3]，而在其他腸道病毒中，口袋因子是被完全包埋的。病毒表面，VP1 β桶狀結構區(qū)存在一個深凹，此凹陷被認為是EV71病毒的粘附位點，也被稱為峽谷樣結構(canyon)[4]。EV71衣殼內表面結構與其他腸道病毒也存在差異，這種差異通常表現(xiàn)在VP1上，腸道病毒中VP1第1-28 aa通常朝向五重旋轉對稱軸，而在EV71中轉向了另一側。

小RNA病毒中可變性最強的結構為暴露于病毒表面的莖環(huán)結構(loop)，EV71病毒中VP1上存在BC、DE、βE/αB、GF、GH、HI等6個莖環(huán)結構，其中BC、DE及HI莖環(huán)結構為扁平并遠離二十面體的五重旋轉對稱軸，BC(96-102 aa)及GH 莖環(huán)結構(208-222 aa)是暴露于最外圍的[3]，此外DE莖環(huán)結構和EF莖環(huán)結構定位于峽谷樣結構表面，由于EV71 VP1的莖環(huán)結構比其他腸道病毒的更小，導致了EV71的峽谷樣結構比其他的腸道病毒更淺[5]。Chen等報道EV71安徽阜陽株與EV71-1095株VP1的GH環(huán)狀結構存在不同，而SCARB2的結合域VP1第172位aa(位于峽谷樣結構區(qū))卻沒有觀察到不同[6]，這表明在不同的EV71病毒株間峽谷樣區(qū)域可能保守。

2 EV71 VP1功能

EV71 VP1與其他腸道病毒及其他小RNA病毒結構上的差異均可能導致其功能獨具特性。EV71 VP1作為病毒結構蛋白，其主要功能為協(xié)助病毒感染，結合細胞受體。目前，包括多個與EV71相互作用的細胞受體被鑒定[7-12]，其中與VP1相關的包括清道夫受體B2(Scavenger receptor class B, member 2,SCARB2)、選擇素P糖蛋白配體1(P-selectin Glycoprotein Ligand,PSGL-1)、人膜聯(lián)蛋白II(human annexin II,Anx2)以及硫酸乙酰肝素類糖胺聚糖(Heparan Sulfate Glycosaminoglycan)。SCARB2是主要表達于核內體及溶酶體膜的III型糖蛋白，EV71與SCARB2的作用是通過結合到VP1的Gln-172周圍的canyon結構來達到病毒感染的目的，SCARB2的第4個外顯子與這種相互作用有關，尤其在酸性條件下，這種作用使完整的病毒體(160S)變成135S的A顆粒，A顆粒被認為是完整病毒體與脫殼后病毒的中間物[7]。PSGL-1表達于骨髓細胞及受激后的T淋巴細胞，作為細胞粘附因子P、E、L高親和性配體，EV71 VP1與白細胞PSGL-1的相互作用由VP1-145的分子開關控制，病毒表面賴氨酸與硫酸化PSGL-1的N-末端酪氨酸相互作用，而VP1-145作為一個開關，通過調節(jié)VP1-244K的轉向來調控VP1與PSGL-1的結合，這種作用使EV71更傾向與表達PSGL-1的白細胞結合。同時PSGL-1與白細胞遷移，細胞因子產生及免疫反應的調控有關[8,11]，這可能介導病毒在體內的播散，此外過度炎癥因子的產生，將導致嚴重疾病的發(fā)生。Anx2是膜聯(lián)蛋白家族的一員。其除通過鈣離子結合區(qū)域(α螺旋核心區(qū)域)與磷脂膜的相互作用外,還與多種細胞因子作用參與調節(jié)細胞功能,如內吞及胞吐等過程。在EV71感染過程中，Anx2則是通過與EV71 VP1上第40-100位 aa相互作用來增加病毒感染能力的，這種相互作用在低感染劑量時尤為明顯[10]。Tan[12]等研究表明表達于細胞表面的糖胺聚糖中的硫酸乙酰肝素也能作為EV71受體，使用多聚賴氨酸中和細胞表面陰離子及通過抗硫酸乙酰肝素多肽封閉細胞表面硫酸乙酰肝素均能抑制EV71的感染，同時他們還使用三維建模來了解EV71上硫酸乙酰肝素可能的結合位點?？傊珽V71通過不同的受體感染不同細胞。

除結合宿主受體外，EV71 VP1還能自身結合形成二聚體，形成這種二聚體的主要活性區(qū)域位于第66-132位 aa。VP1二聚體的形成導致其三級結構更加穩(wěn)定，同時使病毒衣殼蛋白的結構更加簡潔緊湊，這有助于病毒的穿入及釋放[13]。

另外，有研究表明[14]，VP1能激活鈣調素依賴性蛋白激酶II(calmodulin-dependent protein kinase II ,CaMK-II)。CaMK-II存在于許多動物細胞內，尤其在神經組織中含量豐富。正常生理狀態(tài)下，CaMK-II在轉錄調節(jié)、骨架蛋白的磷酸化以及學習記憶等過程起重要作用。EV71感染后，CaMK-II磷酸化波形蛋白(Vimentin)N端第82位絲氨酸，而波形蛋白的磷酸化及aggresomes的形成是病毒復制所需要的。具體的作用模式為：被EV71感染的細胞內合成的VP1蛋白介導了CaMK-II Thr286的磷酸化激活CaMK-II，激活的CaMK-II再磷酸化波形蛋白細絲(filament)Ser82，引起波形蛋白細絲的分解，VP1結合被分解的波形蛋白并被轉運至核周開始形成病毒復制中心。復制中心的形成為病毒基因組的合成提供平臺，這表明VP1在病毒復制過程中扮演著重要的角色。

此外，VP1還能與乳鐵蛋白(Lactoferrin,LF)相互作用[15]，研究發(fā)現(xiàn)LF能抑制EV71感染，具體作用機制可能為LF封閉細胞受體或者直接與病毒顆粒結合，從而防止病毒結合受體進入細胞引起感染。盡管LF未被批準作為治療EV71的藥物，但可將其考慮為抑制病毒進入細胞的一種藥物，輔助治療EV71感染。

EV71 VP1晶體結構及其在基因型間的差異[2-3, 16]均有報道，而一些有關VP1在EV71病毒生物學行為中的作用也提出相應的模式，如作為RNA釋放的傳感器[3]等，而這些模式的確證都需要我們通過更多的實驗來證實。

3 EV71 VP1相關疫苗研究

EV71疫苗研究涉及滅活疫苗、減毒活疫苗、DNA疫苗、重組疫苗、多肽疫苗等。而VP1作為主要抗原蛋白則多應用于抗原表位疫苗、重組疫苗研究，目前已經有許多研究[17-23]在動物水平證實了VP1蛋白及其多肽能有效的預防EV71感染。

抗原表位疫苗方面，Guang等[22]應用覆蓋VP1全長的95條合成多肽免疫小鼠，獲得2個保守的線性化的中和抗原表位SP55 ( 163～177 aa)和SP70 (208～222 aa)，這兩個表位在不同的EV71基因亞型間高度保守，尤其是SP70，幾乎在所有EV71基因亞型間均相同，表明其可作為開發(fā)EV71疫苗的抗原表位。此外，Lim等[23-24]發(fā)現(xiàn)VP1最小抗原決定簇位于215-219 aa及N端12-19 aa。重組疫苗方面，Chen等[18]用轉基因鼠(VP1+/+)產的包含VP1蛋白的奶，喂養(yǎng)腹腔注射EV71的幼鼠，發(fā)現(xiàn)外源VP1蛋白能起到保護幼鼠作用，表明VP1口服疫苗在理論上是有效和可行的。在重組VP1蛋白疫苗研究方面，Cao[17]等用枯草桿菌作為載體將VP1融合其衣殼蛋白COTB蛋白生產表達VP1蛋白的疫苗，結果表明重組的疫苗能引起細胞及體液免疫，這為低成本的疫苗制備提供了線索，同時Chen[25]等利用轉基因西紅柿表達EV71 VP1蛋白作為口服疫苗，實驗證實，在BALB/C小鼠糞便中能檢測到VP1特異性IgA同時血液中也能檢測到VP1特異性IgG，且服用此口服疫苗的小鼠的血清能抑制EV71對橫紋肌肉瘤細胞(RD cells)的感染，這為轉基因西紅柿作為口服疫苗來預防EV71的可行性提供了實驗及理論基礎。

4 展 望

在EV71感染過程中，VP1蛋白承擔著重要的角色，參與吸附、穿入、脫殼等過程，實驗研究表明針對VP1設計的疫苗能保護實驗動物，能抑制EV71感染或減輕感染后癥狀，這為EV71疫苗開發(fā)提供了實驗及理論基礎。

至今仍未有EV71特效藥及有效的疫苗應用于臨床，加速EV71致病機制的研究及有效疫苗的開發(fā)將成為EV71研究的一項重要內容。欣慰的是，中國已研制出的滅活疫苗并對疫苗III期臨床試驗階段的療效、安全性及免疫原性做了詳細的評估[26-27]，這將為我們抵御這種傳染病提供有力的武器。

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Research progress of enterovirus 71 VP1

ZHANG Zhi-qin,XIANG Guo-shi,HUANG Xiao-tian

(Department of Medical Microbiology, Medical School of Nanchang University, Nanchang 330006, China)

Enterovirus 71 (EV71) is a major causative factor of hand, foot and mouth disease (HFMD). Currently, the mechanism of HFMD is not clearly understood, and neither vaccine nor antiviral therapy is available. As a capsid protein of EV71, VP1 plays an important role during the adsorption and penetration of EV71. The presence of the VP1-specific neutralizing epitopes makes it an important position in the EV71 vaccine research. This review article provides a summary of the structure, function and associated vaccine of EV71 VP1.

hand-foot-mouth disease; enterovirus 71; capsid protein

Huang Xiao-tian, Email:xthuang@ncu.edu.cn

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.04.018

國家自然科學基金(No. 81160196)，江西省青年科學家培養(yǎng)項目(No.20133BCB23005)

黃孝天，Email: xthuang@ncu.edu.cn

南昌大學醫(yī)學院微生物學教研室，南昌 330006

R373.2

A

1002-2694(2015)04-0377-03

2014-08-31；

2015-01-30

Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 81160196) and the Young Scientists Training Program of Jiangxi Province (No. 20133BCB23005)