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    中國(guó)小腸結(jié)腸炎耶爾森菌流行現(xiàn)狀及其研究進(jìn)展

    2015-01-25 05:52:25陳鄔錦綜述審校
    關(guān)鍵詞:耶爾森血清型毒力

    陳鄔錦(綜述),王 鵬(審校)

    中國(guó)小腸結(jié)腸炎耶爾森菌流行現(xiàn)狀及其研究進(jìn)展

    陳鄔錦1(綜述),王 鵬2(審校)

    小腸結(jié)腸炎耶爾森菌在我國(guó)分布廣泛,存在一定的地域、人群、時(shí)間等流行病學(xué)差異。隨著我國(guó)分子流行病學(xué)的發(fā)展,許多基于分子、核酸水平的新技術(shù)及新方法不斷被運(yùn)用在小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的病原生物學(xué)研究中。本文針對(duì)目前我國(guó)小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的人群間、動(dòng)物間及不同時(shí)間、地區(qū)間的流行病學(xué)差異、病原生物學(xué)研究、主要分子分型及毒力基因研究進(jìn)行綜述。

    小腸結(jié)腸炎耶爾森菌;流行現(xiàn)狀;分子分型;毒力基因

    耶爾森氏菌屬中致病性菌主要有鼠疫耶爾森菌、假結(jié)核耶爾森菌以及小腸結(jié)腸炎耶爾森菌[1]。其中小腸結(jié)腸炎耶爾森菌(Yersiniaenterocolitica,簡(jiǎn)稱Y.e)是一種人獸共患病原細(xì)菌,廣泛分布于自然界,可感染家畜、家禽、嚙齒類動(dòng)物、鳥類及昆蟲等,也是少數(shù)能在冷藏溫度下生長(zhǎng)的腸道致病菌之一。該菌主要通過(guò)糞口途徑傳播。海產(chǎn)品、蛋類、鮮(生)奶及市售糕點(diǎn)、飲料、速(冷)凍食品中均曾檢出小腸結(jié)腸炎耶爾森菌[2-3];在家用、餐館及醫(yī)院冰箱中也曾檢出小腸結(jié)腸炎耶爾森菌[4]。該菌不僅能引起腹瀉等消化道疾病,還能引起呼吸系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、骨骼、結(jié)締組織和全身性疾病。

    中國(guó)在20世紀(jì)80年代曾有過(guò)兩次小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的流行[5],第1次于1986年發(fā)生在蘭州市某奶牛廠,發(fā)病107人,從患者排泄物和食物中分離出的小腸結(jié)腸炎耶爾森菌為生物3型、血清O∶3型。另一次于1987年發(fā)生在沈陽(yáng)市某中學(xué)學(xué)生食堂,造成500余人被感染,從352名患者排泄物和食物中分離出的小腸結(jié)腸炎耶爾森菌為生物3型、血清O∶9。

    1 流行現(xiàn)狀

    1.1 宿主分布 小腸結(jié)腸炎耶爾森菌病作為一種人獸共患病其動(dòng)物宿主廣泛,目前已發(fā)現(xiàn)30多種動(dòng)物攜帶小腸結(jié)腸炎耶爾森菌[6]。其中主要有豬、牛、羊、雞、鼠、兔、鴨、蒼蠅、犬、鵝、及部分禽類和嚙齒類動(dòng)物,在諸多動(dòng)物中有資料證實(shí)對(duì)人類威脅最大的動(dòng)物是豬[3,7]。有研究者從冷庫(kù)存放的凍肉中及鮮肉中檢出小腸結(jié)腸炎耶爾森菌,其中以豬肉和豬舌染菌率最高[8]。Liang Junrong等2009-2011年通過(guò)對(duì)我國(guó)11個(gè)省份屠宰廠豬的不同部位收集到8 773份樣品中檢出的小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的流行趨勢(shì)做了分析。研究發(fā)現(xiàn)屠宰廠中豬舌咽部總帶菌率最高為19.53%(878/4 495),其次為腸內(nèi)容物為7.51%(93/1 239),相對(duì)較少的為豬的糞便為5.3%(161/3 039),通過(guò)此次調(diào)查發(fā)現(xiàn)我國(guó)北方屠宰場(chǎng)中豬的帶菌率高于南方[9]。于恩庶等從福建自然界中捕獲的蟑螂分離出了O∶3型小腸結(jié)腸炎耶爾森菌,能在蟑螂體內(nèi)帶菌1個(gè)月以上,并能從糞便排出,所以蟑螂既可作為本菌攜帶者,亦可作為傳播媒介[5]。除此之外蒼蠅感染該菌也非常普遍,感染率在達(dá)1%~2%,多為O∶3型毒力株,體內(nèi)帶菌時(shí)間長(zhǎng)于體表,同樣具有傳播作用[6]。

    1.2 地區(qū)分布 小腸結(jié)腸炎耶爾森菌在中國(guó)分布廣泛,目前開展了小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的相關(guān)工作的19個(gè)省市直轄市都分離出了病原[6,9],其中云南、寧夏、青海等13個(gè)省份對(duì)小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的報(bào)道均來(lái)自鼠疫耶爾森菌的疫源地。致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌在中國(guó)的分布有一定的地域性,研究表明[10],我國(guó)北方寒冷地區(qū)及東南沿海的福建省分離到的小腸結(jié)腸炎耶爾森菌株中,致病性菌株比例較高,而華東幾省分離到菌株中以非致病菌株較多,尤其安徽、山東兩省至今尚未發(fā)現(xiàn)致病性菌株。各個(gè)分離到的致病性菌株中,O∶3與O∶9血清型菌株的比例也有所不同。

    2 研究進(jìn)展

    小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的研究主要有生物分型、分子分型、診斷及其毒力因子等幾個(gè)方面。生物型與血清型仍然是描述小腸結(jié)腸炎耶爾森菌病原學(xué)特征的基本指標(biāo)[11]。目前發(fā)現(xiàn)世界上小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的血清型有60多個(gè)(我國(guó)報(bào)道58個(gè)血清型),其中O∶3、O∶9、O∶5,27、O∶8、O∶13a、O∶13b、O∶20、O∶21等血清型對(duì)人有毒力,我國(guó)僅存在O∶3和O∶9兩種血清型致病菌株[12]。小腸結(jié)腸炎耶爾森菌可分為6種生物型:1A、1B、2、3、4、5型,其中生物1A型均為非致病性菌株[13],而生物1B、2、3、4、5型中大多數(shù)為致病性菌株。

    2.1 分子分型 小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的分子分型種類繁多,應(yīng)用也較為廣泛。如:Neubauer等建立的16SrRNA序列分析及限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP),F(xiàn)earnley等建立的擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(AFLP),Itema等建立的核糖體分型(RT)等諸多分型方法,Duan R等在中國(guó)建立了多位點(diǎn)序列分析(MLST)及Wang X等在中國(guó)建立了多位點(diǎn)串聯(lián)重復(fù)序列(MLVA)等[14-16]。而目前我國(guó)應(yīng)用最多的為PFGE及MLVA。

    2.1.1 脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE)分型 PFGE具有很好的分辨能力,為小腸結(jié)腸炎耶爾森菌分型的金標(biāo)準(zhǔn)[11]。通常使用NotΙ限制性內(nèi)切酶對(duì)細(xì)菌核酸進(jìn)行剪切,剪切片段經(jīng)過(guò)分析后在小腸結(jié)腸炎耶爾森菌研究中起到菌株的溯源作用。金東等通過(guò)PFGE研究發(fā)現(xiàn)該菌具有一定的遺傳多態(tài)性[16]。目前我國(guó)已建立起中國(guó)小腸結(jié)腸炎耶爾森菌PFGE分型的數(shù)據(jù)庫(kù),其中致病性O(shè)∶3血清型菌株可分成33個(gè)PFGE型別(K6GN11C3001~K6GN11C3033),而致病性O(shè)∶9血清性菌株可分成25個(gè)PFGE型別(K6GN11C9001~K6GN11C9025)。

    對(duì)我國(guó)人感染菌株和動(dòng)物進(jìn)行PFGE分型后提示人感染的小腸結(jié)腸炎耶爾森菌病菌可能來(lái)自該地區(qū)動(dòng)物所攜帶的病菌[17-18]。王增國(guó)等將攜帶ystB基因生物1A型的250株菌分成了167個(gè)PFGE型別[19]。孫文魁等對(duì)我國(guó)山東A1型小腸結(jié)腸炎分子亞型的研究發(fā)現(xiàn)73株菌中可分為54個(gè)PFGE型別(K6GNllSD0001~K6GNIISD0054)[20]。

    2.1.2 多位點(diǎn)可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列(MLVA) MLVA是基于多重PCR技術(shù)上新發(fā)展起來(lái)的一種分子生物學(xué)方法[21],MLVA具有較高的分辨率,且能在細(xì)菌的地理分布方面提供較好的溯源證據(jù)。其原理是在分離的DNA樣本中,根據(jù)待測(cè)序列來(lái)確定數(shù)目可變的順向重復(fù)部位(VNTR)及其特異性的引物。之后進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增,并將其提純,用直接測(cè)序的方法檢測(cè)其擴(kuò)增產(chǎn)物[22]。2007年首次報(bào)道了對(duì)小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的MLVA分析[23]。在小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的MLVA方法中共選取TCTCA、CGGCAAC、GGTGCA、GACTCA、GTGCTG、ATGTCGGTAGAA、GTTCTGGT 等7個(gè)核心序列進(jìn)行檢測(cè),在重復(fù)序列的兩端保守的部分設(shè)計(jì)引物進(jìn)行了PCR擴(kuò)增并通過(guò)毛細(xì)管電泳進(jìn)行分析,對(duì)待測(cè)菌株的串聯(lián)重復(fù)數(shù)進(jìn)行聚類分析[24]。Xin Wang等收集了我國(guó)213份及Dr. H.Fukushima提供的5份小腸結(jié)腸炎耶爾森菌樣通過(guò)對(duì)比建立了我國(guó)的MLVA分型的數(shù)據(jù)庫(kù)[15]。

    2.2 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP) 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)技術(shù)作為一種快速檢測(cè)方法是新的等溫核酸擴(kuò)增方法,由日本榮研株式會(huì)的Notomi等在2000年發(fā)明[25]。此技術(shù)是根據(jù)目的基因片段的六個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)四條兩對(duì)引物,在大分子聚合酶(BstDNA polymerase)的作用下,60~65 ℃條件下孵育反應(yīng)幾十分鐘,可完成對(duì)核酸的擴(kuò)增。1 h反應(yīng)時(shí)間內(nèi),目的基因片段可擴(kuò)增到109數(shù)量級(jí)以上,具有高特異性和快速擴(kuò)增的特點(diǎn),此法在DNA合成衍生產(chǎn)生一種焦磷酸鎂的衍生物,只需肉眼就可觀察擴(kuò)增結(jié)果[26-27]。

    梁軍等用LAMP及常規(guī)PCR法,對(duì)該菌的檢測(cè)進(jìn)行了比較,發(fā)現(xiàn)其在靈敏度、耗時(shí)長(zhǎng)短及特異性上都比常規(guī)方法有一定的優(yōu)越性[28]。羅敏紅等建立了對(duì)腹瀉患者中小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的檢測(cè)方法,發(fā)現(xiàn)此法除上述優(yōu)點(diǎn)之外,在檢測(cè)成本和和操作方面較常規(guī)方法上存在優(yōu)勢(shì)[29]。徐德順等針對(duì)我國(guó)小腸結(jié)腸炎耶爾森菌毒力基因yruI/yruB設(shè)計(jì)LAMP的引物對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增和優(yōu)化,節(jié)約了對(duì)小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的檢測(cè)時(shí)間[30]。楊瀾等優(yōu)化了LAMP在小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的引物設(shè)計(jì)[31]。通過(guò)對(duì)LAMP的一系列優(yōu)化,使LAMP在小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的檢測(cè)及推廣上體現(xiàn)了的實(shí)際意義。同時(shí)也對(duì)研究者在LAMP快速檢測(cè)上的引物設(shè)計(jì)、實(shí)驗(yàn)優(yōu)化及檢測(cè)準(zhǔn)確性上提出了新的要求。

    2.4 毒力基因 致病性小腸結(jié)腸炎耶爾森菌大多存在一個(gè)約70 kb的毒力質(zhì)粒(pYV)[12]。據(jù)該質(zhì)粒的毒力基因攜帶情況,可將小腸結(jié)腸炎耶爾森菌分為致病性與非致病性菌株。我國(guó)目前流行的O∶3和O∶9兩個(gè)血清型的毒力基因主要有ail(黏附侵襲位點(diǎn)基因)、ystA(耐熱腸毒素A基因)、ystB(耐熱腸毒素B基因)、yadA(黏附素基因)、virF(毒力調(diào)節(jié)因子基因)等,它們位于染色體上的毒力基因包括ail、ystA、ystB;位于pYV毒力質(zhì)粒上的基因包括:yadA、virF[32]。

    Huang等通過(guò)對(duì)不同生物/血清型菌株的研究發(fā)現(xiàn),其基因序列按不同的致病能力可以分為3類,高致病性的lB/O∶8型菌株為一類,低致病性的其他菌株分為相近的兩類[33]。目前Sihvonen及Cheyne等研究發(fā)現(xiàn)有極少數(shù)的生物1A型小腸結(jié)腸炎耶爾森菌也含有ail基因,有可能在特殊環(huán)境下使該型菌株具有致病的能力[34-35]。編碼位于染色體上的另外兩個(gè)基因ystA和yatB是耐熱腸毒素基因的兩個(gè)亞型,ystA基因存在于生物1B及2~5型中的致病性菌株中;ystB基因則僅存在于部分生物1A型菌株中,且僅存在于該型的非致病性菌株中而不存在于致病性菌株中[34]。編碼yadA和virF的基因位于毒力質(zhì)粒pYV上。yadA編碼的粘附素,具有抵抗補(bǔ)體的殺菌作用,并在菌體黏附于各種組織細(xì)胞的過(guò)程中起主要作用;virF編碼的毒力調(diào)節(jié)因子virF主要調(diào)節(jié)毒力質(zhì)粒pYV上與致病有關(guān)的基因的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)[35-36]。毒力質(zhì)粒pYV具有不穩(wěn)定性,僅存在于致病菌株中,在菌株的分離、培養(yǎng)、增菌及保存過(guò)程中可能丟失[12]。

    我國(guó)分離到的主要流行血清型中毒力基因分布為:ail+、ystA+、ystB-、yadA+、virF+占56.2%;ail+、ystA+、ystB-、yadA-、virF-占25.6%;其他型占18.2%[32]。吉芳坤等對(duì)非致病型小腸結(jié)腸炎耶爾森菌中ail基因克隆菌株的構(gòu)建及侵襲性研究發(fā)現(xiàn),將致病性基因ail載入非致病型小腸結(jié)腸炎耶爾森菌中,不會(huì)提高其黏附能力,反而降低了其特異黏附效能,這使得致病性小腸結(jié)腸炎的毒力基因研究有了新的進(jìn)展[37]。

    3 展 望

    小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的分型方法較多,目前我國(guó)已建立了PFGE及MLVA分型的數(shù)據(jù)庫(kù)。不同分型方法的引入,對(duì)小腸結(jié)腸炎耶爾森菌基因的解讀起著至關(guān)重要的作用。基因的解讀可以為我國(guó)現(xiàn)階段發(fā)現(xiàn)的小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的分布及其存在的變異、遷徙等提供證據(jù),也可通過(guò)于此了解其致病機(jī)制、毒力作用靶器官等,為該病的臨床提供治療依據(jù)。目前耶爾森菌之間的流行關(guān)系一直備受爭(zhēng)議,有研究已證實(shí)其共培養(yǎng)存在的拮抗作用[22,38-39],但尚未進(jìn)入動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段,因此我國(guó)部分地區(qū)已開展小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的監(jiān)測(cè),但尚未建立統(tǒng)一的檢測(cè)要求。云南作為鼠疫自然疫源地,也是第三次世界鼠疫流行的疑似發(fā)源地,但該地關(guān)于小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的報(bào)道卻很少。因此探討云南小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的不同基因分型及其分布,可對(duì)我國(guó)小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的分型數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行完善,同時(shí)可一定程度上的驗(yàn)證耶爾森菌屬中各菌的流行趨勢(shì)。

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    Epidemiological status and research progress of Yersinia enterocolitica in China

    CHEN Wu-jin1,WANG Peng2

    (1. School of Public Health, Dali University, Dali 671000, China;2. Yunnan Provincial Key Laboratory for Zoonosis Control and Prevention,Yunnan Institute for Endemic Diseases Control and Prevention, Dali 671000, China)

    The distribution ofYersiniaenterocoliticais wide in China with epidemiological differences in region, population, and time. With the development of molecular epidemiology in our country, many new techniques and methods which based on molecules and nucleic level are constantly being used in pathogen biology research ofYersiniaenterocolitica. In this paper, we summarize the recently information aboutYersiniaenterocoliticain China, including the distribution differences in region, population, animals, time, and the research on pathogen biology, virulent genes, and molecular typing which distributed widely in our country.

    Yersiniaenterocolitica; epidemiological status; molecular typing; virulence gene

    Wang Peng, Email: wp030801@126.com

    10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.04.019

    王鵬,Email:wp030801@126.com

    1.大理學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院, 大理 671000; 2.云南省地方病防治所,云南省自然疫源性疾病防控技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,大理 671000

    R378.2

    A

    1002-2694(2015)04-0380-05

    2014-06-26;

    2015-01-21

    國(guó)家科技重大專項(xiàng)課題-云南分題(2012ZX10004201)

    Supported by the Yunnan Sub-project of National Sci-Tech Key Project (No. 2012ZX10004201)

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