小鼠變應性接觸性皮炎模型各時期IL-33水平探索

于 曦，劉海亮，王 燕，王曉鈺，陶 羽，包凱帆，季 律，王 璨，洪 敏

（南京中醫(yī)藥大學藥學院，科技部國家規(guī)范化中藥藥理實驗室，江蘇省中藥藥效與安全性評價重點實驗室，江蘇南京 210023）

小鼠變應性接觸性皮炎模型各時期IL-33水平探索

于 曦，劉海亮，王 燕，王曉鈺，陶 羽，包凱帆，季 律，王 璨，洪 敏

（南京中醫(yī)藥大學藥學院，科技部國家規(guī)范化中藥藥理實驗室，江蘇省中藥藥效與安全性評價重點實驗室，江蘇南京 210023）

Expression of IL-33 in different phases of allergic contact dermatitis mouse model

YU Xi，LIU Hai-liang，WANG Yan，WANG Xiao-yu，TAO Yu，BAO Kai-fan，JI Lyu，WANG Can，HONG Min

（School of Pharmacy，Nanjing University of Chinese Medicine，National Standard Laboratory of Pharmacology for Chinese Mate-ria Medica，Jiangsu Key Laboratory for Pharmacology and Safety Evaluation of Chinese Materia Medica，Nanjing 210023，Chi-na）

網(wǎng)絡出版時間：2015－8－10 14：37 網(wǎng)絡出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20150810．1437．031．html

IL-33通過與二型固有淋巴細胞（group 2 innate lymphoid

cells，ILC2s）［1－2］上的ST2和IL-1受體輔助蛋白（IL-1RAcP）結(jié)合［3］，參與多種過敏性疾病發(fā)病機制，是引發(fā)過敏性疾病的關鍵因素［4］。上皮細胞可經(jīng)刺激產(chǎn)生IL-33，作用于ILC2s并使其產(chǎn)生Th2型細胞因子，促進Th2型過敏性疾病的發(fā)生，如過敏性皮炎［5］、哮喘［6］、過敏性鼻炎［7］等。利用小鼠變應性接觸性皮炎（allergic contact dermatitis，ACD）模型探索其在過敏性疾病不同時期表達水平，有助于了解變態(tài)反應的發(fā)病機制，同時為準確評價藥物對IL-33的影響選擇合適時期。

1　材料與方法

1．1動物 BALB／c♂小鼠，SPF級，18～22 g，北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，SCXK（京）2012－0001。

1．2試劑 異硫氰酸熒光素（FITC，Sigma），溶于丙酮／鄰苯二甲酸二丁酯（1∶1）中；Mouse IL-4、IL-5、IL-13、IL-33 Kit （eBioscience）；TRIzol（Invitrogen）；ReverAidTMFirst Strand cDNA Synthesis kit（Thermo Fisher scientific）；Quanti Fast SYBR Green PCR kit（Qiagen）；Lineage Cocktail with Isotype Ctrl-FITC抗體（BioLegend），ST2／IL33R-APC和CD25-PE抗體（eBioscience）。

1．3ACD模型的建立 小鼠于d 0腹部剔毛，d 1、d 2腹部涂抹80 μL 15 g·L－1FITC致敏，d 6右耳涂20 μL 6 g· L－1FITC激發(fā)，對照組涂等體積的溶劑。于d 3、d 5和激發(fā)后24 h（d 7）測量耳厚，計算耳腫脹度（右耳厚度－左耳厚度），對激發(fā)后24 h的耳進行病理組織學檢查。

1．4耳組織細胞因子檢測 小鼠耳片制備25 g·L－1組織勻漿，用ELISA法測定IL-4、IL-5、IL-13及IL-33，并通過樣本總蛋白定量來進行校正。

1．5IL-33 mRNA的表達 耳組織采用實時定量PCR方法檢測。利用Primer Premier 5．0軟件設計小鼠IL-33引物，以GAPDH為內(nèi)參。

1．6ILC2s的檢測 收集引流淋巴結(jié)，制備單細胞懸液，調(diào)整細胞密度為1×1010～2×1010cells·L－1。取100 μL細胞懸液，加入lineage cocktail antibody（20 μL／well）、0.2 μg CD25抗體和0.2 μg IL-33R／ST2抗體，避光孵育15 min，經(jīng)生理鹽水洗滌2次后，重懸，過濾，上流式細胞儀檢測。

2　結(jié)果

2．1小鼠ACD模型不同時期耳部炎癥表現(xiàn) 小鼠在誘導初期［對照（5.8±9.1）μm，模型（－4.2±11.1）μm］及誘導相［對照（－1.7±6.1）μm，模型（0±5.5）μm］右耳未出現(xiàn)腫脹，經(jīng)FITC激發(fā)，右耳腫脹度明顯增加［對照（11.7 ±11.7）μm，模型（176.7±39.3）μm，P＜0.01］，且病理組織學檢查發(fā)現(xiàn)，耳組織內(nèi)有大量以淋巴細胞為主的單個核細胞和少許多形核細胞浸潤，同時IL-4［對照（60.6±18.4）ng ·g－1，模型（110.9±27.6）ng·g－1，P＜0.01］、IL-5［對照（157.2±64.4）ng·g－1，模型（269.1±36.1）ng·g－1，P＜0.01］、IL-13［對照（36.3±10.9）ng·g－1，模型（151.4± 18.1）ng·g－1，P＜0.01］水平明顯升高，提示FITC可誘導小鼠形成Th2型ACD。

2．2小鼠ACD模型各時期IL-33的表達 誘導初期小鼠耳組織內(nèi)IL-33水平較對照組明顯升高［對照（457.4± 323.3）ng·g－1，模型（1554.6±359.5）ng·g－1，P＜0.01］，提示在致敏初期即已產(chǎn)生大量IL-33。誘導相和激發(fā)期IL-33水平［對照（554.0±104.3）ng·g－1，模型（787.9± 189.1）ng·g－1；對照（546.5±90.4）ng·g－1，模型（722.2 ±90.4）ng·g－1］雖仍較高，但較誘導初期有所降低。

2．3誘導初期耳組織中IL-33 mRNA的表達 與對照組相比（1.72±0.73），模型組小鼠IL-33 mRNA表達升高（2.96 ±1.69），該結(jié)果與IL-33在此時期表達增多相一致。

2．4誘導初期ILC2s百分含量 與對照組相比（0.32± 0.053），模型組小鼠引流淋巴結(jié)內(nèi)ILC2s百分含量明顯升高（0.43±0.050，P＜0.05），提示在誘導初期IL-33表達升高，并作用于ILC2s，繼而發(fā)揮生物學效應。

3　討論

IL-33是重要的促過敏細胞因子。過敏性疾病患者及模型動物上皮組織均表達高水平的IL-33［8］，其關鍵作用是誘導或激活2型免疫反應的效應細胞ILC2。FITC可誘導形成以Th2型細胞因子占優(yōu)勢的小鼠ACD模型［9］，在該模型誘導初期，IL-33水平明顯升高，且ILC2s數(shù)量增加，表明IL-33高表達于ACD的誘導初期，并激活下游反應，促使過敏性炎癥發(fā)生。

參考文獻：

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［4］ Cayrol C，Girard J P．IL-33：an alarmin cytokine with crucial roles in innate immunity，inflammation and allergy［J］．Curr Opin Immunol，2014，31：31－7．

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［6］ Kondo Y，Yoshimoto T，Yasuda K，et al．Administration of IL-33 induces airway hyperresponsiveness and goblet cell hyperplasia in the lungs in the absence of adaptive immune system［J］．Int Im-munol，2008，20（6）：791－800．

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［9］ Guo L F，F(xiàn)an W X，Tang A M．Dinitrofluorobenzene and fluoresce-in isothiocyanate induced mouse model of allergic contact dermati-tis［J］．Chin J Dermatol，2005，38（4）：229－31．

中國圖書分類號：R-332；R363-332；R392．12；R758.2

關鍵詞：變應性接觸性皮炎；IL-33；誘導初期；異硫氰酸熒光素；ILC2s；小鼠

Key words：allergic contact dermatitis；IL-33；the initial stage；fluorescein isothiocyanate；group 2 innate lymphoid cells；mouse

文獻標志碼：A

文章編號：1001－1978（2015）09－1331－02

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．09．031

作者簡介：于 曦（1990－），女，碩士生，研究方向：免疫藥理學，E-mail：yuxi1990yaoli＠126．com；洪 敏（1972－），女，博士，教授，研究員，博士生導師，研究方向：中藥免疫藥理學，通訊作者，E-mail：hongmin72＠126．com

基金項目：國家自然科學基金資助項目（No 81473395，81373549，81073121）；江蘇省自然科學基金資助項目（No BK20141466）；江蘇高校優(yōu)勢學科建設工程資助項目；江蘇省‘青藍工程’資助項目

收稿日期：2015－04－13，修回日期：2015－05－30