自體外周血單核細胞移植治療重度下肢缺血的臨床療效

方征東,王曉天,胡何節(jié),孫小杰,葛新寶,程燦

(安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院血管外科，合肥 230001)

·論著·

自體外周血單核細胞移植治療重度下肢缺血的臨床療效

方征東,王曉天,胡何節(jié),孫小杰,葛新寶,程燦

(安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院血管外科，合肥 230001)

目的 探討自體外周血單核細胞治療重度下肢缺血的長期療效和安全性。方法 回顧性分析行自體外周血單核細胞治療的重度下肢缺血患者的臨床資料。根據(jù)引起下肢缺血的原因，患者分為2組：動脈硬化閉塞(ASO)組，共 29例；血栓閉塞性脈管炎(TAO)組，共43例。采用臨床癥狀及下肢血流改變進行療效評價，隨訪所有患者治療后3年內(nèi)療效及不良反應(yīng)情況。結(jié)果 ASO組患者臨床癥狀評分和血流灌注參數(shù)在6個月內(nèi)明顯改善，但隨著隨訪時間延長又逐漸惡化至術(shù)前水平；TAO組患者臨床癥狀評分和血流灌注參數(shù)在改善后能得到長時間維持(P<0.05)。隨訪結(jié)束，ASO組免截肢率為17.2%，TAO組免截肢率為65.1%(F=15.99，P<0.05)。結(jié)論 自體外周血單核細胞移植是治療重度下肢缺血安全、有效的方法，適合于血栓閉塞性脈管炎引起的重度下肢缺血。

閉塞性動脈硬化；閉塞性血栓性脈管炎；下肢；細胞移植；單核細胞

外科旁路手術(shù)和經(jīng)皮血管腔內(nèi)成形術(shù)是外周動脈疾病(PAD)行血管重建的主要方式，對于伴有嚴(yán)重肢體缺血(CLI)的PAD患者，如果無法行血管重建，有時必須行截肢手術(shù)。近年來研究表明[1-2]，使用骨髓或外周單核細胞，以及內(nèi)皮祖細胞移植的細胞治療可明顯改善嚴(yán)重肢體缺血患者的臨床癥狀，降低截肢率，但仍缺乏長期研究數(shù)據(jù)。本研究回顧性分析我科自2004年以來接受自體外周血單核細胞(PBMNC)治療的CLI患者臨床資料。根據(jù)引起下肢缺血的原因，評估外周血單核細胞對CLI患者的臨床療效及安全性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2004年1月至2016年12月我科收治接受自體外周血單核細胞移植治療的下肢缺血患者臨床資料，共計72例，其中男65例，女7例;<65歲58例，≥65歲14例;年齡24～88歲，平均年齡(50.5±6.2)歲;合并高血壓17例、冠心病9例、糖尿病6例、腦梗死3例；3例曾接受血管旁路手術(shù)，2例行血管支架置入術(shù)；病程2～21個月，平均(13.8±4.7)個月。接受PBMNC治療的患者均滿足以下條件：(1)Fontaine分期為Ⅱb期～Ⅳ期的慢性下肢缺血患者；(2)CTA或其他影像學(xué)檢查證實下肢遠端沒有動脈流出道，無法進行下肢動脈旁路手術(shù)或血管腔內(nèi)治療；(3)藥物保守治療效果不佳；(4)近5年內(nèi)無明確惡性疾病的患者。并根據(jù)引起下肢嚴(yán)重缺血癥狀的原因分為兩組：(1)由下肢動脈硬化閉塞癥(ASO)引起，又稱ASO組，29例患者；(2)由血栓閉塞性脈管炎(TAO)引起，又稱TAO組，43例患者。

1.2 治療方法 (1)PBMNC動員、采集： 所有患者經(jīng)粒細胞集落刺激因子(G-CSF)動員后，于第3天開始查血常規(guī)，計數(shù)單核細胞數(shù)，當(dāng)白細胞>20×109/L且單核細胞(MNC)>30%時，使用血細胞分離儀3000Plus采集外周血單核細胞，制備PBMNC懸液，按每肢30～50 mL濃縮成細胞懸濁液，采集后的細胞懸液中MNC的濃度一般為1×108/mL，細胞總數(shù)約為5×109個。(2)PBMNC移植： 單個核細胞采集后于3 h內(nèi)移植至患肢。于患肢缺血部位取40～60個注射點，各點間距2～3 cm，深度1～1.5 cm，肌肉注射，每點注射0.7～1 mL細胞懸液。

1.3 術(shù)后處理 術(shù)后予以抗血小板、改善微循環(huán)處理，并根據(jù)具體情況予以控制血壓、血糖，潰瘍創(chuàng)面予以清創(chuàng)、換藥，并定期隨訪。

1.4 觀察指標(biāo) 對下肢間歇性跛行、疼痛及皮膚改變等臨床癥狀通過評分評估，對肢體血流量通過踝肱指數(shù)(ABI)和經(jīng)皮氧分壓(TcpO2)測量。

1.5 評分標(biāo)準(zhǔn)

1.5.1 間歇性跛行距離 4分：行走<100 m時出現(xiàn)疼痛或者伴有靜息痛；3分：行走100～200 m時有疼痛感；2分：行走200～400 m時有疼痛感；1 分：行走400～500 m時有疼痛感；0分：行走>500 m時無疼痛感。

1.5.2 疼痛評分 4分：疼痛難以忍受，影響睡眠、食欲；3分：經(jīng)常疼痛，需用止痛劑；2分：經(jīng)常疼痛，可忍受；1分：偶有疼痛；0分：無疼痛。

1.5.3 皮膚改變 4分：潰瘍形成或者壞疽；3分：皮膚呈紫黑色；2分：皮膚色澤變暗；1分：皮膚變蒼白或者發(fā)干；0分：無變化。

2 結(jié)果

2.1 基線資料 兩組在性別、缺血分級以及病程等方面差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但與ASO組患者相比，TAO組基本為年輕患者(P<0.05)，沒有心血管疾病發(fā)生的相關(guān)危險因素(P<0.05)，多有吸煙史(P<0.05)。見表1。

2.2 臨床癥狀 兩組患者均于移植術(shù)后1個月開始隨訪，隨訪3～90個月，平均43個月。從表2中可以看出，在術(shù)后1個月，兩組患者的疼痛、間歇性跛行及皮膚改變評分均較術(shù)前明顯降低(P<0.05)，表示各組患者經(jīng)自體外周血單核細胞治療后下肢缺血癥狀有明顯緩解，其中ASO組在術(shù)后半年評分降低較術(shù)前仍有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，然而，隨著隨訪時間的延長，ASO組患者臨床癥狀的各項評分逐漸恢復(fù)到術(shù)前水平，部分甚至加重(P>0.05)。與術(shù)前相比，TAO組臨床癥狀的各項評分在術(shù)后1個月開始降低，且在術(shù)后2到3年，其評分的降低仍差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，也明顯低于同期ASO組患者(P<0.05)。這些結(jié)果表明自體外周血單核細胞治療后，下肢缺血癥狀改善能維持更為持久的時間。到隨訪結(jié)束，ASO組僅有5例患者未行截肢治療，免截肢率為17.2%，TAO組有28例患者未行截肢治療，免截肢率為65.1%，明顯好于ASO組(F=15.99，P<0.05)。

表1 接受PBMNC移植患者的臨床基本資料對比

2.3 血流量的恢復(fù) 從表2中可以看出，在術(shù)后1個月，兩組患者ABI和肢體末梢TcpO2較術(shù)前均有顯著增高(P<0.05)。但ASO組ABI及TcpO2值在術(shù)后半年達到峰值后，快速下降，術(shù)后2年逐漸恢復(fù)到術(shù)前水平。而TAO組ABI及TcpO2的改善能夠維持到術(shù)后3年，明顯好于ASO組(P<0.05)。

2.4 安全性觀察 部分患者下肢肌內(nèi)注射后，短期內(nèi)有疼痛不適，一般1周左右消失，未見注射部位感染發(fā)生。術(shù)后3個月內(nèi)，未發(fā)生因注射引起的心腦血管意外及糖尿病視網(wǎng)膜病變加重情況，復(fù)查血常規(guī)及肝腎功能均未見明顯異常。經(jīng)過最長近10年的隨訪，注射PBMNC后肢體及其他部位未見腫瘤發(fā)生。

3 討論

EPCs大量存在于正常骨髓、臍血、外周血和脾中，2002年日本Kansai醫(yī)科大學(xué)[3]首次報道了應(yīng)用骨髓單核細胞移植治療人的下肢缺血性疾病的臨床研究，并顯示出了積極的效果。通過干細胞移植改善下肢缺血肢體的血液供應(yīng)，可能與以下因素有關(guān)[4]：①干細胞可被誘導(dǎo)分化為內(nèi)皮細胞或平滑肌細胞，從而作為種子細胞參與血管壁的組成；②干細胞分泌促血管生成因子來促進缺血區(qū)域血管生成；③干細胞通過旁分泌途徑促進側(cè)支循環(huán)的建立，改善缺血肢體的血流灌注。近年來，隨著干細胞動員藥物及血液細胞分離機的廣泛應(yīng)用，使動員骨髓中的干細胞進入外周血循環(huán)并進行分離純化成為可能。

表2 ASO和TAO患者接受PBMNC移植前后的療效

注：整體分析為兩因素重復(fù)測量方差分析；ASO組為29例，TAO組為43例；組間兩兩比較為LSD-t檢驗，兩組相比，aP<0.05；時間比較為差值t檢驗，與術(shù)前比較，bP<0.05

對于不同原因引起的下肢缺血，隨著時間的延長，PBMNC移植后療效明顯不同。在本研究中，無論TAO組或ASO組患者在PBMNC移植后半年內(nèi)都能明顯改善臨床癥狀，增加遠端血流量。但1年后隨訪發(fā)現(xiàn)，臨床癥狀評分和血流灌注參數(shù)如ABI和TcpO2在ASO組開始下降，并逐漸恢復(fù)至基線水平，而在TAO組，臨床癥狀評分和血流灌注參數(shù)改善能得到長時間維持。多年的隨訪也發(fā)現(xiàn)，ASO組免截肢率僅為17.2%，TAO組為65.1%，證實隨著時間的延長，ASO組有更多的患者發(fā)生截肢或死亡。同樣，Idei等[5]在利用骨髓單核細胞治療下肢缺血的研究中發(fā)現(xiàn)，糖尿病和血液透析與術(shù)后高截肢發(fā)生率有一定關(guān)系，因此對于接受血液透析的糖尿病患者，存在CLI時，不建議行細胞治療。為解決EPCs的功能及老化問題，通過基因轉(zhuǎn)染技術(shù)可以使靶細胞功能得到顯著改善，并能持續(xù)釋放促血管因子。Iwaguro等[6]將編碼VEGF的基因?qū)隕PCs，再應(yīng)用于動物模型當(dāng)中發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因的EPCs展示出更強大的增殖、黏附及整合能力，并且還能通過旁分泌作用促進其他已分化成熟的內(nèi)皮細胞增殖、遷移。這些經(jīng)過基因修飾的EPCs具有誘發(fā)和促血管新生的雙重功能，其血管新生效率比內(nèi)皮細胞高出30倍。

細胞治療的安全性，尤其是長期安全性是一直人們關(guān)注的重點[7]。Miyamoto等[8]報道，血栓閉塞性脈管炎細胞治療期間，有少量患者出現(xiàn)不適，其中1例30歲患者在治療后20個月突然死亡。在研究中，本組也發(fā)現(xiàn)動脈粥樣硬化的PAD患者死亡率在隨訪期間明顯高于血栓閉塞性脈管炎患者，這種差異可能與動脈粥樣硬化患者心血管并發(fā)癥有關(guān)，與細胞治療關(guān)系不大。在基本臨床資料對比中，本研究發(fā)現(xiàn)血栓閉塞性脈管炎患者除吸煙外，通常不具有心血管疾病的危險因素(高血壓、糖尿病、高血脂)，因此其心血管疾病發(fā)病率與健康人群無明顯差別。最近的一項臨床試驗也顯示，骨髓單核細胞移植不會改變CLI患者的死亡率[9]。另一方面，治療性血管新生的一潛在風(fēng)險為在促進缺血區(qū)域的血管新生的同時，可能促進隱匿存在的惡性腫瘤的血管新生，從而導(dǎo)致其生長，還有可能促使增殖性或出血性視網(wǎng)膜病變加重。在本研究中，包括ASO及TAO患者在內(nèi)，PBMNCs移植后，除注射部位有脹痛不適外，通過長期隨訪，沒有發(fā)現(xiàn)與PBMNCs移植有關(guān)的嚴(yán)重不良反應(yīng)。

總之，通過本組長期研究發(fā)現(xiàn)，自體PBMNC移植對嚴(yán)重肢體缺血的治療是有效的，操作簡單。相對于動脈硬化閉塞引起的肢體缺血，自體外周血單核細胞移植更適合于血栓閉塞性脈管炎患者。

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Clinical analysis of autologous peripheral blood mononuclear cells for treating critical limb ischemia

FangZhengdong，WangXiaotian，HuHejie，SunXiaojie，GeXinbao，ChengCan

(DepartmentofVascularSurgery，AnhuiProvincialHospital,AnhuiMedicalUniversity，Hefei230001，China)

Correspondingauthor:WangXiaotian，Email:wangxiaotian1967@163.com

Objective To evaluate long-term clinical outcomes after autologous peripheral blood mononuclear cells(PBMNC) implantation in patients with critical limb ischemia(CLI).Methods The clinical data of 72 patients with CLI were analyzed retrospectively.There were 29 patients with arteriosclerosis(ASO) and 43 patients with thromboangiitis obliterans(TAO).A series of clinical outcomes and laboratory findings were compared between the ASO and TAO group.Results In patients with ASO，clinical symptoms，ankle brachial pressure index (ABI)and transcutaneous oxygen pressure(TcpO2) improved after 1 month，but gradually decreased during 3-year follow-up and returned to baseline levels.In TAO group，clinical symptoms，ABI and TcpO2were significantly increased after 1 month and remained high during 3-year follow-up.The amputation-free rates after PBMNC implantation were 17.2% in ASO group and 61.5% in TAO group.Conclusions PBMNC implantation is safe and effective in patients with CLI.Compared with ASO，PBMNC implantation is more effective in CLI patients with TAO disease.

Arteriosclerosis obliterans；Thromboangiitis obliterans；Lower extremity；Cell transplantation;Monocytes

安徽省自然科學(xué)基金(1408085MH177);安徽省公益性技術(shù)應(yīng)用研究聯(lián)動計劃(1704f0804013)

方征東，副主任醫(yī)師，Email:fangzhegndong@126.com

王曉天，副主任醫(yī)師，Email:wangxiaotian1967@163.com

R543.5；R654.4

A

10.3969/J.issn.1672-6790.2017.04.003

2017-04-11)