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    肉桂醛的抑菌作用及其生物安全性

    2015-01-23 21:42:54賈安峰鄒勝龍石廣州市信農(nóng)生物科技有限公司廣東廣州510663
    中國豬業(yè) 2015年12期
    關鍵詞:抑菌作用作用機理

    賈安峰 鄒勝龍石 林 龔 紅(廣州市信農(nóng)生物科技有限公司,廣東廣州510663)

    飼養(yǎng)飼料

    肉桂醛的抑菌作用及其生物安全性

    賈安峰鄒勝龍*石林龔紅
    (廣州市信農(nóng)生物科技有限公司,廣東廣州510663)

    摘要:肉桂醛是傳統(tǒng)中藥肉桂油的主要活性成分,因其獨特的生理功能,已廣泛應用于醫(yī)療、食品和日化香料等領域。因其具有廣譜抗菌的作用,在飼料行業(yè)也開始受到廣泛關注。本文對肉桂醛的抑菌作用及其生物安全性進行總結和分析,為今后進一步開發(fā)抗生素替代品添加劑提供參考依據(jù)。

    關鍵詞:肉桂醛;抑菌作用;作用機理,生物安全性

    近年來,抗生素在畜牧養(yǎng)殖行業(yè)的大量使用,特別是不科學的濫用,使細菌的耐藥性增加。目前,歐盟已頒發(fā)了禁止在飼料中添加抗生素的規(guī)定;美國也從2014年起,計劃用3年時間禁止在牲畜飼料中使用預防性抗生素。我國限制抗生素在畜禽飼糧中的使用也勢在必行。綠色、安全、無污染的飼料添加劑將成為飼料行業(yè)的寵兒。大量研究表明肉桂醛具有廣譜抗菌作用[1-3],現(xiàn)將其抗菌機制及生物安全性報告如下。

    1肉桂醛概述

    肉桂醛,又名桂皮醛、β-苯丙烯醛、3-苯基-2-丙烯醛,為黃色黏稠狀液體,具有強烈的肉桂油香氣,是肉桂等植物的提取物,亦可人工合成。肉桂醛難溶于水、甘油和石油醚,易溶于醇、醚,易揮發(fā),在空氣中易被氧化。

    2肉桂醛的抑菌作用

    2.1肉桂醛的抗細菌作用

    近年來,大量研究表明,肉桂醛對多種革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均具有較強的抑菌效果。Shang-Tzen Chang等[4]的研究結果表明,肉桂精油對大腸桿菌、綠膿桿菌、糞腸球菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、肺炎桿菌、沙門氏菌和腸炎弧菌等9種致病菌均有良好的抑制效果。胡劉巖[5]研究了6種常見香辛料精油主要成分對5種冷鮮肉常見的腐敗菌(包括金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、釀酒酵母、產(chǎn)氣桿菌以及熱殺索絲菌)的抑制作用,發(fā)現(xiàn)肉桂醛的綜合抗菌能力最強。汪中興等[6]采用微板指示劑測定3種植物精油中的主要成分對2種豬源致病菌的體外抑菌活性,結果表明,3種植物精油及其主要成分的抑菌活性按從大到小的順序為:肉桂醛>肉桂油>百里香酚和百里香油≥香芹酚和牛至油,其中,肉桂油和肉桂醛對豬源產(chǎn)腸毒素大腸桿菌K88和霍亂沙門氏菌A72的最小抑菌濃度(MIC)分別為800 μL/L和400 μL/L,表明肉桂油中主要是肉桂醛在起抑菌作用。

    王帆等[7]采用肉湯稀釋法測得肉桂醛對大腸桿菌和綠膿桿菌的MIC分別為2.5和5.0 mmol/L,經(jīng)10.0mmol/L的肉桂醛分別處理2小時和3小時后,大腸桿菌和綠膿桿菌的生長完全被抑制。張文艷[8]研究表明,肉桂醛在濃度達0.1 μg/mL時開始抑制混合菌(金黃色葡萄球菌和腸炎沙門氏菌混合培養(yǎng))生物被膜的形成,對金黃色葡萄球菌和腸炎沙門氏菌的最小抑菌濃度均為0.4 μg/mL。薛京昌等[9]體外抑菌試驗結果也表明,肉桂醛對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的MIC為0.4μg/mL,對枯草芽孢桿菌的MIC為0.3μg/mL,對沙門氏菌的MIC為0.2μg/mL;且肉桂醛的熱穩(wěn)定性良好,在121℃濕熱條件下處理60分鐘,對4種細菌的抑菌效果幾乎不受影響。MIC的測定方法主要包括肉湯稀釋法和瓊脂擴散法,這些方法都存在一些漏洞,其結果高度依賴其自身的水溶性和測試成分在瓊脂中的擴散能力[10],所以研究者測定的MIC值之間是有差異的,很難直接去比較。

    此外,研究證實肉桂醛的衍生物α-溴代肉桂醛、肉桂酸對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌和炭疽桿菌也均具有明顯的抑菌活性,而肉桂醇僅對金黃色葡萄球菌具有明顯的抑菌活性[11]。Joris[12]研究了肉桂醛及其10種衍生物對大腸桿菌和乳酸桿菌的抑制效果,結果表明,2-硝基肉桂酸、4-甲氧基肉桂酸、苯基丙醛、4-硝基肉桂酸和2-硝基肉桂醛對大腸桿菌有中等的抑制作用,3,4,5-三甲氧基肉桂酸對大腸桿菌有微弱的抑制作用,2-甲氧基肉桂醛、4-甲氧基肉桂醛、肉桂醛和2-羥基肉桂醛對大腸桿菌有很強的抑制作用,且對乳酸桿菌有明顯的抑制作用,因此,此4種化合物可有選擇性地抑制細菌,在平衡腸道微生物方面有較好的作用,4-硝基肉桂醛對大腸桿菌的抑制作用極顯著,但是這種化合物有致癌作用。

    2.2肉桂醛的抗真菌作用

    肉桂醛不僅對細菌具有抑制作用,還具有較強的抗真菌作用,在飼料防腐和食品保鮮上具有廣闊的應用前景。謝小梅等[13]研究表明,肉桂醛對黃曲霉菌、煙曲霉菌的MIC分別是0.100和0.050 μg/mL,這與張文平等[14]的研究結果一致;通過電鏡掃描發(fā)現(xiàn),肉桂醛處理之后的黃曲霉菌和煙曲霉菌,菌絲扭曲、折斷,分生孢子梗萎縮,分生孢子形態(tài)不一,表面平坦并黏連,說明肉桂醛可能破壞了霉菌的細胞壁、細胞膜結構,抑制了孢子的形成。對不同的菌種,肉桂醛的抑菌效力有所差異。王新偉等[15]指出,對面包酵母的抑制效果:肉桂醛>香芹酚>牛至油>檸檬醛;對黑曲霉的抑制效果:香芹酚>牛至油>肉桂醛>檸檬醛。Fuguo Xing等[16]指出肉桂油的抗真菌能力與其肉桂醛的含量有關,肉桂油(肉桂醛含量85%)、天然肉桂醛(95%)和合成肉桂醛(99%)對輪狀鐮刀霉菌的MIC分別為60、50、45 μL/L,在最小抑菌濃度下,其絲狀真菌的超微結構發(fā)生了不可逆轉的損傷。

    3肉桂醛抑菌的作用機制

    肉桂醛具有廣譜抗菌作用,對多種細菌或真菌引起的疾病具有良好的預防和治療作用。眾多學者對其抗菌抑菌機制進行了研究,研究成果主要如下。

    肉桂醛能破壞細菌或真菌結構和功能的完整性。肉桂醛結構中的醛基是親水基,易被真菌表面的親水基吸附,破壞其細胞壁的多糖結構而穿透細胞壁[14];肉桂醛還能影響黃曲霉菌細胞膜麥角甾醇的生物合成,破壞其細胞膜的正常功能,甚至使其細胞破裂,抑制黃曲霉的生長繁殖[17]。謝小梅等[13]通過電鏡掃描和同位素標記技術發(fā)現(xiàn)肉桂醛作用于黃曲霉菌和煙曲霉菌后,其細胞壁、細胞膜結構被破壞,霉菌細胞不能維持正常的細胞形態(tài),胞內(nèi)外物質交換受阻,營養(yǎng)物質吸收降低,胞內(nèi)生物大分子的合成減少,從而抑制了霉菌的生長和繁殖。汪琨等[18]通過構建釀酒酵母的一系列細胞壁合成酶基因敲除菌株(1,GHS020和GHS003)作為模型,發(fā)現(xiàn)肉桂醛能特異性地抑制真菌細胞壁葡聚糖和幾丁質的合成,能透過細胞壁等屏障,作用于位于細胞膜上的葡聚糖合酶和幾丁質合酶,從而抑制真菌細胞的生長。Suxia Shen等[19]經(jīng)電子掃描顯微鏡和透射電子顯微鏡觀察到,大腸桿菌和金黃色葡萄球菌在被肉桂醛最小抑菌濃度(0.31 mg/mL)處理時,其細胞形態(tài)、細胞膜的完整性和滲透性都受到一定損傷,濃度越高,損傷越大。另一方面,肉桂醛可作用于黃曲霉的細胞膜,致使其細胞膜氧化損傷,肉桂醛進入黃曲霉細胞后,形成膜脂質過氧化物,干擾了黃曲霉細胞的有序級聯(lián)反應,破壞其線粒體內(nèi)膜上的氧化還原系統(tǒng),降低其自由基清除能力,致使其自由基含量增高[20]。王帆等[7]研究也表明,肉桂醛通過氧化脅迫作用使大腸桿菌菌體內(nèi)H2O2含量、丙二醛(MDA)含量升高,超氧化物歧化酶(SOD)活力增強,引發(fā)細胞內(nèi)脂質、蛋白質和核酸分子的氧化性損傷,從而破壞菌體結構而使其死亡。而綠膿桿菌在肉桂醛的脅迫作用下形成了菌膜,保護了菌體免受氧化損傷,但依然抑制了綠膿桿菌的生長,其作用機理還有待進一步研究。

    另一些研究者認為,肉桂醛主要是通過進入細胞內(nèi)干擾胞內(nèi)代謝以及影響基因的正常表達,發(fā)揮其抑菌作用。Helander[21]研究發(fā)現(xiàn)肉桂醛可以通過孔蛋白進入到細菌細胞的深層部位。Becerril[22]在死亡的大腸桿菌中重新提取出了肉桂醛,所以可以認為,在大腸桿菌降解之前,肉桂醛已經(jīng)進入到細菌胞內(nèi)。不飽和醛化合物帶有很高的負電性(如肉桂醛),它可以干擾電子轉移的生物學過程,還可以與一些重要的含氮化合物(如一些功能性蛋白和核酸)反應,從而抑制微生物的生長[23]。肉桂醛結構中的醛基還能與菌體蛋白質功能基團-SH、-NH2、-CH及-COOH等發(fā)生化學作用,不僅抑制了代謝途徑中相關酶的活性,還可能與相關酶發(fā)生了不可逆的結合,甚至改變了酶的空間結構,使其蛋白完全失活[1,20]。肉桂醛抑菌機制是一系列相互獨立的因素,同時還涉及到物種特異性的靶位點。用肉桂醛處理芽樣芽胞桿菌不會導致顯著的胞內(nèi)蛋白泄漏,但是可以強烈地抑制細胞分裂[24]。Gill和Holley[25]認為肉桂醛抑制產(chǎn)單核細菌能量的生成可能是由于抑制了細菌細胞對葡萄糖的攝入和利用,并影響了細菌細胞膜的通透性。Gill和Holley[26]發(fā)現(xiàn),肉桂醛可以顯著抑制大腸桿菌和產(chǎn)單核細菌ATP酶活性(>750 mg/L)。肉桂醛可以抑制產(chǎn)氣脫羧桿菌的組氨酸脫羧酶活性[27]。肉桂醛的羰基可以綁定蛋白,從而阻止產(chǎn)氣菌的氨基酸脫羧反應,肉桂醛可綁定到FtsZ蛋白,從而抑制芽樣芽胞桿菌的細胞分裂[28]。張文平等[14]運用同位素摻入技術探索肉桂醛對曲霉菌的作用機制,發(fā)現(xiàn)肉桂醛可能通過抑制曲霉菌的DNA、RNA、蛋白質的合成前體TdR、UdR及亮氨酸的摻入,導致曲霉菌細胞內(nèi)生物大分子的合成受阻,從而表現(xiàn)出殺菌作用。謝小梅等[29]通過激光掃描共聚焦顯微鏡直接對肉桂醛處理后的黃曲霉菌和煙曲霉菌單個細胞的DNA、RNA進行定量和定位觀察,結果發(fā)現(xiàn)肉桂醛處理黃曲霉后,視野中有大量多核細胞,DNA水平增加;而處理煙曲霉后,DNA水平減少;肉桂醛處理黃曲霉和煙曲霉后RNA均減少。由此推測,肉桂醛處理黃曲霉后分生孢子出現(xiàn)多核現(xiàn)象,可能是肉桂醛影響了黃曲霉分生孢子梗在分化過程中核遷移、胞質分裂和橫隔形成的協(xié)調進行,從而影響了黃曲霉的繁殖,DNA水平增加可能是肉桂醛干擾了DNA的正常合成,使細胞周期在G2期到M期重復復制。而肉桂醛作用煙曲霉后,DNA水平降低,細胞核模糊不清,說明肉桂醛對煙曲霉的直接作用靶位不是DNA,但也干擾了DNA的正常合成或導致細胞周期停止在G1期。肉桂醛作用黃曲霉和煙曲霉后,其RNA水平均減少,可能是肉桂醛抑制了RNA的合成或加快了RNA的降解,RNA代謝異常,最終導致蛋白質代謝異常,抑制了霉菌的生長和繁殖。

    肉桂醛對有害菌的作用方式,不僅表現(xiàn)在抑制其生長和繁殖,還能降低霉菌毒素的毒性,減小其危害性。煙曲霉色素存在于煙曲霉菌細胞壁上,且是目前已明確的關鍵毒力因子。研究發(fā)現(xiàn)煙曲霉菌的色素僅局限在分生孢子上,能抵抗哺乳動物宿主的防御系統(tǒng),從而使其能在宿主體內(nèi)存活并引發(fā)疾病。龍凱等[30]選擇煙曲霉色素合成的關鍵基因alb1為研究對象,探索肉桂醛對alb1基因表達的影響,結果表明,肉桂醛對alb1基因mRNA表達具有明顯的抑制作用,且隨著濃度的增加,抑制作用增強,菌苔逐漸變稀、薄且煙綠色色素逐漸變淡,甚至白化,毒性降低。

    4肉桂醛的協(xié)同作用

    肉桂醛與其他植物提取物復配后具有累加效應,同樣與一些酸化劑也有協(xié)同作用。王帆等[31]研究報道,四種植物源殺菌劑(肉桂醛、丁香酚、麝香草酚和單寧酸)對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌、腸炎沙門氏菌和單核細胞增生李斯特氏菌5種致病菌均表現(xiàn)出較強的抑制活性,且兩兩復配后各成分都表現(xiàn)出協(xié)同增效或效果疊加的作用,最小抑菌濃度比單獨作用時有所降低。Didry[32]研究發(fā)現(xiàn),僅僅混合百里香酚和香芹酚的效果要好與單獨使用肉桂醛、百里香酚和香芹酚的效果,這表明植物提取物之間存在協(xié)同作用。大量的研究發(fā)現(xiàn),植物提取物和其他一些酸類(醋酸、檸檬酸和EDTA)混合,可以更好地抑制一些細菌[33]。Santiesteban[34]研究發(fā)現(xiàn),植物提取物可以與有機酸協(xié)同抑制食物源病原菌。這種協(xié)同作用的機制尚不清楚。這種機制可能是有機酸可以加強植物提取物的抑菌效果,也可能是植物提取物加強了有機酸的抑菌效果。在酸性環(huán)境中,植物提取物是不游離的,且是親脂性的,這可能會提高植物提取物穿過細胞膜的能力,并使細胞膜通透性增加,這是支持前一種假設的。另一方面,與后一種假設一致,有機酸可以打破細胞內(nèi)酸堿平衡,而植物提取物可以破壞細胞膜的質子泵,使細胞進一步失去維持酸堿平衡的能力。也有些研究者發(fā)現(xiàn),肉桂醛與氨基酸的加成物對枯草芽孢桿菌和大腸桿菌也有良好的抗菌作用,且在酸性環(huán)境下,其抗菌作用增強[35]。

    5與肉桂醛抑菌作用的關聯(lián)因子

    蛋白質可能會影響植物提取物的抑菌效果[36]。在體外抑菌試驗中發(fā)現(xiàn),用175 mg/L的百里香酚處理沙門氏菌,然后在培養(yǎng)基中加入9 mL/L的牛血清蛋白,結果發(fā)現(xiàn),百里香酚的抑菌效果被消除[37]。在豬的日糧中加入肉湯,百里香酚、香芹酚、丁香酚和肉桂醛的抑菌效果都會消失[38]。眾所周知,肉桂醛可以在任何地方與蛋白反應。脂肪也可以影響到植物提取物的抗菌活性。如果植物提取物溶解在油脂中,那么在水相中只有較少的植物提取物與細菌反應[23]。相反,食物中的糖類不會影響植物提取物的抑菌活性[39]。Smith-Palmer[40]研究發(fā)現(xiàn),低水分食物會影響植物提取物進入細胞中的靶位點。肉桂醛在低pH值條件下對嗜酸耐熱菌孢子的抑制作用更強[41]。

    6肉桂醛藥物代謝動力學和體內(nèi)殘留

    在人類和嚙齒動物類的試驗中發(fā)現(xiàn),肉桂醛可以迅速和完全地被腸道吸收,隨后通過依賴于NAD的醛脫氫酶氧化成肉桂酸,或結合在其他鹽類上排出體外,或經(jīng)進一步β-氧化后,再和其他化合物結合,然后排除體外(主要以馬尿酸的形式排出)[42,43]。Sapienza[44]研究發(fā)現(xiàn),用5和50 mg/kg·BW的肉桂醛處理雌性大鼠,連續(xù)8天,在尿中的主要代謝物是馬尿酸,并有少量的肉桂酸和苯甲酸。用高劑量500 mg/kg·BW肉桂醛處理后發(fā)現(xiàn),苯甲酸是最主要的代謝產(chǎn)物,這表明多次大劑量的肉桂醛處理,會引起甘氨酸結合通道的飽和。不管是口服多少劑量的肉桂醛,24小時之后,80%的放射性標記物質由尿排出,低于7%的代謝產(chǎn)物由糞便排出。肉桂醛新陳代謝的第二條通路是:與還原性谷胱甘肽反應形成硫醚氨酸衍生物[45]。肉桂醛代謝性解毒的主要通路是通過β-氧化。在許多研究中發(fā)現(xiàn),口服的肉桂醛主要通過尿液的形式排出體外,在尿和糞中回收的代謝物總和超過85%。口服單一劑量的用C14標記的500 mg/kg·BW肉桂醛,24小時之后,在脂肪組織和肌肉中的殘留量分別在0.31%~0.90%和0.13%~0.26%之間[44]。

    這些數(shù)據(jù)表明,肉桂醛可以快速地代謝掉,機體可以快速地清除這些化合物或者代謝物,因此,殘留基本上不會出現(xiàn)。然而,僅有的數(shù)據(jù)表明這些化合物或代謝物可能在豬的組織中殘留,尤其是在飼料中加入高劑量的植物提取物時。

    7肉桂醛的生物安全性

    植物提取物在有氧環(huán)境中能夠被土壤中微生物降解[46],在缺氧的條件下能夠被好幾種途徑分解掉[47]。21天后,肉桂醛能夠100%被微生物降解[48]。Bock(1988)發(fā)現(xiàn),真菌可以使肉桂醛降解成相應的醇。肉桂醛的微生物降解類似于丁香酚的微生物降解[49]。肉桂醛主要分布在環(huán)境中的土壤和水中,持續(xù)時間也比較短,大約279小時[50]。Vokou和Liotiri[51]認為植物提取物在土壤中主要作為微生物的碳源和能量,如果環(huán)境中的微生物生長良好,那么植物提取物就不會在土壤中累積。

    肉桂醛被美國食品和藥物管理局(FDA)公認為安全、無毒的物質(21 CFR 182.60);美國香味料和萃取物制造者協(xié)會(FEMA)認為其是安全無毒的食品香料成分(FEMA,1965);食品添加劑聯(lián)合專家委員會(JECFA)也認為肉桂醛作為食品添加劑是安全的(JECFA NO.656)。

    8前景展望

    肉桂醛作為一種新型的綠色飼料添加劑,目前正處于迅猛發(fā)展期,不少飼料企業(yè)和科研院所對肉桂醛的研究也不斷深入,對其生理功能和作用機理研究得更加透徹。隨著畜牧行業(yè)健康發(fā)展的時代要求,抗生素將逐漸被停用或禁用,肉桂醛無疑將成為一種可供選擇的抗生素替代品,在飼料工業(yè)中具有廣闊的發(fā)展前景。

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    中圖分類號:S816.73

    文獻標識碼:A

    文章編號:1673-4645(2015)12-0058-06

    收稿日期:2015-11-03

    基金項目:科技型中小企業(yè)技術創(chuàng)新資金專項資助(201504291655393)

    作者簡介:賈安峰(1989-),安徽六安人,碩士研究生,從事飼料添加劑研究;E-mail:714725789@qq.com*通訊作者:鄒勝龍(1975-),安徽安慶人,碩士,主要從事飼料添加劑的研究;E-mail:zoushl@163.com

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