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    骨髓單個核細(xì)胞熱休克蛋白27表達在多發(fā)性骨髓瘤中的臨床價值*

    2015-01-09 07:55:42張梅芳郭曉麗王良宏郭鵬翔朱紅倩
    重慶醫(yī)學(xué) 2015年35期
    關(guān)鍵詞:難治漿細(xì)胞骨髓瘤

    王 清,張梅芳,郭曉麗,王良宏,宋 軍,袁 斌,陳 馳,郭鵬翔,朱紅倩

    (1.貴州省人民醫(yī)院血液科,貴陽550001;2.河北省新樂市人民醫(yī)院內(nèi)科 050700;3.貴陽醫(yī)學(xué)院臨床免疫教研室,貴陽 550004;4.貴州省腫瘤醫(yī)院血液科,貴陽550000;5.貴陽中醫(yī)學(xué)院免疫教研室,貴陽550001)

    論著·臨床研究

    骨髓單個核細(xì)胞熱休克蛋白27表達在多發(fā)性骨髓瘤中的臨床價值*

    王 清1,張梅芳2,郭曉麗1,王良宏3,宋 軍1,袁 斌4,陳 馳5,郭鵬翔1,朱紅倩1

    (1.貴州省人民醫(yī)院血液科,貴陽550001;2.河北省新樂市人民醫(yī)院內(nèi)科 050700;3.貴陽醫(yī)學(xué)院臨床免疫教研室,貴陽 550004;4.貴州省腫瘤醫(yī)院血液科,貴陽550000;5.貴陽中醫(yī)學(xué)院免疫教研室,貴陽550001)

    目的 探討骨髓單個核細(xì)胞熱休克蛋白27(HSP27)表達與多發(fā)性骨髓瘤(MM)臨床特征的關(guān)系。方法收集初治多發(fā)性骨髓瘤患者86例,復(fù)發(fā)難治患者27例,對照組為非血液系統(tǒng)惡性腫瘤患者,根據(jù)治療方案的不同,MM患者分為初治組、復(fù)發(fā)難治常規(guī)化療組及含硼替佐米化療組。分別于化療前、化療后1、2、3療程檢測骨髓單個核細(xì)胞HSP27的表達率及蛋白水平。結(jié)果化療前各組HSP27表達量及蛋白水平趨勢為:復(fù)發(fā)難治組大于初治組大于對照組。初治組中Ⅲ期患者的HSP27明顯高于Ⅱ期患者。含硼替佐米化療方案可明顯降低HSP27的表達及蛋白水平,含硼替佐米化療方案抑制HSP27的表達力度明顯優(yōu)于常規(guī)化療組?;熀?個療程HSP27的表達量小于1的患者,其死亡率、復(fù)發(fā)率明顯低于HSP27表達量大于1的患者,且復(fù)發(fā)時間明顯延后。結(jié)論骨髓單個核細(xì)胞HSP27的表達及蛋白水平與多發(fā)性骨髓瘤的分期、治療應(yīng)答、預(yù)后相關(guān)。

    多發(fā)性骨髓瘤;熱休克蛋白質(zhì)類;預(yù)后;治療應(yīng)答

    熱休克蛋白(HSP)的作用主要體現(xiàn)為應(yīng)激狀態(tài)下的細(xì)胞保護作用(抗凋亡)[1]。然而,HSP的這種細(xì)胞保護機制亦可促進腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、耐藥抵抗的發(fā)生[2]。既往研究證實在卵巢、胸部、腸道、肝、前列腺腫瘤中,HSP家族的一員——HSP27的表達與預(yù)后較差相關(guān)[3]。而在頭、頸腫瘤中,HSP27的表達卻與預(yù)后無相關(guān)性[4]。上述研究表明盡管HSP27與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、生物學(xué)特性、轉(zhuǎn)歸相關(guān),但其在不同的腫瘤中的臨床意義亦有不同。近年來,國外學(xué)者通過體外、動物模型實驗證實HSP27與多發(fā)性骨髓瘤(MM)的耐藥相關(guān),并肯定了HSP27在MM中的過度表達[5-8]。然而,尚無大宗針對HSP27的表達與MM關(guān)系的臨床研究。本研究通過對MM骨髓單個核細(xì)胞(BMMNC)-HSP27基因及蛋白表達水平的檢測,初步探討HSP27表達與MM治療、緩解率、預(yù)后之間的關(guān)系。

    1 資料與方法

    1.1 一般資料 收集本院2010年8月至2013年12月初治MM患者86例,復(fù)發(fā)難治MM患者27例,對照組為非血液系統(tǒng)惡性腫瘤患者(缺鐵性貧血42例,巨幼紅細(xì)胞性貧血25例)。MM的診斷、治療、療效評判標(biāo)準(zhǔn)參照2008~2011修訂版《中國多發(fā)性骨髓瘤治療指南》(2012年搜集病例均采用2011修訂版)。3組患者在年齡構(gòu)成、性別、分類、分期等方面比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。其中,MM初治及復(fù)發(fā)難治組均以IgG型為主(45.35%,44.44%),分期以Ⅲ期為主(69.53%,100%)。初治組與復(fù)發(fā)難治組的骨髓漿細(xì)胞比例分布比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。初治組86例患者中,46.51%的患者選擇常規(guī)化療方案,僅9.31%的患者選擇含硼替佐米化療方案。復(fù)發(fā)難治組中,48.42%的患者選擇常規(guī)化療方案,51.58%的患者選擇含硼替佐米化療方案。復(fù)發(fā)難治組選擇硼替佐米者明顯高于初治組。MM患者均行多部位穿刺(≥3)及骨髓活檢,每例標(biāo)本由3名形態(tài)室人員閱片,計數(shù)細(xì)胞大于或等于500個。

    表1 各組BMMNC-HSP27的mRNA表達及蛋白水平

    1.2 方法

    1.2.1 骨髓單個核細(xì)胞HSP27的相對表達率測定 化療前采集患者骨髓標(biāo)本5 mL,采用密度梯度離心法獲取BMMNC,采用QRT-PCR對BMMNC-HSP27的mRNA表達水平進行檢測。BMMNC的HSP27引物合成、相對表達率測定參照既往文獻進行[9]。應(yīng)用7500 Sequence Detection Software分析(Applied Biosystems,Carlsbad,California,USA)。用2-△△CT法做相對定量(每樣本重復(fù)3次)。

    1.2.2 BMMNC HSP27水平的ELISA測定 將上述步驟獲取的BMMNC標(biāo)本,使用上海西塘生物科技有限公司提供的人HSP27 ELISA試劑盒,按試劑說明書進行操作,對BMMNC的HSP27水平進行測定。

    1.2.3 分組 鑒于本研究為回顧性分析,因此,分組比較包括:(1)初治、復(fù)發(fā)難治、對照組不同骨髓漿細(xì)胞亞組間的BMMNC-HSP27的mRNA及蛋白表達水平;(2)初治、復(fù)發(fā)難治組間不同免疫分型亞組的BMMNC-HSP27的mRNA及蛋白表達水平;(3)初治、復(fù)發(fā)難治常規(guī)化療、含硼替佐米化療組的BMMNC-HSP27在不同時間點的蛋白及mRNA表達水平。

    2 結(jié) 果

    2.1 骨髓瘤患者與對照組BMMNC-HSP27的mRNA表達及蛋白水平 初治、復(fù)發(fā)難治組不同骨髓漿細(xì)胞比例亞組間的HSP27 mRNA表達及蛋白水平比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),提示骨髓漿細(xì)胞比例的不同對BMMNC-HSP27的mRNA及蛋白水平表達無影響。此外,在不同的骨髓漿細(xì)胞比例分組中均可觀察到:初治組、復(fù)發(fā)難治組的BMMNC-HSP27 mRNA表達水平均明顯高于對照組,組內(nèi)多重比較表明復(fù)發(fā)難治組的BMMNC-HSP27相對表達率明顯高于初治組。相同的趨勢亦見于BMMNC-HSP27蛋白水平。ELISA檢驗結(jié)果表明:BNNMC-HSP27的蛋白水平,初治組明顯高于對照組,而復(fù)發(fā)難治組則高于初治組,見表1。

    2.2 MM患者BMMNC-HSP27的mRNA表達及蛋白水平在MM不同分型中的變化 初治、復(fù)發(fā)難治組的BMMNC-HSP27的mRNA表達在不同的分型中比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。初治、復(fù)發(fā)難治組的BNNMC-HSP27的蛋白水平在不同的骨髓瘤分型中比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.609)。見表2。

    表2 MM患者MMNC-HSP27的mRNA表達及蛋白水平在MM不同分型中的變化

    2.3 初治組患者BMMNC-HSP27的mRNA表達及蛋白水平在MM不同分期中的變化 Ⅲ期MM患者BMMNC-HSP27的mRNA表達明顯高于Ⅱ期患者,二者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.004)。Ⅲ期患者BNNMC-HSP27的蛋白水平明顯高于Ⅱ期患者,二者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.009)。見表3。

    表3 初治組患者MMNC-HSP27的mRNA表達及蛋白水平在MM不同分期中的變化

    2.4 MMNC-HSP27的mRNA表達、蛋白水平與治療應(yīng)答的相關(guān)性 由圖1可知:分組、時間因素對BMMNC-HSP27相對表達率的影響具有顯著性(交互效應(yīng)、分組、時間主效應(yīng)P<0.05)。固定時間因素可知:治療前、治療后1個療程HSP27的相對表達量從高到低均為復(fù)發(fā)難治硼替佐米化療組、復(fù)發(fā)難治常規(guī)化療組、初治硼替佐米化療組及初治常規(guī)化療組;治療后2療程,復(fù)發(fā)難治常規(guī)化療組的BNNMC-HSP27表達最高(1.70±0.49),其余3組雖低于復(fù)發(fā)難治常規(guī)化療組,但組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(1.02±0.48,0.86±0.48,0.54±0.58)。相同的趨勢亦可于治療后3個療程觀察到。固定分組因素:初治常規(guī)化療組的BMMNC-HSP27相對表達率在1~2個化療周期內(nèi)呈進行性降低,但化療后2~3個療程間相比HSP27的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);復(fù)發(fā)難治常規(guī)化療組治療后1個療程BMMNC-HSP27的表達無明顯變化,于治療后2~3個療程雖稍降低,但降低幅度明顯低于其余3組。初治硼替佐米化療組中,治療后1個療程,HSP27的表達明顯降低,其后,隨療程推移而保持相對穩(wěn)定的狀態(tài);復(fù)發(fā)難治硼替佐米化療組中,HSP27與化療后1~2個療程出現(xiàn)進行性降低,但于化療后2~3個療程保持相對穩(wěn)定狀態(tài)。BNNMC-HSP27的蛋白水平的變化趨勢與mRNA變化大致相同。

    *:P<0.05,**:P<0.01,與初治常規(guī)化療組(治療前)比較;#:P<0.05,##:P<0.01,組內(nèi)兩兩比較。不同的條圖模型代表不同的治療狀態(tài)(時間點)。誤差棒代表標(biāo)準(zhǔn)差。

    圖1 BMMNC-HSP27 mRNA表達及蛋白水平在不同分組、不同時間點的變化趨勢

    2.5 MMNC-HSP27的mRNA表達、蛋白水平與預(yù)后的相關(guān)性 113例患者中,17例失隨訪,隨訪率為84.96%。隨訪病例中,放棄治療11例,轉(zhuǎn)外地治療4例,2例死于嚴(yán)重感染。剩余96例患者中,40例化療后1個療程時,BMMNC-HSP27相對表達率小于1,56例BMMNC-HSP27相對表達率大于1。此96例患者隨訪時間為6~24個月,中位隨訪時間為15個月。隨訪觀察至2014年3月1日結(jié)束。BMMNC-HSP27相對表達率大于1組中有10例患者死亡,病死率為17.85%;BMMNC-HSP27相對表達率小于1組中,2例患者死亡,病死率為5.00%,后者的病死率明顯低于前者(P<0.05)。BMMNC-HSP27相對表達率大于1組中有23例患者復(fù)發(fā),復(fù)發(fā)率為46.00%,復(fù)發(fā)時間為化療后(94±20)d;BMMNC-HSP27相對表達率小于1組中有8例患者復(fù)發(fā),復(fù)發(fā)率為20.00%,復(fù)發(fā)時間為化療后(155±23)d,后者的復(fù)發(fā)率明顯低于前者(P<0.05),且復(fù)發(fā)時間明顯高于前者(P<0.05)。

    3 討 論

    HSP27存在于所有活體細(xì)胞表面,其細(xì)胞保護作用可阻止應(yīng)激狀態(tài)細(xì)胞所致的細(xì)胞凋亡[10-12]。然而,一系列的既往研究證實HSP27的過度表達往往在腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移中起促進作用[13]。諸多文獻雖證實HSP27的過度表達往往與MM的耐藥相關(guān),且阻滯HSP的表達后,MM的耐藥突變可被逆轉(zhuǎn)[14],但尚無動物及臨床試驗報道。其原因可能為:(1)惡性漿細(xì)胞的非均一分布所致的樣本漿細(xì)胞比例相差較大,且骨髓單個核細(xì)胞中漿細(xì)胞比例極低;(2)對于治療有效的病例,骨髓中漿細(xì)胞逐漸下降甚至消失,在此背景下,鑒于分組、時間點不同,所得單個核細(xì)胞中的成分區(qū)別巨大,如仍按照體外研究的模式將研究對象界定于MM細(xì)胞,即使使用流式細(xì)胞儀等技術(shù)對標(biāo)本進行純化,亦無法保證不同人群及不同時間點的骨髓瘤細(xì)胞HSP27表達一定具有可比性。

    與體外研究不同,本研究選用BMMNC作為研究對象以評估HSP表達與MM臨床特征、療效、預(yù)后的相關(guān)性。研究證實骨髓漿細(xì)胞比例并不影響B(tài)MMNC-HSP27的mRNA表達及蛋白水平,在不同骨髓漿細(xì)胞比例組中,初治組及復(fù)發(fā)難治組的mRNA表達及蛋白水平均存在差異,該結(jié)果表明MM細(xì)胞水平的變化并不足以影響總體BMMNC-HSP的表達及蛋白水平。進一步的分析表明BMMNC-HSP27的表達與分型無關(guān),而與分期相關(guān)。此外,對BMMNC-HSP27表達量及蛋白水平的持續(xù)監(jiān)測證實含硼替佐米的化療方案可明顯降低HSP27的表達及蛋白水平,且抑制BMMNC-HSP27的表達力度明顯優(yōu)于常規(guī)化療組。治療狀態(tài)的比較證實初治患者中,BMMNC-HSP27表達及蛋白水平明顯降低,且可一直維持相對較低狀態(tài)。而復(fù)發(fā)難治的常規(guī)化療患者,BMMNC-HSP27表達無明顯改變。即使加用硼替佐米后,BMMNC-HSP27的表達量及蛋白水平略微下降,但仍低于初治硼替佐米化療組的患者下降幅度。該結(jié)果表明化療后BMMNC的HSP27表達量及蛋白水平可用于監(jiān)測治療應(yīng)答。而對預(yù)后的判定則證實BMMNC-HSP27與復(fù)發(fā)率、復(fù)發(fā)時間、死亡率相關(guān)。本研究結(jié)果表明化療后1個療程BMMNC-HSP27的表達量小于1的患者,其病死率、復(fù)發(fā)率明顯低于BMMNC-HSP27表達量大于1的患者,且復(fù)發(fā)時間明顯延后。

    本研究的意義在于證實BMMNC-HSP27的表達對于MM的診療及預(yù)后評估有一定的監(jiān)測意義。將HSP27作為治療靶點或可改善MM的療效,并對新藥物、新化療方案的設(shè)定、論證起一定的輔助證明作用。本研究中,含硼替佐米的化療方案無論對于初治、還是復(fù)發(fā)難治的患者均可明顯降低HSP27的表達及蛋白水平,提示硼替佐米或可通過下調(diào)HSP27的表達,促進MM細(xì)胞的凋亡。

    [1]Acunzo J,Katsogiannou M,Rocchi P.Small heat shock proteins HSP27(HspB1),αB-crystallin(HspB5) and HSP22(HspB8) as regulators of cell death[J].Int J Biochem Cell Biol,2012,44(10):1622-1631.

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    [4]Khalil AA,Kabapy NF,Deraz SF,et al.Heat shock proteins in oncology:Diagnostic biomarkers or therapeutic targets?[J].BBA-Reviews on Cancer,2011,1816(2):89-104.

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    The clinical value of HSP27 expression of bone marrow mononuclear cells in multiple myeloma*

    WangQing1,ZhangMeifang2,GuoXiaoli1,WangLianghong3,SongJun1,YuanBin4,ChenChi5,GuoPengxiang1,ZhuHongqian1

    (1.DepartmentofHematology,thePeople′sHospitalofGuizhouProvince,Guiyang,Guizhou550001,China;2.DepartmentofInternalMedicine,thePeople′sHospitalofXinleCity,XinLe,Hebei050700,China;3.ImmunologyTeachingandResearchSection,GuiyangMedicalCollege,Guiyang,Guizhou550004,China;4.DepartmentofHematology,CancerHospitalofGuizhouProvince,Guiyang,Guizhou550000,China;5.ImmunologyTeachingandResearchSection,GuiyangCollegeofTraditionalChineseMedicine,Guiyang,Guizhou550001,China)

    Objective To investigate the relationship of HSP27 expression with treatment response,remission rate,prognosis in multiple myeloma(MM) patients.MethodsEighty-six patients with MM first diagnosis and 27 relapse cases were collected respectively.Control was defined as non-hematological malignance.The MM patients divided into first diagnosis,relapse conventional chemotherapy group and bortezomib group.HSP27 expression and protein level were measured on pre-and post 1,2 and 3 treatment circles.ResultsThe tendency of HSP expression and protein level:relapse-MM patients>first-diagnosis MM patients>control.HSP27 expression and level in Ⅲ phase was higher than those in Ⅱ phase for first-diagnosis MM patients.Bortizomib-containing chemotherapy protocol showed more effectively decrease on HSP27 than chemotherapy treatment only.At post-1 treatment circle,HSP27<1 showed higher survival rate than HSP27>1 and delayed the relapse time.ConclusionBMMNC-HSP27 expression and protein level is associated with staging,treatment response and prognosis in MM patients.

    multiple myeloma;heat-shock proteins;prognosis;treatment response

    10.3969/j.issn.1671-8348.2015.35.015

    貴州省聯(lián)合基金資助項目(黔科合SY[2010]3127號)。

    :王清(1972-),副主任醫(yī)師,博士,主要從事血液系統(tǒng)惡性腫瘤研究。

    R559

    A

    1671-8348(2015)35-4946-04

    2015-06-20

    2015-08-18)

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