歐前胡素體外誘導(dǎo)人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7凋亡

陳虹

（杭州市第一人民醫(yī)院，浙江 杭州310006）

·實(shí)驗(yàn)研究·

歐前胡素體外誘導(dǎo)人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7凋亡

陳虹

（杭州市第一人民醫(yī)院，浙江 杭州310006）

目的探討歐前胡素對(duì)人乳腺癌細(xì)胞的抑制作用及機(jī)制。方法將人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7用濃度為10μmol/L，20μmol/L，40μmol/L，80μmol/L，160μmol/L的歐前胡素處理48小時(shí)，四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）法檢測(cè)歐前胡素處理后MCF-7的細(xì)胞活力；通過流式細(xì)胞術(shù)和western blot方法檢測(cè)歐前胡素對(duì)MCF-7細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用和Mcl-1的表達(dá)；在MCF-7細(xì)胞中轉(zhuǎn)染外源性Mcl-1后再用歐前胡素處理，檢測(cè)歐前胡素對(duì)MCF-7細(xì)胞活力和凋亡程度的影響。結(jié)果10μmol/L，20μmol/L，40μmol/L，80μmol/L，160μmol/L歐前胡素細(xì)胞活力抑制率分別為（3.4±1.2）%，（9.5±2.4）%，（24.5±4.4）%，（48.7±5.9）%，（74.7±6.4）%。20μmol/L，40μmol/L，80μmol/L歐前胡素凋亡誘導(dǎo)率分別為（4.9± 0.9）%，（12.9±1.7）%，（22.1±3.1）%。MCF-7細(xì)胞用歐前胡素處理48小時(shí)后，細(xì)胞的Mcl-1表達(dá)水平顯著下降。當(dāng)用pcDNA3.1-Mcl-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞后，80μmol/L歐前胡素對(duì)MCF-7細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)率 （8.8±1.5）%相比于用空pcDNA3.1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組凋亡誘導(dǎo)率（24.2±3.3）%顯著下降（P<0.05）。結(jié)論歐前胡素具有體外抗乳腺癌的生物活性，其抗腫瘤效應(yīng)的機(jī)制可能是通過下調(diào)Mcl-1蛋白的表達(dá)，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。

歐前胡素；MCF-7；Mcl-1；凋亡

乳腺癌是女性發(fā)病率最高的腫瘤[1]。盡管腫瘤治療手段已經(jīng)取得了很大的進(jìn)展，乳腺癌的5年存活率仍然很低[2]。歐前胡素是從中藥材白芷根中提取的香豆素類天然藥物有效成分，據(jù)報(bào)道有良好的抗腫瘤效應(yīng)[3]。然而歐前胡素對(duì)乳腺癌的抑制效應(yīng)及機(jī)制目前仍不清楚，作者通過體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)歐前胡素可以誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞發(fā)生凋亡，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞 人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7購于中國科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所，培養(yǎng)在DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)環(huán)境為37℃恒溫且通入5%的CO2。本實(shí)驗(yàn)從2013年5月~2014年12月完成于本院中心實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2實(shí)驗(yàn)試劑 DMEM培養(yǎng)基 （貨號(hào)：11995-065）購于美國Gibco公司；歐前胡素 （貨號(hào)：I6659），四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT，貨號(hào)：M2128）購于Sigma-Aldrich；PI/AnnexinⅤ凋亡試劑盒 （貨號(hào)：88-8005-74）購于美國ebioscience；細(xì)胞蛋白裂解液（貨號(hào)：#9803），Mcl-1抗體（貨號(hào)：#5453）及βactin抗體（貨號(hào)：#4967）購于美國cell signaling公司；pcDNA3.1（貨號(hào)：V790-20），轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000（貨號(hào)：11668030），Trizol（貨號(hào)：15596-018）購于Invitrogen公司；ECL顯色試劑盒（貨號(hào)：NCI4106）購于美國Pierce公司；HindIII，EcoRI限制性內(nèi)切酶購于日本Takara公司。

1.2方法

1.2.1MTT試驗(yàn) 將MCF-7細(xì)胞按1×103個(gè)/孔接種于96孔板，設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，分別加入10μmol/ L，20μmol/L，40μmol/L，80μmol/L，160μmol/L的歐前胡素培養(yǎng)48小時(shí)，對(duì)照組為不加歐前胡素同樣條件培養(yǎng)48小時(shí)。之后加5g/L MTT 20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)。棄上清，加150μL二甲基亞砜（DMSO），在570nmol/L波長下用酶標(biāo)儀檢測(cè)OD值，細(xì)胞活力抑制率用以下公式計(jì)算：抑制率=（OD對(duì)照組-OD歐前胡素組）/OD對(duì)照組×100%。

1.2.2細(xì)胞凋亡試驗(yàn) MCF-7細(xì)胞的凋亡采用Annexin V/PI染色法檢測(cè)。在MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)瓶中分別加入20μmol/L，40μmol/L，80μmol/L的歐前

胡素培養(yǎng)48小時(shí)，對(duì)照組為不加歐前胡素同樣條件培養(yǎng)48小時(shí)，將5μL Annexin V/PI檢測(cè)液加入細(xì)胞中37℃孵育20分鐘，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的凋亡。

1.2.3Western blot試驗(yàn) 在MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)瓶中分別加入20μmol/L，40μmol/L，80μmol/L的歐前胡素培養(yǎng)48小時(shí)，收集細(xì)胞并裂解，裂解后的蛋白提取液用12.5%的丙烯酰胺進(jìn)行SDS-PAGE，之后將凝膠取下將蛋白轉(zhuǎn)膜到PVDF膜上。將膜在Mcl-1或β-actin一抗稀釋液中孵育過夜，之后在帶辣根過氧化物酶活性的二抗稀釋液中孵育2小時(shí)，ECL試劑顯色曝光。

1.2.4質(zhì)粒構(gòu)建及轉(zhuǎn)染 將MCF-7細(xì)胞用Trizol試劑裂解后提取mRNA，用PCR法擴(kuò)增Mcl-1基因的開放閱讀框架。引物如下：正向引物:5’-GAGAAGCTTGCCACTTCTCACTTCCGCT-3’，反向引物：5’-TGGAATTCATAATCCTCTTGCCACTTGC-3’。將 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物、pcDNA3.1空質(zhì)粒用 HindIII、EcoRI限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，之后將Mcl-1的開放閱讀框架與pcDNA3.1連接后構(gòu)建成pcDNA3.1-Mcl-1重組真核表達(dá)質(zhì)粒。將MCF-7細(xì)胞接種在6孔板中，待細(xì)胞密度生長到鋪滿板面約80%時(shí)按Lipofectamine 2000操作說明書將 2μg pcDNA3.1-Mcl-1重組質(zhì)粒或?qū)φ誴cDNA3.1空質(zhì)粒在無血清培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)染到MCF-7細(xì)胞中，培養(yǎng)16小時(shí)后更換為含10%胎牛血清的新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，之后加80μmol/L的歐前胡素再培養(yǎng)48小時(shí)，檢測(cè)MCF-7的細(xì)胞活力和凋亡水平。1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行處理，采用非配對(duì)雙邊t檢驗(yàn)以及單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1歐前胡素對(duì)人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7的抑制作用 歐前胡素在體外有顯著的抗乳腺癌作用，且歐前胡素濃度越高對(duì)MCF-7細(xì)胞活力的抑制作用越明顯，見表1。

表1 不同濃度歐前胡素對(duì)MCF-7細(xì)胞的抑制作用（）

與對(duì)照組比較*P<0.05

組別 n/孔 細(xì)胞活力抑制率（%）對(duì)照組 3 0 10μmol/L歐前胡素組 3 3.4±1.2 20μmol/L歐前胡素組 3 9.5±2.4*40μmol/L歐前胡素組 3 24.5±4.4*80μmol/L歐前胡素組 3 48.7±5.9*160μmol/L歐前胡素組 3 74.7±6.4*

2.2歐前胡素下調(diào)MCF-7細(xì)胞Mcl-1的表達(dá)并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡 用流式細(xì)胞術(shù)試驗(yàn)檢測(cè)歐前胡素對(duì)MCF-7細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)歐前胡素呈劑量依賴性誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡，見圖1。western blot試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)歐前胡素可顯著降低細(xì)胞Mcl-1的表達(dá)，提示歐前胡素誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能和下調(diào)Mcl-1蛋白水平有關(guān)，見圖2。

2.3轉(zhuǎn)染Mcl-1表達(dá)質(zhì)粒廢除歐前胡素對(duì)MCF-7細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)效應(yīng) 在MCF-7細(xì)胞中轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Mcl-1質(zhì)粒后，歐前胡素對(duì)MCF-7細(xì)胞活力的抑制作用和凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)均下降，見表2。

表2 pcDNA3.1-Mcl-1重組質(zhì)粒對(duì)歐前胡素抗腫瘤效應(yīng)的影響（，%）

與對(duì)照組比較*P<0.05；與空pcDNA3.1組比較△P<0.05

組別 n/孔 細(xì)胞活力抑制率 凋亡率對(duì)照組 3 0 0空pcDNA3.1組 3 54.8±6.4*24.2±3.3*pcDNA3.1-Mcl-1組 3 19.7±4.9*△8.8±1.5*△

3 討論

歐前胡素是從中藥白芷根部提取的天然有效成分，有研究報(bào)道歐前胡素具有良好的抗腫瘤效應(yīng)，能抑制如神經(jīng)膠質(zhì)瘤、肝癌、宮頸癌等多種腫瘤細(xì)胞的生長和侵襲轉(zhuǎn)移，使腫瘤細(xì)胞的周期發(fā)生阻滯[4-5]，但其具體機(jī)制仍不清楚。在本研究中，作者發(fā)現(xiàn)歐前胡素具有顯著的體外抗乳腺癌的生物效應(yīng)，能誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，歐前胡素可顯著下調(diào)MCF-7細(xì)胞Mcl-1的表達(dá)。

Mcl-1（myeloid cell leukemia-1）最早在人髓白血病細(xì)胞系中被發(fā)現(xiàn)，屬于Bcl-2蛋白家族中的抗凋亡蛋白成員，其功能與Bcl-2相似，但Mcl-1的半衰期很短且受多種內(nèi)源性分子的調(diào)控[6-7]。Mcl-1定位于線粒體外膜，通過與一些促凋亡蛋白如Bim，Bak和NOXA等形成異二聚體使之失活，從而阻斷細(xì)胞色素C從線粒體中釋放，抑制細(xì)胞進(jìn)入凋亡程序[8-9]。近些年來的研究發(fā)現(xiàn)Mcl-1的高表達(dá)和腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，Sieghart等[10]發(fā)現(xiàn)149個(gè)肝細(xì)胞肝癌患者中有51%患者的肝腫瘤組織中高度表達(dá)Mcl-1，而腫瘤組織附近的正常肝組織Mcl-1的表達(dá)卻很低，表明Mcl-1的過表達(dá)是腫瘤特異性改變之一。將腫瘤細(xì)胞的Mcl-1基因沉默后會(huì)引起腫瘤細(xì)胞凋亡，但不影響正常肝細(xì)胞的生物學(xué)性狀[11-12]。這些研究都提示了Mcl-1可以作為腫瘤治療的一個(gè)重要靶點(diǎn)。

為了研究歐前胡素對(duì)MCF-7細(xì)胞的抑制作用和細(xì)胞內(nèi)Mcl-1蛋白的下調(diào)有關(guān)，作者在體外將Mcl-1基因通過質(zhì)粒重組的方法構(gòu)建了外源性Mcl-1表達(dá)系統(tǒng)，將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到MCF-7細(xì)胞中后，結(jié)果表明歐前胡素對(duì)MCF-7細(xì)胞活力的抑制作用和凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)均顯著下降，由此證明抑制Mcl-1的蛋白表達(dá)可能是歐前胡素誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制之一。綜上所述，本研究提示了歐前胡素有良好的抗乳腺癌的生物活性，為乳腺癌的治療提供了新的途徑和理論依據(jù)。

[1] Siegel R，Naishadham D，Jemal A.Cancer statistics，2013. CA Cancer J Clin，2013，63（1）:11

[2] Prabhakaran P，Hassiotou F，F(xiàn)ilgueira L，et al.Cisplatin induces differentiation of breast cancer cells.Front Oncol，2013，3:134

[3] Thanh PN，Jin W，Kang SS，et al.Cytotoxic coumarins from the root of Angelica dahurica.Arch Pharm Res，2004，27（12）:1211

[4] Badziul D，Jakubowicz-Gil J，Gawron A，et al.The effect of quercetin and imperatorin on programmed cell death induction in T98G cells in vitro.Pharmacol Rep，2014，66（2）:292

[5] B?dziul D，Jakubowicz-Gil J，Gawron A，et al.Combined treatment with quercetin and imperatorin as a potent strategy for killing HeLa and Hep-2 cells.Mol Cell Biochem，2014，392（1-2）:213

[6] Bose P，Grant S.Mcl-1 as a Therapeutic Target in Acute Myelogenous Leukemia（AML）.Leuk Res Rep，2013，2（1）:12

[7] 鄔春曉，沈紅強(qiáng)，夏大靜.三尖杉酯堿通過下調(diào)Mcl-1蛋白誘導(dǎo)NB4細(xì)胞凋亡.浙江大學(xué)學(xué)報(bào) （醫(yī)學(xué)版），2013，42（4）:431

[8] Rahmani M，Aust MM，Grant S，et al.PI3K/mTOR inhibition markedly potentiates HDAC inhibitor activity in NHL cells through BIM-and MCL-1-dependent mechanisms in vitro and in vivo.Clin Cancer Res，2014，20（18）:4849

[9] Geserick P，Wang J，Leverkus M，et al.The ratio of Mcl-1 and Noxa determines ABT737 resistance in squamous cell carcinoma of the skin.Cell Death Dis，2014，5:e1412

[10]Sieghart W，Losert D，Strommer S，et al.Mcl-1 overexpression in hepatocellular carcinoma:A potential target for antisense therapy.Hepatol，2006，44（1）:151

[11]Thallinger C，Wolschek MF，Monia BP，et al.Mcl-1 is a novel therapeutic target for human sarcoma:synergistic inhibition of human sarcoma xenotransplants by a combination of mcl-1 antisense oligonucleotides with lowdose cyclophosphamide.Clin Cancer Res，2004，10（12 Pt 1）:4185

[12]Opferman JT，Iwasaki H，Ong CC，et al.Obligate role of anti-apoptotic MCL-1 in the survival of hematopoietic stem cells.Science，2005，307（5712）:1101