miRNAsiRNAs在精子發(fā)生過程中的重要作用

趙崢輝林勝利趙連明吳銀玲綜述 葛少欽, 4, 5, 6審校 . 河北大學醫(yī)學部（保定 0700）; . 北京大學第三醫(yī)院生殖醫(yī)學中心; . 北京大學第三醫(yī)院泌尿外科; 4. 河北大學生殖醫(yī)學研究所; 5. 河北大學附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學科; 6. 河北省計劃生育科學技術研究院

miRNAsiRNAs在精子發(fā)生過程中的重要作用

趙崢輝1林勝利2趙連明3吳銀玲1綜述 葛少欽1, 4, 5, 6審校
1 . 河北大學醫(yī)學部（保定 071002）; 2. 北京大學第三醫(yī)院生殖醫(yī)學中心; 3. 北京大學第三醫(yī)院泌尿外科; 4. 河北大學生殖醫(yī)學研究所; 5. 河北大學附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學科; 6. 河北省計劃生育科學技術研究院

精子發(fā)生是一個高度調控的轉錄、翻譯和翻譯后過程[1]。精原干細胞在嬰兒出生后就開始了其分化過程：經過精原細胞有絲分裂和精母細胞減數分裂之后，所形成的單倍體圓形精子細胞通過精蛋白替代組蛋白完成染色質濃縮和細胞核重塑過程，最終形成了具有特定表觀遺傳修飾的成熟精子[2]。近期的研究表明，雖然人類基因組廣泛轉錄，但大部分RNAs沒有翻譯成蛋白質。這些被稱作非編碼RNAs （ncRNAs）的轉錄產物大小不一，是基因表達調控的重要表觀遺傳因子。ncRNAs調控精子發(fā)生過程主要在轉錄、轉錄后和表觀遺傳等水平調控基因表達，轉錄水平通過改變染色體構象的方式調節(jié)基因表達；轉錄后水平通過使mRNA裂解或翻譯抑制行使其功能；表觀遺傳水平則是通過與其它表觀遺傳因子相互作用調控基因表達[3]。

根據生物學功能可將ncRNAs分為“管家ncRNAs （house-keeping ncRNAs）和調控性ncRNAs：管家ncRNAs主要包括核糖體RNA（rRNA）、轉運RNA （tRNA）、小核RNA（snRNA）、小核仁RNA （snoRNA）、不均一核RNA（hnRNA）、引導RNA （gRNA）和端粒酶RNA[4]；調控性ncRNAs主要包括微小RNA（miRNA）、小干擾RNA（siRNA）、piRNA、長鏈非編碼RNA (lncRNA)、信號識別顆粒RNA（srpRNA）、反義RNA（atRNA）、tmRNA和從內含子或DNA非編碼區(qū)轉錄的eRNA。不同種類的ncRNAs可單獨或協同作用完成某些生命活動，其中miRNA途徑是基因表達調控的重要機制之一。精子發(fā)生過程中，miRNAs呈階段特異性表達，在精原細胞向粗線期精母細胞轉變過程中，有32種miRNAs表達上調，78種miRNAs表達下調；而在粗線期精母細胞向圓形精子細胞轉變過程中，有144種miRNAs表達上調，29種miRNAs表達下調，表明這些miRNAs逐步參與精子發(fā)生的整個過程[5]。miRNAs異常表達會影響男性的生育能力，如缺乏合成miRNAs所需的Dicer酶，會導致miRNAs整體缺失，對男性生育能力產生決定性的影響[6]。通過闡述miRNAs的最新研究進展，分析其在精子發(fā)生和男性生育中的重要調控作用，可為不育癥的診斷與治療提供基礎資料。

一、miRNAsiRNAs的產生與調控

miRNAs為長度21～25個核苷酸不等的內源性RNAs，是蛋白質編碼基因表達的重要調節(jié)因子之一。研究發(fā)現，miRNAs的編碼序列貫穿于整個基因組，大約有1000個基因，其中約一半位于內含子，miRNAs的轉錄產物由其編碼序列之后的一個宿主基因所調控[7]。絕大多數miRNAs編碼序列需先在RNAPol Ⅱ作用下轉錄成pri-miRNAs，然后primiRNAs在雙鏈RNA核酸內切酶Drosha和DGCR8催化下裂解成pre-miRNAs，pre-miRNAs由核內轉運到胞漿，被核糖核酸內切酶Dicer裂解生成成熟的miRNAs[8]。隨后miRNAs解螺旋，與AGO蛋白和其它輔助蛋白結合形成miRNA誘發(fā)沉默復合體（MiRNA-induced silencing complex, miRISC）[9]。此復合體中，miRNAs通過堿基互補配對與靶mRNAs結合形成雙鏈RNA，使序列特異性識別的靶mRNAs降解或翻譯抑制[10]。降解或翻譯抑制的程度取決于靶mRNAs與miRNAs的互補程度和miRISC中AGO蛋白的類型[11]。

哺乳動物中，AGO2是唯一可以裂解RNA的AGO蛋白，其與高度互補的miRNA-mRNA協同作用，導致RNA裂解[12]。然而，如果miRNA與靶mRNA未完全互補，可能會將mRNA隔離在胞質顆粒中，伴有或不伴有翻譯抑制[13]。Wakiyama等[14]研究發(fā)現，miRNAs可以使靶mRNAs的多聚A尾脫腺苷化，避免與多聚A綁定蛋白結合，進而抑制翻譯過程。此外，AGO2還可與真核細胞翻譯起始因子4D（Eukaryotic translation initiation factor 4D, eIF4D）競爭性結合修飾的mRNAs5’末端，阻止翻譯過程[15]。另一方面，miRNAs也可促進翻譯過程，取決于細胞增殖的狀態(tài)和靶mRNAs 3’UTR中AU富集的程度[16]。一個miRNA可有數百個靶mRNAs，而一個mRNA也具有多個相同或不同的miRNA綁定位點。因此miRNAs具有強大的環(huán)行調節(jié)能力，可以調控大量不同的靶點和各種各樣的生理或病理過程[17]。

二、miRNAsiRNAs與精原細胞分化

精原干細胞（spermatogonial stem cells, SSCs）位于生精上皮的基底區(qū)，在整個性成熟過程中，SSCs依靠自我更新和分裂維持干細胞池[18]。精子發(fā)生過程中，miRNAs通過翻譯和傳導細胞信號維持未分化干細胞總數和誘發(fā)細胞分化過程，嚴格調控SSCs的狀態(tài)[19]。

He等[20]研究發(fā)現miR-20和miR-106a在小鼠SSCs中優(yōu)先表達，對SSCs的自我更新非常重要。高通量測序技術顯示miR-21, miR-34c, miR-182, miR-183和miR-146a一起表達在SSCs富集的總體中，miR-21的短暫抑制會增加生殖細胞凋亡的數量，表明miR-21 對SSCs總數的維持至關重要[21]。此外，Moritoki等[22]在大鼠隱睪病模型的研究中發(fā)現miR-135a的靶轉錄因子FoxO1在維持SSCs總數上也具有重要作用。Yang 等[23]研究發(fā)現X染色體miRNA群如miR-221和miR-222在未分化的精原細胞中高度表達，其功能障礙會導致精原細胞分化，表明他們在維持精原細胞未分化狀態(tài)中具有重要作用。MiR-146在未分化的精原細胞中高度表達，其轉錄水平是分化精原細胞的180倍。

uszar等[24]研究顯示用維甲酸誘導精原細胞分化會下調miR-146的表達水平，表明miR-146具有維持精原細胞未分化狀態(tài)的作用。Tong等[25]研究發(fā)現敲除小鼠未分化精原細胞中優(yōu)先表達的miR-17-92群基因會導致睪丸縮小和附睪精子數量減少，但會增加miR-06b-25群的表達，表明這兩群miRNAs在功能上具有協同作用。另一方面，一些miRNAs也具有促進精原細胞分化的能力，如let-7家族miRNAs，Gaytan等[26]研究發(fā)現RNA綁定蛋白LIN28定位于未分化的精原細胞中，通過抑制let-7家族miRNAs的生物合成，使精原細胞總數循環(huán)擴增。

三、miRNAsiRNAs與精母細胞的減數分裂

精母細胞減數分裂過程中，轉錄過程的廣泛進行使得哺乳動物睪丸組織中轉錄產物復合體高于其他組織，轉錄后水平上的miRNA調控機制在此過程中發(fā)揮了重要作用[27]。

在減數分裂起始階段，miR-449群的調控水平顯著上升，其表達受到轉錄因子CREMtau和SOX5的嚴密調節(jié)[28]。值得注意的是，miR-34 b/c的調控水平在miR-449敲除的睪丸組織中顯著上升，而且miR-449群和miR-34 b/c共用一些靶向基因，表明他們之間存在一些功能的補償[29]。Yu等[30]研究發(fā)現miR-34c在SCs、精母細胞和圓形精子細胞中均有表達，其不僅可以調控干細胞狀態(tài)，而且在精子發(fā)生后期也具有重要作用。Liang等[31]研究發(fā)現初級精母細胞中miR-34c表達水平下調可阻止生殖細胞的T缺失誘導的凋亡（T deprivation-induced apoptosis），按照這一理論，在生殖細胞培養(yǎng)中，miR-34c的高度表達會導致細胞凋亡，表明miR-34c在提高確定譜系的細胞初始表型中具有重要作用。此外，研究發(fā)現X染色體miRNA家族的表達水平高于其它所有miRNAs的表達[32]，這與X染色體中miRNA基因密度明顯高于常染色體并可在精母細胞中表達有關。精母細胞減數分裂時期，性染色體基因在減數分裂期性染色體鈍化（meiotic sex chromosome inactivation, MSCI）過程中發(fā)生了表觀遺傳沉默，但miRNA家族卻沒受到MSCI的影響，而是通過基因復制不斷擴增。這表明在進化過程中，X染色體上miRNA基因復制是選擇性活化的，以使其避免MSCI在精母細胞中表達。

四、miRNAsiRNAs與精子形成

精子形成過程中，精子染色質中的組蛋白首先被過渡蛋白替代，然后再被精蛋白替代，最終完成以核小體為基礎到以精蛋白為基礎的染色質結構轉變。精子核內染色質結構的成功轉變取決于精子發(fā)生晚期過渡蛋白和精蛋白的時空特異性表達。

為保證這種準確的時空表達模式，miRNAs對過渡蛋白和精蛋白的表達在轉錄后水平上進行精確調控。Chang等[33]研究發(fā)現敲除Prm1Cre-Dicer1基因會導致睪丸產生頭部形態(tài)異常的長型精子，且精子內染色質的完整性也受到損害，表明圓形精子中Dicer1基因失活會抑制生殖細胞轉錄本翻譯的活化，其中就包括使轉錄本被翻譯抑制核糖核蛋白復合體隔離的精蛋白1。粗線期精母細胞和圓形精子細胞時期，miR-469通過降解編碼過渡蛋白和精蛋白的mRNAs，抑制它們的表達[34]。Yu等[35]研究發(fā)現miR-122a富集于精子形成時期的雄性生殖細胞中，通過裂解編碼過渡蛋白2 的mRNAs調控其表達。此外，有研究表明，miR-13可通過增強生精細胞特異性標志物的表達來促進精子形成過程[36]，miR-888對維持成熟精子的結構和鞭毛的蠕動具有重要作用[37]。盡管減數分裂后期和單倍體生殖細胞是精子生成過程中miRNAs產生的主要根源[38]，但目前關于miRNAs對精子形成過程調控作用的報道卻較少。

五、miRNAsiRNAs與男性不育

精子發(fā)生是一個復雜的細胞分化過程，精確的基因表達調控是正常精子發(fā)生的基礎，任一階段的調控錯誤與（或）表達缺陷都會在一定程度上影響雄（男）性生育能力或導致不育。精子發(fā)生的各階段均存在不同程度miRNAs的表達。為探明miRNAs在不同類型精子發(fā)生過程失敗中的具體作用，Yang等[39, 40]在人類正常睪丸組織中進行了miRNAs表達譜的研究，并確定了幾種不同的miRNAs表達模式。此外，Jodar等[1]研究發(fā)現精子中的miRNAs可在轉錄或轉錄后水平上調控早期胚胎發(fā)育過程中的基因表達。值得注意的是miR-34c是人類精子中最豐富的miRNA，其也可在小鼠成熟精子或受精卵中檢測到，這種由精子運載的miRNA是第一次卵裂所必需的[41]。表明精子中miRNAs的異常表達不僅影響男性生育能力，還會阻礙早期胚胎發(fā)育過程。此外，miR-141、miR-429和miR-7-1-3p在非梗阻性無精子癥患者精漿中表達顯著上升，可作為診斷該疾病的一種有效生物標志物[42]，并且來自睪丸和附睪液中的miRNAs已被證實是精子生成和成熟障礙的無創(chuàng)性生物標志物[43]。

六、問題與展望

遺傳和表觀遺傳信息的成功傳代有賴于精子發(fā)生過程中基因組的保護和表觀遺傳標記的正確建立和維持。miRNAs產生途徑是基因表達和靶mRNAs結局的重要調控機制之一，研究發(fā)現擬染色體作為RNAs處理和代謝的載體，在減數分裂至精子形成階段miRNAs的轉運過程中發(fā)揮了重要作用[44]。miRNAs、miRNA相關蛋白和RNA綁定蛋白SAM68均存在于擬染色體上，SAM68通過與Drosha和Dicer相互作用調控miRNAs的表達，在miRNAs產生途徑中具有重要作用[45]。精子發(fā)生過程中miRNAs表達和功能研究，有助于我們對男性生育能力進行正確評價，這對處理日益增多的男性不育疾病和滿足輔助生殖技術的需要至關重要。

研究表明miRNAs存在于成熟的精子和精液中，精子發(fā)生障礙會導致其表達譜出現異常，造成男性不育，并與睪丸癌的發(fā)生有一定聯系，miRNAs可作為男性不育疾病診斷和分型的潛在生物標志物。Iorio等[46]研究發(fā)現一些miRNAs可以與其它表觀遺傳修飾相互作用，如miRNAs可直接或間接地調控DNA甲基轉移酶，影響從頭甲基化和維持甲基化過程等。反之，DNA甲基化也可影響miRNAs的表達。這種調控機制可以沉默抑癌基因或激活癌基因，對腫瘤發(fā)生也具有重要作用[47, 48]，對單個miRNA或miRNA家族進行準確的功能劃分，可以促進我們對男性不育與男性生殖腫瘤之間相互關系的理解。

精子發(fā)生是一個復雜的細胞分化過程，其miRNAs呈階段特異性表達，未知領域還很多，因此，精子發(fā)生過程中miRNAs的發(fā)生、種類、功能作用，以及與其它表觀遺傳調控因子的相互作用關系等，尚有待于進一步深入研究。

致謝：本文由河北省自然科學基金資助項目（編號：H2013201259）；河北省2013留學回國人員科研活動項目（編號：C2013005002）；河北大學創(chuàng)新訓練項目（編號：201410075029，201410075073）；國家第48批“留學回國人員科研啟動基金”（編號：702850515001）基金項目資助

關鍵詞微RNAs; 精子發(fā)生; 不育, 男性

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（2014-12-13收稿）

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中圖分類號R 698.2