CALR基因突變在骨髓增殖性腫瘤中的臨床研究

王彥麗 戚光祖 郭洪娜 接貴濤 范美英

山東省臨沂市沂水中心醫(yī)院血液科，山東臨沂 276400

BCR/ABL1 融合基因陰性的骨髓增殖性腫瘤（myeloproliferative meoplasm，MPN）是一組起源于多能造血干細胞的惡性腫瘤，表現(xiàn)為骨髓細胞一系或多系過度增殖， 包括真性紅細胞增多癥（polycythemia，PV）、原發(fā)性血小板增多癥（essential thrombocthemia，ET）、原發(fā)性骨髓纖維化（primary myelofibrosis，PMF），臨床上有發(fā)生動靜脈血栓、髓外造血、骨髓纖維化、甚至向白血病轉(zhuǎn)化[1-2]。 JAK2V617F 突變見于97%的PV，50%～60%的ET 及PMF 患者[3]。MPL515 基因突變可見于3%～5%的JAK2V617F 突變陰性的ET 及PMF 患者[4]。 自2005 年JAK2V617F 和MPL515 突變相繼被發(fā)現(xiàn)并納入WHO 診斷標準，該突變的發(fā)現(xiàn)改變了MPN 的診斷和分類，從分子的角度詮釋了MPN的發(fā)病機制。但仍有40%的ET 及PMF 患者未檢測到JAK2V617F 基因突變， 最近研究發(fā)現(xiàn)CALR 見于JAK2V617F 陰性的ET 及PMF 患者， 本研究對臨床初診MPN 患者進行了JAK2V617F、CALR 及MPL515基因突變分析，現(xiàn)報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2012 年1 月～2015 年3 月在臨沂市沂水中心醫(yī)院就診的72 例初診MPN 患者。其中PV23例，男11 例，女12 例，年齡38～72 歲；ET26 例，男12例，女14 例，年齡25～80 歲；PMF23 例，男16 例，女7例，年齡39～76 歲。所有患者均經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準并簽署知情同意書。

1.2 檢驗指標

對患者臨床資料、骨髓和外周血涂片、骨髓活檢進行分析，按照WHO 造血和淋巴組織腫瘤分類標準（2008）進行診斷。

1.3 方法

CALR 基因突變分析：用血液基因組DNA 提取試劑盒（QIAamp DNA Mini Kit，生產(chǎn)商：Qiagen 公司）提取骨髓細胞基因組DNA，CALR9 號外顯子PCR 擴增引物（生產(chǎn)商：Invitrogen 公司；使用濃度：5.0 pmol/μL；貯存條件：干粉于-20℃保存，工作液于4℃保存；有效期：-20℃為1 年，4℃為半年），設(shè)計序列：引物名稱：CALR-X9-Fwd， 引物序列：FAM-CTGGTCCTGGTCCTGATGT； 引物名稱：CALR-X9-Rev， 引物序列：TCTCACAGAGACATTATTTGGC。 PCR 體 系 包 括DNA 50～100 ng，2×Taq PCR Master Mix（TIANGEN 公司產(chǎn)品）15 μL，正反向引物各0.5 μL，加去水離子補足體系至30 μL。 反應(yīng)條件：98°C 預(yù)變性3 min，98°C變性10 s，63°C 退火30 s，72°C 延伸30 s，共29 個循環(huán)，72°C 延伸5 min。PCR 擴增產(chǎn)物經(jīng)回收、純化后實驗數(shù)據(jù)采用片段分析軟件Genemapperid V4.1 進行分析，分析示例見圖1。

圖1 Genemapperid V4.1 軟加分析示例

2 結(jié)果

2.1 72 例MPN 患者臨床及實驗室檢查特點

根據(jù)2008 年WHO 分型診斷標準，PV 22 例、ET 26 例、PMF 23 例、MPN-u 1 例。所有患者均接受常規(guī)治療至隨訪結(jié)束，患者均存活。在8 例CALR 突變的ET患者血小板計數(shù)高于JAK2 突變陽性患者（表1）；8例CALR 突變的PMF 患者中7 例為男性，發(fā)病年齡較小，且呈現(xiàn)出較低的白細胞計數(shù)、血紅蛋白水平（表2）。

表1 8 例CALR 突變ET 患者初診時臨床、實驗室特征

表2 8 例CALR 突變PMF 患者初診時臨床、實驗室特征

2.2 JAK2V617F、CALR 及MPL515 基因突變檢測結(jié)果

22 例PV 患者中16 例攜帶有JAK2V617F 突變（突變率為68%），未檢測出CALR 基因突變；26 例ET患者中12 例攜帶有JAK2V617F 突變（突變率為46%），8 例檢測出CALR 基因突變（突變率為31%），JAK2V617F突變陰性患者中CALR 基因突變率為57%（8/14）；23例PMF 患者中11 例攜帶有JAK2V617F 突變（突變率為49%），8 例檢測出CALR 基因突變（突變率為35%），JAK2V617 突變陰性患者中CALR 基因突變?yōu)闉?7%（8/12）。 在72 例患者中均未檢測到MPL515 突變。

3 討論

CALR 為Ca2+結(jié)合蛋白復(fù)合體， 主要定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（edoplasmic reticulum，ER）腔內(nèi)。CALR 基因定位于染色體19p13.2～p13.3，包含9 個外顯子，大小為4.2 kb，其編碼的CALR 由高度保守近似球形結(jié)構(gòu)的N 端（1～180 氨基酸殘基）、 參與ER 內(nèi)Ca2+儲存的酸性c端（291～400 氨基酸殘基）及中間富含脯氨酸而形成的具伸出式結(jié)構(gòu)的P 端（181～290 氨基酸殘基）。 3 個結(jié)構(gòu)域均具有各自特殊的功能，N 端及P 端主要發(fā)揮分子伴侶的作用，C 端的作用主要為調(diào)節(jié)ER 中的Ca2+濃度， 保持細胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)，CALR 基因缺失將減少ER 內(nèi)Ca2+的儲存量。CALR C 端的終點為ER 滯留信號（KDEI） 肽，KDEL 可使CALR 從高爾基體回到ER，阻止其分泌至ER 外，具有靶向定位作用。多項研究發(fā)現(xiàn)CALR 突變呈陽性MPN 患者骨髓細胞中突變型CALR 大部分定位于ER 內(nèi)[6]。 同時，CALR 介導(dǎo)的Ca2+穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)可影響多種細胞功能， 包括巨核細胞分化成熟及血小板的形成、 整合素介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫應(yīng)答、細胞凋亡、增殖及吞噬作用、介導(dǎo)傷口愈合及纖維化。 早期研究證實BCR/ABL1 陰性MPN 患者存在JAK2V617 突變。Kampfl 等[6]和Nangalia 等[7]采用外顯子測序的方法在JAK2/MPL 陰性的大部分標本中檢測到CALR 第9 個外顯子突變。并對大樣本健康人群進行CALR 目標基因檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在健康個體對照組、淋巴系腫瘤、急性白血病及實體腫瘤中均未見CALR 基因突變。 結(jié)果提示CALR 基因突變?yōu)镴AK2 及MPL 基因突變陰性的ET 及PMF 的特異性分子標志物。 因CALR 基因突變均位于第9 個外顯子， 本研究采用直接檢測第9 個外顯子的方法在JAK2 基因突變陰性的ET 患者中檢測到CALR 突變率為57%；23 例PMF 患者中8 例檢測出CALR 基因突變（突變率35%）；研究表明，CALR 基因突變不會發(fā)生在PV 患者中， 本組22 例患者中均未檢測到CALR 基因突變也證實了這一觀點。 2014 年，Tefferi等[8]檢測了576 例ET 患者中，CALR 的突變率為15%；Rumi 等[9]檢測了745 例患者，CALR 的突變率為24%；Chi 等[10]檢測了289 例患者，CALR 的突變率為9%；Kim 等[11]檢測CALR 突變率為12.6%。 本實驗中ET 患者CALR 的突變率為31%，在JAK2/MPL 陰性的ET患者中突變率57%，而國內(nèi)學(xué)者報道436 例亞洲人CALR基因突變情況，CALR 基因的突變率為22.7%，在JAK2/MPL 陰性的ET 患者中， 其突變率為52.7%，本實驗與國內(nèi)報道相符。 Rumi 等[12]對CALR 突變呈陽性ET 患者研究發(fā)現(xiàn)， 極少數(shù)患者的CALR 突變的等位基因負荷＞75%，該結(jié)果推測ET 的發(fā)生可能為雜合子克隆逐步積累，最終在骨髓中占據(jù)數(shù)量優(yōu)勢，特異性刺激巨核細胞導(dǎo)致。本研究顯示CALR 突變患者均為雜合子。 本研究中PMF 患者CALR 基因突變（突變率35%），與Langabeer 等[13]報道的25%～35%的突變率相似。研究發(fā)現(xiàn)CALR 突變與其臨床表現(xiàn)和預(yù)后有重要的相關(guān)性。 在ET 和PMF 患者中，CALR 基因突變PMF 患者較JAK2 突變者血小板計數(shù)更高、年齡更小、血紅蛋白更低，白細胞計數(shù)更低，PMF 患者具有更好的生存率[14]，本研究中患者也具有以上臨床特點。有文獻報道發(fā)生CALR 和JAK2 突變者發(fā)生心血管事件的概率是13.4%和30.1%，10 年血栓癥累計發(fā)生率分別為5.1%和14.5%。 在PMF 患者中，Tefferi 等[8]在254 例標本中篩查了一些與MPN 相關(guān)的基因突變，發(fā)現(xiàn)他們與CALR 突變沒有顯著的分子或遺傳學(xué)關(guān)聯(lián)。 Tefferi 等[15]也報道在PMF 患者中，發(fā)生1 型CALR 突變者比2 型突變者有更好的預(yù)后。 由本組實驗可以看出，CALR 是MPN 中較易發(fā)生突變的基因，可將CALR 突變檢測納入MPN 診斷的常規(guī)指標。 在臨床上可以遵循以下思路考慮對MPN 的診斷[16-20]：①由于CALR 突變不發(fā)生在PV 的患者，所以它不能用來篩查PV 或PV 后骨髓纖維化的疑似患者；②CALR、JAK2 和MPL 突變是互相排斥的， 對已知發(fā)生了JAK2 或MPL 突變的患者無需篩查CALR 突變；③由于MPL 突變率在三者中最低， 對ET 或PMF 的疑似病例，應(yīng)先行JAK2V617 突變篩查，若陰性再行CALR突變篩查，CALR 陰性則行MPL 突變篩查。 盡管CALR 基因突變等為疾病的診斷提供了較為特異的分子指標，但仍有10%的ET 和PMF 患者需要結(jié)合骨髓病理檢查結(jié)果加以診斷。

綜上所述，CALR 基因突變是JAK2V617F 突變陰性的MPN 特異性分子標志物。 將CALR 基因突變檢測納入MPN 診斷標準可以提高診斷的準確性減少漏診率。 CALR 基因突變的檢測有助于JAK2V617F 突變陰性的MPN 的鑒別診斷， 對CALR 基因突變功能的進一步研究可望找到JAK2V617 突變陰性MPN 的分子治療靶標。

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