鹽酸小檗堿明膠納米粒的制備

李小第，張海龍，黃小艷，王 妮，鮑 和，高 陽＊（.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部第二附屬醫(yī)院藥劑科，西安 70004；.西安交通大學(xué)藥學(xué)院，西安 7006）

鹽酸小檗堿明膠納米粒的制備

李小第1，張海龍2，黃小艷2，王 妮2，鮑 和1，高 陽2＊（1.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部第二附屬醫(yī)院藥劑科，西安 710004；2.西安交通大學(xué)藥學(xué)院，西安 710061）

目的 制備鹽酸小檗堿明膠納米粒。方法 以明膠為囊材，采用單凝聚法制備鹽酸小檗堿明膠納米粒，并通過單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化其最佳制備工藝。結(jié)果 鹽酸小檗堿納米粒最佳制備工藝條件為：明膠質(zhì)量濃度為10g·L－1，凝聚劑體積分?jǐn)?shù)為81.25%，滴定速度為2mL·min－1，攪拌速度為600r·min－1，投料比（鹽酸小檗堿與明膠的質(zhì)量比）為2∶4，交聯(lián)劑體積分?jǐn)?shù)為10%。結(jié)論 該制備工藝簡便可行，制得的鹽酸小檗堿納米粒有較明顯的緩釋效果。

鹽酸小檗堿；明膠；納米粒

鹽酸小檗堿俗稱黃連素，是從黃連、黃柏等植物中提取出的一種異喹啉類生物堿。其抗菌譜廣，對金黃色葡萄球菌、溶血性鏈球菌、志賀氏痢疾桿菌、弗氏和淋球菌均有抗菌作用，還有增強(qiáng)白血球的吞噬作用，臨床上主要用于治療腸道感染、腹瀉。近年來有研究表明，鹽酸小檗堿具有多種藥理學(xué)活性，例如對中樞神經(jīng)系統(tǒng)、糖尿病、心血管系統(tǒng)、腫瘤等都有不同程度的治療效果，有著十分廣闊的應(yīng)用前景［1］。但鹽酸小檗堿溶解度低，易被胃腸道中的黏蛋白吸附［2］，最終會(huì)導(dǎo)致口服后生物利用度較低，難以達(dá)到發(fā)揮藥理作用的有效濃度。且鹽酸小檗堿作為一種季銨鹽類，不宜靜脈滴注和肌肉注射，否則易引起過敏性休克、藥疹等不良反應(yīng)［3］。因此，鹽酸小檗堿在臨床上的應(yīng)用受到限制。

近年來，納米給藥系統(tǒng)越來越受到關(guān)注，將藥物包裹于納米粒中，不僅可以調(diào)節(jié)釋藥速度，改善藥物在體內(nèi)的分布，提高生物利用度，而且還可以減少毒性和不良反應(yīng)［4－6］。而明膠是由動(dòng)物骨頭、皮膚和筋腱熬制而成，無毒，生物相容性好，可生物降解［7］，且表面存在大量－NH2和－OH，為進(jìn)一步載藥提供了活性位點(diǎn)［8］，是一種常用的天然高分子載體材料。因此本實(shí)驗(yàn)以明膠為囊材，采用單凝聚法制備鹽酸小檗堿明膠納米粒，通過優(yōu)化鹽酸小檗堿納米粒的處方及制備條件來獲得其最佳制備工藝，再對制得的納米粒進(jìn)行表征，最后，對制得的鹽酸小檗堿納米粒的體外釋藥行為進(jìn)行了初步考察。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 DF－101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（河南省予華儀器有限公司）；Malvern Nano－ZS 90型馬爾文粒度分布儀（Malvern）；KQ5200型超聲波清洗機(jī)（昆山舒美科技有限公司）；AL204電子天平（梅特勒－托利多儀器（上海）有限公司）；pH計(jì)PB－10（賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司）；

1.2 試藥 鹽酸小檗堿（西安冠宇生物技術(shù)有限公司）；明膠（北京寰宇科技有限公司）；乙二醛（阿拉丁試劑有限公司，批號(hào)A1305107）；甘氨酸（阿拉丁試劑有限公司，批號(hào)D1307075）；無水乙醇（天津市富宇精細(xì)化工有限公司，分析純）。

2 方法

2.1 明膠納米粒的制備 用雙蒸水配制一定質(zhì)量濃度的明膠水溶液，加熱充分溶脹后，用1mol·L－1氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7.0。精密稱取一定量的鹽酸小檗堿加入到明膠溶液中，37℃水浴、600 r·min－1磁力攪拌，再超聲數(shù)分鐘后緩慢加入凝聚劑，隨后逐滴加入100μL乙二醛溶液（交聯(lián)劑）交聯(lián)固化5min，再緩慢加入500μL 15mg·mL－1甘氨酸溶液中和多余的乙二醛。

2.2 鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

2.2.1 鹽酸小檗堿紫外最大吸收波長的確定 用乙醇為溶劑配制適當(dāng)質(zhì)量濃度的鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)溶液，以空白無水乙醇作為參比，在紫外分光光度計(jì)上進(jìn)行全量程掃描，確定鹽酸小檗堿的最大吸收波長。

2.2.2 鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取50 mg鹽酸小檗堿原藥，置于50mL的量瓶中，加入無水乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。準(zhǔn)確移取該溶液1 mL，置于10mL量瓶中，用無水乙醇定容，再分別精密吸取0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，1.1和1.2mL，置于10mL量瓶中，加入無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得一系列鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)溶液。最后用紫外分光光度計(jì)于鹽酸小檗堿最大吸收波長處分別測定各鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度值。

2.3 納米粒制備工藝的優(yōu)化 以凝聚劑的種類、攪拌速度、凝聚劑的體積分?jǐn)?shù)、凝聚劑的滴定速度、囊材明膠的質(zhì)量濃度、投料比（鹽酸小檗堿與明膠的質(zhì)量比）和交聯(lián)劑乙二醛的體積分?jǐn)?shù)為主要考察因素，如表1所示，以制得的納米粒溶液乳光強(qiáng)弱、一定時(shí)間內(nèi)體外釋放度及平均粒徑為評(píng)價(jià)指標(biāo)，單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化鹽酸小檗堿明膠納米粒的制備工藝。

表1 制備鹽酸小檗堿明膠納米粒的影響因素Tab.1 The influence factors of preparation of berberine hydrochloride－loaded gelatin nanoparticles

2.4 鹽酸小檗堿明膠納米粒體外釋放行為的考察

采用透析法進(jìn)行納米粒體外釋放度的研究［9］。分別精密吸取陰性對照組溶液（鹽酸小檗堿溶液）、陽性對照組溶液（制備小檗堿納米粒處方的簡單混合）及各條件下制備的鹽酸小檗堿明膠納米粒溶液各1mL，置于預(yù)處理過的透析袋中，封好兩端后置于盛有50mL釋放介質(zhì)（pH 7.4PBS緩沖溶液）的錐形瓶中，于37℃恒溫水浴，以200r·min－1磁力攪拌，分別在不同時(shí)間點(diǎn)15，30，60，90，120，150，180，210，240，270，300，330和360min各吸取釋放介質(zhì)1mL，同時(shí)向錐形瓶中補(bǔ)充相同體積的PBS緩沖溶液。用紫外分光光度計(jì)測定各時(shí)間點(diǎn)取出的樣品溶液的吸光度，并計(jì)算鹽酸小檗堿的含量，計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)的累積釋放率。計(jì)算公式如下：

累積釋放率＝（透析外液藥物總量／納米粒藥物總量）×100%。

2.5 粒徑及粒度分布測試 用馬爾文激光粒度分析儀測定鹽酸小檗堿明膠納米粒粒徑分布。將準(zhǔn)備好的待測鹽酸小檗堿明膠納米粒溶液進(jìn)樣，得到納米粒粒徑分布及其平均粒徑結(jié)果。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 紫外分光光度法制備鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)曲線 掃描結(jié)果顯示，鹽酸小檗堿在340nm處有最大吸收，以不同質(zhì)量濃度的鹽酸小檗堿為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Y＝0.062 9 X＋0.006 4（r＝0.999 2，n＝3），結(jié)果表明，鹽酸小檗堿質(zhì)量濃度在2～12.0μg·mL－1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.2 單因素考察法優(yōu)化鹽酸小檗堿明膠納米粒制備工藝

3.2.1 凝聚劑的影響 采用硫酸鈉和乙醇2種不同的凝聚劑，固定其他條件（攪拌速度為600r·min－1，明膠質(zhì)量濃度為10g·L－1，投料比為2∶4，凝聚劑滴定速度為2mL·min－1，交聯(lián)劑體積分?jǐn)?shù)為20%），以納米粒的乳光效果為初步評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察凝聚劑對納米粒制備工藝的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，硫酸鈉作凝聚劑的條件更加苛刻，不易出現(xiàn)納米粒溶液特有的乳光現(xiàn)象，而乙醇作凝聚劑時(shí)，乳光明顯。因此，我們選用乙醇作為凝聚劑進(jìn)行進(jìn)一步考察。

3.2.2 攪拌速度的影響 采用攪拌速度為200，400和600r·min－1，固定其他條件（凝聚劑體積分?jǐn)?shù)為81.25%，明膠質(zhì)量濃度為10g·L－1、投料比為2∶4、凝聚劑滴定速度為2mL·min－1、交聯(lián)劑體積分?jǐn)?shù)為20%），以納米粒的乳光效果為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察轉(zhuǎn)速對納米粒制備工藝的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，攪拌速度為200r·min－1制備納米溶液，不易出現(xiàn)乳光，容易產(chǎn)生片狀沉淀，攪拌速度為400r·min－1制備的納米溶液乳光不強(qiáng)烈，常溫下放置，容易析出沉淀，而攪拌速度為600r·min－1，制備的納米溶液乳光狀態(tài)良好，且較穩(wěn)定。說明轉(zhuǎn)速越高，凝聚成的納米粒分散性更好，不容易聚集形成沉淀。而實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)攪拌速度大于600r·min－1，溶液容易飛濺，因此，我們選用600r·min－1的攪拌速度進(jìn)行進(jìn)一步研究。

3.2.3 凝聚劑（乙醇）體積分?jǐn)?shù)的影響 采用體積分?jǐn)?shù)分別為81.25%和100%的乙醇溶液為凝聚劑，固定其他條件（攪拌速度為600r·min－1，明膠質(zhì)量濃度為10g·L－1，投料比為2∶4，凝聚劑滴定速度為2 mL·min－1，交聯(lián)劑體積分?jǐn)?shù)為20%），以一定時(shí)間內(nèi)體外釋放度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察凝聚劑體積分?jǐn)?shù)對納米粒制備工藝的影響。結(jié)果顯示，體積分?jǐn)?shù)分別為81.25%和100%的乙醇溶液為凝聚劑制備的鹽酸小檗堿納米粒6h累積釋放率分別約為81.35%和89.72%，說明凝聚劑體積分?jǐn)?shù)為81.25%的乙醇制得的鹽酸小檗堿納米粒的緩釋效果較體積分?jǐn)?shù)100%的乙醇更優(yōu)，因此，我們選用體積分?jǐn)?shù)為81.25%的乙醇溶液為凝聚劑進(jìn)行進(jìn)一步研究。

3.2.4 明膠質(zhì)量濃度的影響 采用質(zhì)量濃度分別為10，30和50g·L－1的明膠溶液，固定其他條件（攪拌速度為600r·min－1，凝聚劑體積分?jǐn)?shù)為81.25%，投料比為2∶4，凝聚劑滴定速度為2mL·min－1，交聯(lián)劑體積分?jǐn)?shù)為20%），以一定時(shí)間內(nèi)體外釋放度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察明膠質(zhì)量濃度對納米粒制備工藝的影響。結(jié)果顯示，質(zhì)量濃度分別為10，30和50g·L－1的明膠溶液制得的鹽酸小檗堿納米粒6h累積釋放率分別約為81.35%，85.03%和86.56%。說明隨著明膠質(zhì)量濃度的增加，制得的鹽酸小檗堿納米粒的體外緩釋作用隨之降低，且以質(zhì)量濃度為10g·L－1的明膠為囊材制得的納米粒有較好的緩釋效果。因此，選擇質(zhì)量濃度為10g·L－1的明膠進(jìn)行進(jìn)一步研究。

3.2.5 投料比（鹽酸小檗堿與明膠的質(zhì)量比）的影響采用投料比分別為1∶4，2∶4和3∶4，固定其他條件（攪拌速度為600r·min－1，凝聚劑體積分?jǐn)?shù)為81.25%，明膠質(zhì)量濃度為10g·L－1，凝聚劑滴定速度為2mL·min－1，交聯(lián)劑體積分?jǐn)?shù)為20%），以一定時(shí)間內(nèi)體外釋放度為指標(biāo)，考察投料比對明膠納米粒制備工藝的影響。結(jié)果顯示，投料比為1∶4，2∶4和3∶4條件下，制備的鹽酸小檗堿納米粒6h累積釋放率分別約為93.16%，81.35%和95.69%。說明投料比為2∶4制得的納米粒具有更好的緩釋效果。因此，我們選用投料比為2∶4進(jìn)行進(jìn)一步研究。

3.2.6 凝聚劑滴定速度的影響 凝聚劑滴定速度分別設(shè)為1，2和3mL·min－1，固定其他條件（攪拌速度為600r·min－1，凝聚劑體積分?jǐn)?shù)為81.25%，明膠質(zhì)量濃度為10g·L－1，投料比為2∶4，交聯(lián)劑體積分?jǐn)?shù)為20%），以一定時(shí)間內(nèi)體外釋放度為指標(biāo)考察凝聚劑滴定速度對納米粒制備工藝的影響。結(jié)果顯示，凝聚劑滴定速度為1，2和3mL·min－1制備得到的鹽酸小檗堿納米粒6h累積釋放率分別約為91.23%，81.35%和90.78%。說明當(dāng)凝聚劑滴定速度為2mL·min－1時(shí)，明膠納米粒有較好的緩釋效果。

3.2.7 交聯(lián)劑（乙二醛）體積分?jǐn)?shù)的影響 采用體積分?jǐn)?shù)分別為10%和20%的乙二醛溶液，固定其他條件（攪拌速度為600r·min－1，凝聚劑體積分?jǐn)?shù)為81.25%，明膠質(zhì)量濃度為10g·L－1，投料比為2∶4，凝聚劑滴定速度為2mL·min－1），以納米粒的粒徑分布及平均粒徑為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察交聯(lián)劑的濃度對納米粒制備工藝的影響。結(jié)果顯示，交聯(lián)劑乙二醛體積分?jǐn)?shù)為10%和20%條件下，制得的鹽酸小檗堿納米粒平均粒徑分別為209.50和2 053.97nm。說明降低乙二醛溶液體積分?jǐn)?shù)，可大大減小納米粒的粒徑。

3.2.8 最佳工藝的確定 精密稱取一定質(zhì)量明膠加雙蒸水配成質(zhì)量濃度為10g·L－1的明膠溶液，加熱充分溶脹后，用1mol·L－1氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)溶液pH至7.0，取2mL質(zhì)量濃度為10g·L－1的明膠溶液，置于25mL燒杯中，在37℃、600r·min－1的條件下，加入精密稱取的一定量鹽酸小檗堿（鹽酸小檗堿與明膠質(zhì)量比為2∶4），攪拌數(shù)分鐘后再超聲使其分散均勻。隨后逐滴加入8mL體積分?jǐn)?shù)為81.25%的乙醇溶液（滴定速度為2mL·min－1），再逐滴滴加100μL體積分?jǐn)?shù)為10%的乙二醛溶液，交聯(lián)固化5min，加入15mg·mL－1甘氨酸500μL中和多余的乙二醛。鹽酸小檗堿明膠納米粒制備的最佳工藝條件見表2。

表2 鹽酸小檗堿明膠納米粒制備的最佳工藝條件Tab.2 The optimal conditions for the preparation of berberine hydrochloride－loaded gelatin nanoparticles

3.2.9 體外釋藥行為的考察 模擬體內(nèi)條件，以磷酸鹽緩沖溶液（pH 7.4）為釋放介質(zhì)，考察陰性對照品溶液、陽性對照溶液在最佳制備工藝條件下制得的鹽酸小檗堿明膠納米粒在6h內(nèi)的體外釋藥行為，結(jié)果見表3和圖1。結(jié)果顯示，陰性對照組釋藥較快，在2h藥物已基本釋放完全，累積釋藥率達(dá)到101.1%±0.65%，而陽性對照組和納米粒組3h后釋放曲線趨于穩(wěn)定，6h的累積釋藥率分別為90.65%±0.25%和80.26%±1.26%，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，在納米粒組與陽性對照組的6h累積釋放率具有顯著性差異。說明優(yōu)化條件下制得的鹽酸小檗堿納米粒有一定的緩釋效果。

表3 鹽酸小檗堿明膠納米粒體外釋放實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Results of berberine hydrochloride－loaded gelatin nanoparticles release tests in vitro

圖1 鹽酸小檗堿納米粒體外釋放曲線Fig.1 The in vitro release profile of berberine hydrochlorideloaded gelatin nanoparticles

3.2.10 粒徑及粒度分布的考察 通過馬爾文激光粒度儀測最佳工藝條件下制得的鹽酸小檗堿明膠納米粒的粒徑分布，結(jié)果如圖2。結(jié)果表明，制得的鹽酸小檗堿納米粒粒徑分布較均勻，平均粒徑為209.5nm。

圖2 鹽酸小檗堿明膠納米粒粒徑分布Fig.2 The size distribution of the berberine hydrochlorideloaded gelatin nanoparticles

4 討論

單凝聚法是相分離法的一種，是指只用一種高分子作為壁材，將芯材分散到溶有壁材的水溶液中，然后加入凝聚劑（如乙醇、丙酮等強(qiáng)親水性有機(jī)溶劑或無機(jī)鹽），由于大量水與凝聚劑結(jié)合，使壁材的溶解度降低而凝聚成囊［10］。單凝聚法因是在水中成囊，主要適合于難溶性藥物的微囊化，但并非所有的不溶于水的藥物都適合單凝聚法，該法要求藥物難溶于水，但也不能過分疏水，否則僅形成不含藥物的空囊。而鹽酸小檗堿難溶于冷水，但其在熱水中有一定的溶解度，因此鹽酸小檗堿適合于單凝聚法。且目前尚沒有關(guān)于鹽酸小檗堿明膠納米粒的制備的相關(guān)報(bào)道，為了提高鹽酸小檗堿的水溶性及改善其體內(nèi)外釋藥行為，本研究采用單凝聚法制備鹽酸小檗堿明膠納米粒，結(jié)果表明，優(yōu)化條件后制得的明膠納米粒粒徑較小，分布均勻，且有較明顯的緩釋效果。

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，凝聚劑的種類、體積分?jǐn)?shù)、明膠溶液的質(zhì)量濃度、投料比、凝聚劑的滴定速度、交聯(lián)劑的體積分?jǐn)?shù)是影響單凝聚法制備鹽酸小檗堿明膠納米粒的主要因素。在考察明膠質(zhì)量濃度對鹽酸小檗堿明膠納米粒制備影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)?shù)渭幽蹌w積分?jǐn)?shù)為81.25%的乙醇）體積相同時(shí)，明膠質(zhì)量濃度越大，溶液越渾濁，越容易析出絮狀沉淀。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，以乙醇為凝聚劑，采用單凝聚法制備明膠微囊時(shí)，明膠質(zhì)量濃度越高，乙醇用量越少［11］。主要原因可能是由于明膠不溶于乙醇，明膠量越多，越容易析出沉淀。在考察交聯(lián)劑濃度對鹽酸小檗堿納米粒制備的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，體積分?jǐn)?shù)為20%的乙二醛制得的納米粒比體積分?jǐn)?shù)為10%的乙二醛制得的納米粒粒徑大得多。Kommareddy等以明膠為囊材、乙醇為凝聚劑，采用單凝聚法制備硫醇化明膠納米粒時(shí)發(fā)現(xiàn)，未添加交聯(lián)劑制得的納米粒粒徑小于加入交聯(lián)劑制得的納米粒［12］。因此，交聯(lián)劑的濃度可能是影響粒徑大小的一個(gè)重要因素，交聯(lián)劑添加過多，會(huì)使納米粒聚集粘連在一起，導(dǎo)致粒徑過大。在研究凝聚劑滴定速度對鹽酸小檗堿納米粒制備影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，凝聚劑（體積分?jǐn)?shù)為81.25%的乙醇）的滴定速度對鹽酸小檗堿納米粒的制備有著非常重要的影響。凝聚劑滴定速度過快，納米粒易粘連成團(tuán)，容易導(dǎo)致溶液渾濁，滴定速度過慢會(huì)使制得的納米粒溶液乳光不明顯，且緩釋效果也減弱。并且隨著凝聚劑滴加的量逐漸增多，納米粒溶液乳光越明顯，但凝聚劑加入量過多時(shí)，溶液中有片狀沉淀物析出。因此，在采用該方法制備明膠納米粒過程中，需精準(zhǔn)把控凝聚劑的滴加量和滴定速度。通過實(shí)驗(yàn)我們獲得了單凝聚法制備鹽酸小檗堿的最佳工藝，為以后該制劑的研究奠定了基礎(chǔ)。參考文獻(xiàn)：

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Preparation of berberine hydrochloride－loaded gelatin nanoparticles

LI Xiaodi1，ZHANG Hailong2，Huang Xiaoyan2，WANG Ni2，BAO He1，GAO Yang2＊（1.Department of Pharmacy，the Second Affiliated Hospital，Health Science Center，Xi′an Jiaotong University，Xi′an 710004，China；2.School of Pharmacy，Xi′an Jiaotong University，Xi′an 710061，China）

Objective To prepare berberine hydrochloride－loaded gelatin nanoparticles.Methods Berberine hydrochloride－loaded gelatin nanoparticles were prepared by using gelatin as coating materials by simple coacervation，and the preparation process was optimized by the single－factor experiments.Results The optimal conditions for the preparation of berberine hydrochloride－loaded gelatin nanoparticles were as follows：the concentration of gelatin，10g·L－1；the volume fraction of coagulant，81.25%；the titration speed of coagulant，2mL·min－1；the stirring speed，600r·min－1；the mass ratio of berberine hydrochloride and gelatin，2∶4；the volume fraction of curing agent，10%.Conclusion The preparation process of the berberine hydrochloride－loaded gelatin nanoparticles was simple and practical，and the gelatin nanoparticles prepared under the optimal conditions had an obvious sustained－release effect.

berberine hydrochloride；gelatin；nanoparticles

10.3969／j.issn.1004－2407.2015.04.021

R944

A

1004－2407（2015）04－0393－05

2014－11－21）

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助項(xiàng)目

李小第，男，主管藥師

＊通信作者：高陽，女，副教授