HPLC法測定血漿中異煙肼和乙酰異煙肼的質(zhì)量濃度及異煙肼在老年患者體內(nèi)的藥代動力學研究

張 亮，林霏申，侯文潔，錢智磊，丁紅梓＊（.南京市胸科醫(yī)院藥學部，南京 009；.南京市胸科醫(yī)院結(jié)核科，南京 009）

·藥劑·

HPLC法測定血漿中異煙肼和乙酰異煙肼的質(zhì)量濃度及異煙肼在老年患者體內(nèi)的藥代動力學研究

張 亮1，林霏申2，侯文潔1，錢智磊1，丁紅梓1＊（1.南京市胸科醫(yī)院藥學部，南京 210029；2.南京市胸科醫(yī)院結(jié)核科，南京 210029）

目的 建立高效液相色譜法測定患者血漿中異煙肼和乙酰異煙肼質(zhì)量濃度的方法，并對目前應(yīng)用較多的老年肺結(jié)核患者進行藥代動力學研究。方法 10名老年患者，年齡大于65歲，診斷為肺結(jié)核，口服給予異煙肼0.3g，不同時間采集患者血樣，用HPLC法測定血漿藥物質(zhì)量濃度，用DAS3.1軟件計算藥代動力學參數(shù)。結(jié)果 用非房室模型計算出了異煙肼在患者體內(nèi)的藥代動力學參數(shù)。結(jié)論 該方法簡單、靈敏、準確，適用于體內(nèi)異煙肼藥代動力學分析。異煙肼在老年患者的藥代動力學特征與年輕人群的藥代動力學特征存在差異。

異煙肼；乙酰異煙肼；藥代動力學；高效液相色譜法

結(jié)核病（tuberculosis，TB）每年會導(dǎo)致數(shù)百萬人死亡［1］。異煙肼（INH）是治療各種結(jié)核病最常用的藥物之一，它與利福平（RFP）、吡嗪酰胺（PZA）和乙胺丁醇（EMB）組成的HREZ方案是目前初始抗結(jié)核治療的標準方案［2］。然而，INH的體內(nèi)代謝卻有著明顯的個體差異，快代謝型的患者會由于體內(nèi)INH不能長時間維持在較高濃度而無法達到預(yù)期的治療效果。乙酰異煙肼（AcINH）是INH最主要的代謝產(chǎn)物，也是肝毒性最大的物質(zhì)。它是INH在肝臟內(nèi)經(jīng)乙?；傻?，該過程分為快乙?；吐阴；Ｒ阴；愋偷牟煌坏珪?dǎo)致治療效果出現(xiàn)差異，而且對肝臟的毒副作用也有明顯區(qū)別。目前的研究普遍認為，慢乙酰化代謝者更容易發(fā)生藥物性肝損害［3］。因此，如何盡可能提高療效且不發(fā)生藥物性肝損害就成為結(jié)核病治療中的關(guān)鍵所在。我們?nèi)舳ㄆ诒O(jiān)測患者服藥后血漿中AcINH的質(zhì)量濃度，就可判斷患者是屬于快代謝型還是慢代謝型［4］。然后再將INH和AcINH的血藥質(zhì)量濃度相結(jié)合來調(diào)整INH的給藥劑量，就可以提高療效并降低藥物性肝損害的發(fā)生率。此外，肺結(jié)核的治療通常為聯(lián)合治療，藥物聯(lián)用也會對INH的血藥質(zhì)量濃度產(chǎn)生影響。因此，對結(jié)核患者進行血質(zhì)量低濃度監(jiān)測是有必要的。

目前，雖然有很多種高效液相色譜（HPLC）的方法來對抗結(jié)核藥物進行含量分析［5－7］，但這些方法都不能用來分析成分極為復(fù)雜的血漿中的藥物質(zhì)量濃度。本文用HPLC建立了同時檢測INH和AcINH血藥質(zhì)量濃度的方法。由于老年患者對藥物代謝能力的差異更大，所以本研究在建立方法學的基礎(chǔ)上初步考察了INH在老年結(jié)核病患者體內(nèi)的藥代動力學特征。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 LC－20AB高效液相色譜儀（島津，日本）；渦旋儀（WH－2，上海滬西分析儀器廠有限公司）；電子分析天平（EB224，上海舜宇恒平科學儀器有限公司）；高速離心機（TG1650－WS，上海盧湘儀）；微量移液器（Eppendorf，德國）。

1.2 試藥 異煙肼對照品（批號：100578－200401，中國藥品生物制品檢定所）；乙酰異煙肼對照品（批號：3－JES－102－4，Toronto Research Chemicals Inc.）；茶堿對照品（批號：100121－199903，中國藥品生物制品檢定所）；甲醇（Merck公司，德國），為色譜純；磷酸二氫鉀、三乙胺（中國國藥集團）均為分析純。水為雙蒸水（用Millipore儀器自制，美國）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Inertsil ODS－SP（150mm× 4.6mm，5μm）；流動相：甲醇（A）﹕0.05mol·L－1磷酸二氫鉀（B）（三乙胺調(diào)pH 5.6）（梯度為1～10 min：A∶B為4∶98，10～11min梯度變?yōu)锳∶B為80∶20，11min：A∶B為80∶20，淋洗時間共20min）；柱溫：40℃；流速：1mL·min－1；進樣體積：20μL；檢測波長：261nm。

2.2 血漿樣品處理 取血漿樣品300μL，置于2 mL離心管中，精密加入2.4μg·mL－1茶堿甲醇溶液10μL作為內(nèi)標物質(zhì)，渦旋混勻1min，加700μL甲醇，旋渦混勻5min，以16 000r·min－1離心15min，取少量上清液經(jīng)0.45μm濾膜過濾后進樣分析。

2.3 方法專屬性 按照本實驗進行檢測，INH和AcINH的分離度＞1.5，對測定不產(chǎn)生干擾，血漿中存在的雜質(zhì)峰對檢測不產(chǎn)生影響。色譜圖見圖1。

圖1 HPLC圖A.空白血漿；B.空白血漿＋AcINH＋INH；C.患者血漿；1.AcINH；2.INH；3.茶堿Fig.1 HPLC chromatogramsA.blank plasma；B.plasma＋AcINH＋INH；C.patient plasma sample；1.AcINH；2.INH；3.theophylline

2.4 線性關(guān)系 在10mL的量瓶中放入對照品，用甲醇溶解并稀釋至刻度。配成質(zhì)量濃度為1 000 μg·mL－1的INH和AcINH標準儲備液。取2mL離心管，每只加入不同量的INH和AcINH標準儲備液及300μL·mL－1的空白血漿，使其中的藥物質(zhì)量濃度分別為0.15，0.3，0.6，1.2，2.4，4.8，9.6，19.2和38.4μg·mL－1。其后按2.2項下操作，記錄色譜圖，以質(zhì)量濃度（C）為橫坐標、樣品與內(nèi)標峰面積比值（Y）為縱坐標作線性回歸。INH的線性方程：Y＝0.412 2C＋0.054 1（r2＝0.992 4），INH在0.15～38.4μg·mL－1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。AcINH的線性方程：Y＝0.170 8C＋0.053（r2＝0.992 1），AcINH在0.15～38.4μg·mL－1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 精密度和準確度 在空白血漿300μL中加入一定量的標準儲備液，精確配制成含低、中、高3種質(zhì)量濃度（0.5，5和25μg·mL－1）的INH和AcINH血漿樣品，按2.2項下操作，測定日內(nèi)（5次）和日間（5d）精密度，RSD均小于10%。見表1。

表1 日間、日內(nèi)精密度Tab.1 The precision of intra－day and inter－day

2.6 穩(wěn)定性 在空白血漿300μL中加入一定量的標準儲備液，精確配制成含低、中、高3種質(zhì)量濃度（0.5，5和25μg·mL－1）的INH和AcINH血漿樣品。于室溫下分別放置0，2，4，8和12h后，按2.2項下操作，測定峰面積和內(nèi)標峰面積的比值。由結(jié)果可知，12h內(nèi)樣品基本保持穩(wěn)定。見表2。

表2 穩(wěn)定性實驗結(jié)果Tab.2 Results of stability test

2.7 回收率實驗 在空白血漿300μL中加入一定量的標準儲備液，精確配制成含低、中、高3種質(zhì)量濃度（0.5，5和25μg·mL－1）的INH和AcINH血漿樣品。于室溫下分別放置0，2，4，8和12h后，按2.2項下操作，每個質(zhì)量濃度平行測5次，計算平均回收率和RSD。見表3。

表3 回收率測定結(jié)果Tab.3 Results of recovery rate

3 INH藥代動力學研究

3.1 患者選擇 10名老年患者，年齡≥65歲；明確診斷為肺結(jié)核；治療方法為標準HREZ（異煙肼＋利福平＋乙胺丁醇＋吡嗪酰胺）方案。INH服藥方法：0.3g，每日1次，早飯后0.5h頓服。

3.2 血藥質(zhì)量濃度檢測 服藥前及服藥后的0，0.33，0.66，1.00，2.00，3.00，4.00，6.00，8.00，12.00和24.00h經(jīng)前臂靜脈取血3～5mL，立即置于涂有肝素的離心管中，在避光處靜置10～20min，以5 000r·min－1離心處理10min，分離血漿，盡量在2h內(nèi)進行分析，若不能及時分析在－40℃冰箱內(nèi)保存。

3.3 藥代動力學研究結(jié)果 選取老年患者10名，男性6名，女性4名，年齡73.7±7.7歲，體質(zhì)量為64.2 ±13.5kg。這10名患者平均血藥質(zhì)量濃度－時間曲線見圖2。將測得的質(zhì)量濃度取平均值，使用DSA 3.1對質(zhì)量濃度－時間數(shù)據(jù)進行處理，主要藥代動力學參數(shù)見表4。

圖2 異煙肼在患者血漿中的藥物質(zhì)量濃度－時間曲線Fig.2 Concentration－time curve of INH in patient plasma

表4 藥代動力學參數(shù)Tab.4 The main pharmacokinetics of INH

4 討論

由于INH和AcINH屬于極性較強的物質(zhì)，其在色譜柱上保留時間比較短，并且容易受到外源性雜質(zhì)的影響。為了能夠得到較好的峰形和分離度，本實驗嘗試使用了苯基柱和氰基柱［8－10］。雖然它們可以延長在色譜柱上的保留時間，但峰形達不到分析的要求。經(jīng)過反復(fù)比較和實驗，我們認為在使用C18柱時，使用pH5.6的磷酸二氫鉀為緩沖對，并且在較高極性流動相的洗脫下可以得到很好地分離。

在樣品前處理方法中，實驗了液液萃取法，發(fā)現(xiàn)由于這3種組分的極性太大，用乙酸乙酯無法全部萃取出來，嚴重影響分析的準確性。又嘗試了將沉淀蛋白后的上清液吹干后再用流動相復(fù)溶，但這樣增加了操作步驟且給方法學的考察增加了難度，并且還需加入抗氧化劑，影響了多組分藥物的穩(wěn)定性。通過實驗和對比后，選擇使用甲醇沉淀蛋白后直接取上清液進樣，該方法可以在不影響可靠性的前提下最大程度地減少操作步驟，可以方便臨床及時進行檢測。

本實驗方法準確，操作簡單，成本低，靈敏度不低于使用LC－MS的方法，即使樣本中藥物的含量低也能準確測定。檢測時間符合要求，如果使用更長的250mmC18柱還可以延長保留時間，增加分離度。整個方法學的回收率高于80%，日間和日內(nèi)RSD小于10%，符合對生物樣品分析的要求。

有報道，INH在健康人群中的半衰期最大為3.5 h，但本研究發(fā)現(xiàn)老年患者的半衰期超過4h。表觀分布容積也大于文獻報道值［11－12］。這說明老年患者的INH藥代動力學特點與健康年輕人還是存在一定程度的差異。提示臨床設(shè)定治療方案時應(yīng)該特別注意不同人群的藥代動力學特征。老年患者由于免疫力較弱，容易感染結(jié)核，本實驗針對這一人群探討了藥物體內(nèi)處置規(guī)律，研究具有較高的臨床適用性，提供了較為可靠的藥物體內(nèi)藥代動力學參數(shù)，可以促進臨床合理用藥，減少不良反應(yīng)的發(fā)生。

［1］World Health Organization，10Facts about Tuberculosis，http：／／www.who.int／fearutes／factifiles／tuberculosis／en／（March 2009）.

［2］顏海斌，翁海涌.抗結(jié)核藥的用藥調(diào)查分析［J］.西北藥學雜志，2003，18（4）：88.

［3］傅麗紅，于愛平，范廣建.不同服藥方式對異煙肼血藥質(zhì)量濃度的影響［J］.西北藥學雜志，1998，13（6）：285.

［4］郎美琦，蔣利，黃佳盛.抗結(jié)核病藥物治療綜述［J］.臨床肺科雜志，2010，15（8）：1153－1154.

［5］E Calleri，D E Lorenzi，S Furlanetto，et al.Validationof an RP－LC method for the simultaneous determination of isoniazid，pyrazinamide and rifampicin in a pharmaceutical formulation［J］.Pharm Biomed Anal，2002，29（6）：1089－1096.

［6］M Y Khuhawar，F(xiàn) M A Rind.Liquid chromatographic determination of isoniazid，pyrazinamide and rifampicin from pharmaceutical preparations and blood［J］.Chromatogr B，2002，766（2）：357－363.

［7］Z F Zhou，L Y Chen，P Liu，et al.Simultaneous determination of isoniazid，pyrazinamide，rifampicin and acetylisoniazid in human plasma by high－perfomance liquid chromatography［J］.Anal Sci，2010，26（11）：1133－1138.

［8］Z Gong，Y Basir，D Chu，et al.A rapid and robust liquid chromatography／tandem mass spectrometry method for simultaneous analysis of anti－tuberculosis drugs—ethambutol and pyrazinamide in human plasma［J］.Chromatogr B，2009，877（16）：1698－1703.

［9］譚志榮，陳堯，郭棟，等.HPLC－MS／MS法測定人血漿中西洛他唑濃度［J］.中南藥學，2009，7（11）：827－830.

［10］劉艷文，張文淵，顏苗，等.UPLC－MS／MS法測定小鼠血漿及腦組織中馬錢子堿濃度［J］.中南藥學，2010，8（5）：321－325.

［11］曾德貴，劉玉琴.異煙肼人體血藥濃度測定及藥代動力學研究［J］.中國藥業(yè)，2011，20（3）：6－7.

［12］Dahl M L，Sjoqvist F.Pharmacogenetic methods as a complement to therapeutic monitoring of antidipressants and neuroleptics［J］.Ther Drug Monit，2000，22（1）：114.

Determination of isoniazid and acetylisoniazid in patient plasma by HPLC and study on pharmacokinetics of isoniazid in elder patients

ZHANG Liang1，LIN Feishen2，HOU Wenjie1，QIAN Zhilei1，Ding Hongzi1＊（1.Department of Pharmacy，Nanjing Chest Hospital，Nanjing 210029，China；2.Department of Tuberculosis，Nanjing Chest Hospital，Nanjing 210029，China）

Objective To determine the concentration of isoniazid（INH）and acetylisoniazid in patient plasma by HPLC and investigate INH′s pharmacokinetics in elder patients.Methods A single 0.3g dose of INH was given to 10tuberculosis patients with the age more than 65years old by oral administration route.Blood samples were preceded by protein precipitation and the plasma concentrations of INH were determined by an HPLC method，which was built in this study.Data were analyzed by the DAS3.1 software.Results The major pharmacokinetics parameters of INH were calculated by using non compartmental model.Conclusion The method described in this report was of high sensitivity and selectivity for accurate determination of the plasma concentration of INH in human.The results obtained from this study showed that the pharmacokinetics of INH in elder patients was significantly different from that in adult patients.

isoniazid；acetylisoniazid；pharmacokinetics；HPLC

10.3969／j.issn.1004－2407.2015.04.020

R945

A

1004－2407（2015）04－0390－04

2014－11－19）

南京市醫(yī)學科技發(fā)展重大項目（編號：ZHX13041）；南京市醫(yī)學科技發(fā)展項目（編號：YKK11064）；南京市胸科醫(yī)院青年人才培養(yǎng)計劃專項基金

張亮，男，碩士研究生

＊通信作者：丁紅梓，男，主管藥師