氟化鈉護齒涂劑的體外細胞毒性和家兔皮膚刺激性研究

黨 歡，王 濟，王鵬遠，王曉娟（第四軍醫(yī)大學口腔醫(yī)院藥劑科，軍事口腔醫(yī)學國家重點實驗室，西安 710032）

氟化鈉護齒涂劑的體外細胞毒性和家兔皮膚刺激性研究

黨 歡，王 濟，王鵬遠，王曉娟＊（第四軍醫(yī)大學口腔醫(yī)院藥劑科，軍事口腔醫(yī)學國家重點實驗室，西安 710032）

目的 氟化鈉護齒涂劑是用于口腔齲齒預防的制劑，本文對其體外細胞毒和對家兔皮膚的刺激性進行了評價。方法 遵照GB／T 16886.5－2003《醫(yī)療器械生物學評價第5部分：體外細胞毒性實驗》中華人民共和國國家標準的實驗原則，采用濾膜擴散法進行氟化鈉護齒涂劑的體外細胞毒性評價；遵照GB／T 16886.10－2005《醫(yī)療器械生物學評價第10部分：刺激與遲發(fā)型超敏反應實驗》，采用家兔對氟化鈉護齒涂劑進行皮膚刺激性評價。結果 體外細胞毒性實驗結果顯示，氟化鈉護齒涂劑細胞毒性為1級，具有輕度細胞毒性；對家兔皮膚無明顯刺激。結論 氟化鈉護齒涂劑具有相對較低的毒性，可用于口腔齲齒的預防。

氟化鈉護齒涂劑；濾膜擴散實驗；細胞毒性；刺激性

齲齒是一種嚴重影響人類口腔健康的常見病和多發(fā)病，尤其是少年兒童的齲病發(fā)生率正在逐年上升。在國內由于經濟條件不佳及意識缺乏等原因，大部分齲齒得不到有效地治療，而在西方國家近年來齲齒的發(fā)病率已有了大幅下降。氟化物的應用被認為是多數(shù)發(fā)達國家和地區(qū)齲病明顯降低的重要原因［1］。在世界衛(wèi)生組織和口腔界權威機構的推薦下，目前已有多種氟化物防齲技術在世界范圍內被廣泛應用，并取得了巨大的社會效益和經濟效益［2］。氟保護劑是局部用氟防齲的方法之一，具有濃度低、操作簡便、使用安全、高效、病人易于接受等優(yōu)點，在國內外得到越來越多地關注和應用［2－3］。

氟化鈉護齒涂劑的有效成分氟化鈉是一種用于齲齒前的材料，當把本品涂抹在牙齒上時，能夠在牙齒表面形成一層薄膜，進而形成一個持久的氟化鈣保護層，使附著在牙釉質上的氟化鈉小球在幾個月內持續(xù)分解釋放氟且滲透至牙齒深部，為牙齒提供長期抵抗齲齒的保護。此外，氟化鈉能抑制某些口腔致病菌包括對變形鏈球菌葡萄糖的攝取、轉化和利用，從而影響胞外多糖的合成、胞內多糖的貯存，干擾細菌和菌斑在牙面上的堆積和黏附［4］。

本實驗擬通過體外細胞毒性實驗檢測氟化鈉護齒涂劑間接接觸哺乳類細胞后其生物學反應，通過動物實驗觀察動物長時間外敷氟化鈉護齒涂劑后，是否有局部不良反應的發(fā)生，以期為臨床廣泛應用提供借鑒和指導。

1 儀器與材料

1.1 儀器 超凈工作臺（蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司）；二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱（Thermo Electron公司）；數(shù)顯恒溫水浴鍋（國華電器有限公司）；倒置光學顯微鏡（美國Nikon公司）；直徑約45mm孔徑0.45μm的醋酸纖維素濾膜（天津市津騰實驗設備有限公司）；直徑60mm的組織培養(yǎng)皿（上?？婆d商貿有限公司）。

1.2 試藥 氟化鈉護齒涂劑，注冊證號：陜食藥監(jiān)械（準）字2009第2630139；DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國HyClone公司；胰蛋白酶和青鏈霉素混合液購自北京Solarbio公司；營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基購自青島高科園海博生物技術有限公司；琥珀酸脫氫酶染色液購自南京森貝伽生物科技有限公司。

1.3 細胞系 小鼠成纖維細胞L929購自第四軍醫(yī)大學組織工程中心。

2 實驗方法

2.1 濾膜擴散法測氟化鈉護齒涂劑體外細胞毒性濾膜擴散法測細胞毒性實驗是通過體外培養(yǎng)小鼠成纖維細胞ATCC CCL（NCTC clone 929），用于細胞毒性定性評價的一種方法，具有準確、靈敏的特點。本實驗是將護齒涂劑通過醋酸纖維素濾膜與特定的細胞系接觸，檢測其非特異性細胞毒性，評價其對細胞的毒性作用程度。

2.2 培養(yǎng)基、樣品及對照材料的制備 瓊脂培養(yǎng)基的配制：將已滅菌的瓊脂在水浴中加熱至100℃，冷卻至48℃。將一份瓊脂與一份新配制的預熱至48℃的2×生長培養(yǎng)基（含有2×抗生素和體積分數(shù)20%小牛血清）混合，使瓊脂培養(yǎng)基的最終濃度為1 ×生長培養(yǎng)基。

浸提液制備：浸提介質含體積分數(shù)10%血清的細胞培養(yǎng)液。浸提比例：每0.1g樣品加1mL浸提介質。浸提條件：37℃，24h。實驗樣品：吸取0.1 mL浸提液，置于直徑約5mm的醫(yī)用明膠海綿載體上。陰性對照：選用直徑約5mm、厚約1mm的高密度聚乙烯圓片，樣本表面光滑；陽性對照：選用直徑約5 mm、體積分數(shù)20%的苯酚溶液浸濕的濾紙片，樣本表面光滑；空白對照：含單層細胞但無實驗材料的濾膜。

2.3 實驗步驟

①細胞生長至對數(shù)期末，用培養(yǎng)基配成2.5× 105／mL懸液。

②培養(yǎng)皿底部放置滅菌的醋酸纖維素膜（孔徑0.45μm，無表面活性劑），吸取混合均勻的細胞懸液6mL，水平轉動培養(yǎng)皿使細胞均勻分散。另一皿加不含細胞的培養(yǎng)液6mL作空白對照。置于37±2℃、體積分數(shù)5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。

③吸取保存在48℃新制備的瓊脂培養(yǎng)基5mL于足夠數(shù)量新的空培養(yǎng)皿，并在室溫使其凝固。

④從經過24h培養(yǎng)含醋酸纖維素濾膜的平皿中吸除多余的培養(yǎng)液，用37±2℃的磷酸鹽緩沖液清洗濾膜。取出濾膜，放于瓊脂培養(yǎng)基表面，細胞面朝下。

⑤在每一平皿的濾膜上放4個試樣（其中試樣組放置3個樣品及1個陰性對照），置于37±2℃、體積分數(shù)5%的CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育24h（應保證試樣與濾膜表面緊密接觸）。培養(yǎng)24h后評價細胞毒性。

⑥ 孵育后，去除試樣，輕輕將濾膜與瓊脂分開，取出濾膜。

⑦用琥珀酸脫氫酶染色液浸泡濾膜，37℃下培養(yǎng)3h。

⑧用100ml·L－1中性甲醛溶液浸泡15min，以固定細胞。用蒸餾水沖洗濾膜，空氣中干燥。

2.4 濾膜擴散法細胞毒性評價 結果見表1。

表1 濾膜擴散法實驗結果與細胞毒性分級的關系Tab.1 Relation about filter membrane diffusion result and cell cytotoxicity grade

2.5 家兔皮膚刺激性實驗 本實驗采用家兔皮膚局部給藥，觀察受試皮膚長時間接觸氟化鈉護齒涂劑所產生的不良反應。該動物實驗通過第四軍醫(yī)大學動物倫理委員會認證審核通過。

2.5.1 實驗動物 新西蘭大白兔3只，由第四軍醫(yī)大學實驗動物中心提供，雄性，體質量控制在2.5～3.0kg，一級動物，許可證號為SCXK－（軍）2012－0007。實驗前將3只實驗用兔置于實驗動物房環(huán)境中喂養(yǎng)3d以適應環(huán)境，給予同質同量飲水。

2.5.2 給藥方法 進行實驗前1d，分別將3只實驗兔背部脊柱兩側去毛、備皮，面積均為5cm×15cm。取氟化鈉護齒涂劑約5g，以雞蛋清適量調勻，均勻涂抹在每只兔脊柱一側前部的皮膚上，后部涂雞蛋清作為對照。在每只兔脊柱的另一側前部的皮膚上涂雞蛋清作為對照，后部涂以雞蛋清調勻的氟化鈉護齒涂劑。每天涂抹1次，保持4h，連續(xù)涂抹14d。從第2天開始，每次涂藥前均先剪毛，對照區(qū)和實驗區(qū)同樣處理。

2.5.3 家兔皮膚刺激性實驗結果評價 受試動物涂藥后4h，以溫熱9g·L－1氯化鈉溶液清洗對照區(qū)和實驗區(qū)，靜置實驗兔1h，肉眼觀察對照區(qū)和實驗區(qū)的皮膚改變。根據(jù)表2皮膚刺激反應評分，計算各只動物每天的最高積分。

表2 皮膚刺激反應評分Tab.2 Skin irritation scores

按以下公式計算各只動物每天平均積分，按表3判定皮膚刺激強度。

表3 皮膚刺激強度分級Tab.3 Skin irritation intensity grade

2.5.4 統(tǒng)計學方法 收集實驗數(shù)據(jù)后，均以建立數(shù)據(jù)庫形式，錄入統(tǒng)計軟件SPSS 16.0，計量資料采用Student－t檢驗。假設檢驗水準α＝0.05。

3 實驗結果

3.1 體外細胞毒性實驗 陽性對照組細胞毒性反應為3級，重度細胞毒性；空白對照組細胞毒性反應為0級，無細胞毒性；陰性對照組細胞毒性反應為0級，無細胞毒性；陽性對照組、空白對照組和陰性對照組的反應符合規(guī)定，本實驗成立。實驗樣品組細胞毒性反應為1級，輕度細胞毒性。見圖1。

圖1 濾膜擴散法測氟化鈉護齒涂劑細胞毒性琥珀酸脫氫酶染色前后A.陽性對照；B.空白對照；C.陰性對照；D.樣品Fig.1 The cytotoxicity of Sodium Fluoride Varnishes tested by a filter membrane diffusion assay before and after succinate dehydrogenase dyedA.positive control；B.blank control；C.negative control；D.sample

3.2 家兔皮膚刺激性實驗 結果見表4。實驗結果表明，氟化鈉護齒涂劑涂敷于家兔背部4h／次，連續(xù)2周，無1只出現(xiàn)水腫。每只動物實驗區(qū)總積分為0.429±0.242，每只動物每天積分為0.031±0.017，而對照區(qū)分別為0.333±0.346和0.024±0.025，兩者比較差異均無統(tǒng)計學意義，說明氟化鈉護齒涂劑局部較長時間涂敷對實驗動物皮膚無明顯刺激。

表4 氟化鈉護齒涂劑對家兔皮膚長時間刺激性實驗評分Tab.4 Rabbits skin irritation test scores of Sodium Fluoride Varnishes

4 討論

齲齒是在以細菌為主的多因素影響下，牙齒硬組織發(fā)生慢性進行性破壞的一種疾病。兒童齲齒是常見的兒童口腔疾病，病變主要以牙齒脫礦為主。菌斑中未解離的乙酸與乳酸形成H＋的儲備庫，H＋可使Ca2＋自晶格內移走，導致牙齒硬組織脫礦［5］。

氟保護劑是濃度較低的含氟涂劑之一，適合各年齡段的齲齒預防，是世界衛(wèi)生組織（WHO）推薦的兒童群體防齲的適宜技術之一［6］。它不僅能夠減少牙釉質脫礦［7］，增加牙釉質的再礦化［8］，牙釉質表面高濃度的氟也可導致氟化鈣的沉積，增加牙釉質的表面硬度，提高牙齒的抗腐蝕能力［9］；同時沉積的氟化鈣可以在牙釉質－菌斑界面緩慢溶解并持續(xù)釋放氟離子，還能夠有效地抑制口腔唾液變形鏈球菌的生長和代謝，抑制并減少牙菌斑的形成［10］。

氟保護劑具有較高的安全性。Murray J J等［11］通過動物實驗證明了氟保護劑安全可靠、不良反應少。本實驗通過體外細胞毒性實驗和家兔的皮膚刺激實驗［12－15］也證明了其較高的安全性。本實驗采用醫(yī)療器械生物學評價國家標準中推薦的間接細胞毒性測定法即濾膜擴散法［16］來進行氟化鈉護齒涂劑的體外細胞毒性評價，操作簡便，穩(wěn)定可靠。

目前，我國關于氟保護劑方面的研究報告仍然較少，臨床使用范圍局限，濃度單一，不具有代表性，并且都是由專業(yè)人員負責完成涂氟工作。期待隨著科學研究及臨床研究的深入，氟保護劑能深入到社區(qū)和學校等范圍內進行大規(guī)模的推廣使用，從而有效降低我國少年兒童齲病的發(fā)生率。

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In vitro cytotoxicity and rabbit skin irritation of Sodium Fluoride Varnishes

DANG Huan，WANG Ji，WANG Pengyuan，WANG Xiaojuan＊（State Key Laboratory of Military Stomatology，Department of Pharmacy，Stomatology Hospital，the Fourth Military Medical University，Xi′an 710032，China）

Objective Sodium Fluoride Varnish was used for caries prevention.Its cytotoxicity in vitro and rabbit skin irritation were evaluated in this study.Methods According to the experimental principle of national biological appraising standard on medical apparatus，the in vitro cytotoxicity was tested by a filter membrane diffusion method and the safety of Sodium Fluoride Varnish was evaluated by rabbit skin irritation test.Results Sodium Fluoride varnish had mild cell toxicity and no obvious skin irritation was observed on rabbits.Conclusion Sodium Fluoride Varnish had a relatively low toxicity and was appropriate for caries prevention.

Sodium Fluoride Varnishes；filter membrane diffusion test；in vitro cytotoxicity；irritation

10.3969／j.issn.1004－2407.2015.04.019

R965

A

1004－2407（2015）04－0386－04

2015－03－10）

黨歡，女，碩士研究生

＊通信作者：王曉娟，女，主任藥師，教授，碩士生導師