GC法同時(shí)測定聚山梨酯80中5種揮發(fā)性雜質(zhì)

李 莉，王佳宇，高山山，侯文珍，馬長華（北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100102）

·藥物分析·

GC法同時(shí)測定聚山梨酯80中5種揮發(fā)性雜質(zhì)

李 莉，王佳宇，高山山，侯文珍，馬長華＊（北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100102）

目的 建立氣相色譜法對聚山梨酯80中的環(huán)氧乙烷、二氧六環(huán)、氯乙醇、乙二醇和二甘醇5種揮發(fā)性雜質(zhì)進(jìn)行同時(shí)檢測。方法 采用氣相色譜法，色譜柱固定相為PEG20000（GsBP－INOWAX，30m×0.53mm×1.0μm彈性石英毛細(xì)管柱）。采用程序升溫，初溫50℃，以5℃·min－1升溫至200℃，保持10min，再以50℃·min－1升溫至230℃，保持20min。進(jìn)樣口溫度為200℃，檢測器溫度為250℃。結(jié)果 同時(shí)測定了聚山梨酯80中環(huán)氧乙烷、二氧六環(huán)、氯乙醇、乙二醇和二甘醇5種揮發(fā)性雜質(zhì)，線性范圍分別為2.7～176.8μg·mL－1（r＝0.999 8），2.8～140.7μg·mL－1（r＝0.999 8），3.4～167.5μg·mL－1（r＝0.999 9），4.7～2 345μg·mL－1（r＝0.999 8）和3.2～160.8μg·mL－1（r＝0.999 9）；平均加樣回收率分別為104.3%，91.3%，105.2%，94.1%和105.7%，RSD分別為2.5%，2.8%，1.4%，3.0%和3.7%。結(jié)論 該方法靈敏、準(zhǔn)確，可用于聚山梨酯80中揮發(fā)性雜質(zhì)的檢測。

聚山梨酯80；揮發(fā)性雜質(zhì)；氣相色譜法

聚山梨酯80（Tween－80，polysorbate 80）是一種非離子型表面活性劑，由于其結(jié)構(gòu)中具有較長的碳鏈結(jié)構(gòu)，對親脂性藥物有較好的助溶作用，因此該產(chǎn)品常被用作注射液及口服液的增溶劑或乳化劑［1－2］。但近年來臨床上含聚山梨酯80的注射劑多有不良反應(yīng)發(fā)生，如：因嚴(yán)重不良反應(yīng)被國家食品藥品監(jiān)督管理局暫停使用的魚腥草注射液，其中所含輔料聚山梨酯80就是引起不良反應(yīng)的重要原因之一［3］。據(jù)豚鼠、Beagle犬、食蟹猴、體外RBL－2H3細(xì)胞、人血清補(bǔ)體等大量實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，聚山梨酯80與動物不良反應(yīng)的出現(xiàn)存在明顯關(guān)系；聚山梨酯80是一種聚合物，穩(wěn)定性不佳，其含有的雜質(zhì)或降解產(chǎn)物可能是致敏的主要原因［4］，如環(huán)氧乙烷、二氧六環(huán)、氯乙醇、乙二醇、二甘醇等［5］，而該類物質(zhì)在相關(guān)藥理學(xué)研究中已被證明，對機(jī)體神經(jīng)、細(xì)胞等存在不良反應(yīng)［6－9］。因此，對聚山梨酯80中可能含有的該類潛在不良反應(yīng)因素的監(jiān)控，對于保證臨床用藥安全具有重要的意義。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，建立測定5種雜質(zhì)的氣相色譜方法簡便靈敏，結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性好。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 安捷倫氣相色譜儀，型號7890A（FID檢測器，安捷倫自動進(jìn)樣器型號7683B）；電子天平（上海越平科學(xué)儀器有限公司，型號JA2003）。

1.2 試藥 對照品：氯乙醇（Sigma公司進(jìn)口分裝，規(guī)格1mL）；乙二醇（上海源葉生物科技有限公司，規(guī)格5mL）；二氧六環(huán)（中國食品藥品檢定研究院，規(guī)格200mg）；二甘醇（中國食品藥品檢定研究院，規(guī)格100mg）；環(huán)氧乙烷（中國食品藥品檢定研究院，規(guī)格5mL）。聚山梨酯80（批號205359C，日本NOF公司；批號20130701，南京國內(nèi)某公司注射級別；批號ZY130911，上海國內(nèi)某公司藥用級別；批號20130101，20130401，20101201，國內(nèi)某公司）。無水乙醇（色譜級別，F(xiàn)isher公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備 精密吸取環(huán)氧乙烷、氯乙醇、乙二醇、二氧六環(huán)、二甘醇對照品，分別加無水乙醇配制成每1mL含氯乙醇50μg、二醇800μg、二氧六環(huán)50μg、二甘醇50μg和環(huán)氧乙烷44.2μg的對照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備 精密稱取聚山梨酯80 4 g，置于10mL量瓶中，加無水乙醇定容，搖勻，配制成每1mL含400mg聚山梨酯80的供試溶液。

2.3 色譜條件 色譜柱固定相為PEG20000（GsBPINOWAX，30m×0.53mm×1.0μm彈性石英毛細(xì)管柱）。采用程序升溫，初溫50℃，以5℃·min－1升溫至200℃，保持10min，再以50℃·min－1升溫至240℃，保持20min。進(jìn)樣口溫度為200℃，檢測器溫度為250℃，分流比為10∶1，進(jìn)樣量1μL，柱壓力恒定方式，載氣為氮?dú)猓?9.999%），柱流速3mL·min－1。色譜圖見圖1。

圖1 氣相色譜圖A.空白溶液；B.樣品；C.對照品；1.環(huán)氧乙烷；2.二氧六環(huán)；3.氯乙醇；4.乙二醇；5.二甘醇Fig.1 GC chromatogramsA.blank；B.sample；C.reference；1.ethylene oxide；2.dioxane；3.ethylene chlorohydrin；4.ethylene glycol；5.diethylene glycol

2.4 線性范圍 分別取環(huán)氧乙烷、氯乙醇、乙二醇、二甘醇、二氧六環(huán)對照品適量，加無水乙醇依次稀釋成下列標(biāo)準(zhǔn)溶液：環(huán)氧乙烷2.7，5.7，11.1，23.0，44.2，88.4和176.8μg·mL－1；氯乙醇3.4，6.7，14.1，30.2，55.3和167.5μg·mL－1；乙二醇4.7，46.9，93.8，197，422，774和2 345μg·mL－1；二甘醇3.2，6.4，13.5，28.9，53.1和160.8μg·mL－1；二氧六環(huán)2.8，5.6，11.8，25.3，46.4和140.7μg·mL－1。取1μL進(jìn)樣分析，以各對照品峰面積積分值Y對進(jìn)樣質(zhì)量濃度X進(jìn)行線性回歸，計(jì)算，結(jié)果見表1。結(jié)果表明，環(huán)氧乙烷質(zhì)量濃度在2.7～176.8μg·mL－1范圍內(nèi)，氯乙醇質(zhì)量濃度在3.4～167.5μg·mL－1范圍內(nèi)，乙二醇質(zhì)量濃度在4.7～2 345μg·mL－1范圍內(nèi)，二甘醇質(zhì)量濃度在3.2～160.8μg·mL－1的范圍內(nèi)，二氧六環(huán)質(zhì)量濃度在2.8～140.7μg·mL－1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 回歸方程與線性范圍Tab.1 Linear range and regression equations of calibration curves

2.5 定量限和檢測限 取對照品儲備液，精密量取不同體積并逐步稀釋，按上述方法進(jìn)樣并測定，當(dāng)所測殘留溶劑的信噪比達(dá)到要求時(shí)，環(huán)氧乙烷、二氧六環(huán)、氯乙醇、乙二醇、二甘醇檢測限（S／N＝3）分別為0.9×10－4，1.1×10－4，1.2×10－4，0.9×10－4和1.1 ×10－4μg；定量限（S／N＝10）分別為2.7×10－4，2.8 ×10－4，3.4×10－4，2.5×10－4和2.8×10－4μg。

2.6 精密度 取同一對照品溶液，于同1d內(nèi)按色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算峰面積，考察精密度，環(huán)氧乙烷、二氧六環(huán)、氯乙醇、乙二醇和二甘醇的RSD分別為1.1%，1.7%，1.9%，1.0%和為0.7%，方法精密度良好。

2.7 加樣回收率 精密稱取環(huán)氧乙烷、二氧六環(huán)、氯乙醇、乙二醇、二甘醇適量，分別加無水乙醇依次稀釋成下列溶液：環(huán)氧乙烷0.10，0.17和0.23mg·mL－1；氯乙醇0.61，0.76和0.92mg·mL－1；乙二醇2.91，4.84和6.78 mg·mL－1；二甘醇0.23，0.38和0.53mg·mL－1；二氧六環(huán)0.61，0.76和0.92mg·mL－1。共制3份。稱取聚山梨酯80樣品2g，共9份，分3組，分別置于10mL量瓶中，每組分別精密加入上述氯乙醇、乙二醇、二甘醇混合溶液，無水乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密量取1μL進(jìn)樣分析，計(jì)算回收率。環(huán)氧乙烷、二氧六環(huán)、氯乙醇、乙二醇、二甘醇的平均回收率分別為105.7%，104.3%，91.3%，105.2%和94.1%；RSD分別為3.7%，2.5%，2.8%，1.4%和3.0%。詳見表2。

表2 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Results of addition recoveries test

2.8 重復(fù)性 分別稱取6份聚山梨酯80樣品，置于10mL量瓶中，用無水乙醇稀釋至刻度，搖勻。精密量取1μL進(jìn)樣分析，環(huán)氧乙烷、乙二醇、二甘醇的RSD分別為1.1%，1.4%和1.4%，重復(fù)性良好；二氧六環(huán)和氯乙醇在樣品中未檢測到。2.9 穩(wěn)定性 稱取4g聚山梨酯80樣品，置于10 mL量瓶中，用無水乙醇稀釋至刻度，搖勻。分別在0，2，4，6，8，12和24h精密取1μL，進(jìn)樣分析。環(huán)氧乙烷、乙二醇和二甘醇的RSD分別為2.8%，3.5%和3.9%；二氧六環(huán)和氯乙醇在樣品中未檢測到。

2.10 樣品測定 按照2.2項(xiàng)下配制樣品供試液，每個(gè)樣品3份分別測定，最終含量取平均值。結(jié)果見表3。

表3 聚山梨酯80樣品中5種揮發(fā)性雜質(zhì)含量測定結(jié)果Tab.3 Results of determination of five volatile impurities in polysorbate 80

3 討論

《中國藥典》（2010年版）中規(guī)定，聚山梨酯80中環(huán)氧乙烷和二氧六環(huán)的限量應(yīng)分別為小于1ppm和10ppm［10］。根據(jù)樣品的測定數(shù)據(jù)，表明樣品中均未檢測到二氧六環(huán)和氯乙醇；僅有1批樣品測出含有環(huán)氧乙烷，但含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出藥典規(guī)定的70倍。另外，所有樣品中均檢測到乙二醇和二甘醇。

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，市場上不同廠家生產(chǎn)的藥用級聚山梨酯80的質(zhì)量差異較大，并有待提高和改善?！吨袊幍洹罚?010年版）雖然對聚山梨酯80的相關(guān)規(guī)定進(jìn)行了完善，但尚未提出相關(guān)條例對乙二醇和二甘醇這2種可能引發(fā)不良反應(yīng)的副產(chǎn)物進(jìn)行控制，建議增添相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)對乙二醇和二甘醇的限量進(jìn)行控制。本研究所建立的方法檢測限低，精密度及重復(fù)性好，能有效地同時(shí)對樣品中5種揮發(fā)性雜質(zhì)的殘留量進(jìn)行檢測。

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Determination of five volatile impurities in polysorbate 80 by GC

LI Li，WANG Jiayu，GAO Shanshan，HOU Wenzhen，MA Changhua＊（School of Medicine，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100102，China）

Objective To establish a method for the determination of five volatile impurities in polysorbate 80.Method The determination was performed on a GsBP－INOWAX column with PEG20000（30m×0.53mm×1.0μm）as solid phase.The column temperatures was 50℃at beginning，and programmed to 200℃at a rate of 5℃·min－1，maintained for 10min；then programmed to 230℃at a rate of 50℃·min－1and held for 20min.The temperatures of the injector and detector were set at 200and 250℃，respectively.Result Five volatile impurities in polysorbate 80were determined simultaneously by gas chromatography.The calibration curves were linear in the ranges of 2.7－176.8μg·mL－1（r＝0.999 8），2.8－140.7μg·mL－1（r＝0.999 8），3.4－167.5μg·mL－1（r＝0.999 9），4.7－2 345μg·mL－1（r＝0.999 8），and 3.2－160.8μg·mL－1（r＝0.999 9）for ethylene oxide，dioxane，ethylene chlorohydrin，ethylene glycol and diethylene glycol，respectively.The average recoveries were 104.3%，91.3%，105.2%，94.1% and 105.7%，RSD were 2.5%，2.8%，1.4%，3.0%and 3.7%，respectively.Conclusion The method were proved to be accurate and sensitive，and can be used for the detection of the volatile impurities in polysorbate 80.

polysorbate 80；volatile impurities；gas chromatography

10.3969／j.issn.1004－2407.2015.04.011

R927.2

A

1004－2407（2015）04－0364－04

2015－03－09）

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（編號：81274070）

李莉，女，在讀碩士研究生

＊通信作者：馬長華，男，教授，碩士生導(dǎo)師