高效液相色譜法同時(shí)檢測(cè)秸稈飼料中異丙草胺和異丙甲草胺的含量

■李軍德 趙艷芳 宋吉英

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)校醫(yī)院，山東青島266109；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)化學(xué)與藥學(xué)院，山東青島266109）

異丙草胺是一種氯代乙酰胺類化合物，它是一種新型的芽前除草劑，能與防治闊葉雜草的除草劑混用，同時(shí)也可擴(kuò)大防治雜草、降低用藥量，可代替乙草胺使用。異丙甲草胺和異丙草胺是同分異構(gòu)體，是細(xì)胞分裂抑制劑，可通過(guò)幼芽吸收，向上傳導(dǎo)，抑制蛋白質(zhì)合成干擾卵磷脂形成，從而抑制幼芽及其根的生長(zhǎng)，常用于防除水稻、玉米、大豆、花生等地的牛筋草、馬唐、狗尾草、棉草、莧菜、馬齒莧等。玉米、花生等農(nóng)作物的秸稈可直接或發(fā)酵后作為飼料原料用于牛、馬、騾、羊等畜禽的喂養(yǎng)。通常對(duì)于許多農(nóng)藥來(lái)說(shuō)，在環(huán)境中的降解是消除其污染的重要途徑之一，是確定其在環(huán)境中歸宿的一個(gè)重要依據(jù)。除草劑在農(nóng)作物秸稈中的殘留，會(huì)影響其作為飼料原料的質(zhì)量。目前國(guó)際上對(duì)于異丙草胺和異丙甲草胺常用的檢測(cè)方法主要為氣相色譜法和液相色譜法。本文的創(chuàng)新點(diǎn)是用高效液相色譜法同時(shí)檢測(cè)農(nóng)作物秸稈中異丙草胺和異丙甲草胺的含量，對(duì)農(nóng)作物秸稈作為飼料原料起到一定的參考作用。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

試劑：異丙草胺和異丙甲草胺標(biāo)準(zhǔn)品（Sigma）；甲醇、乙腈（色譜純）。

儀器：Agilent-1100型高效液相色譜儀；Eclipse Plus C-18（5 μm，4.6 mm×250 mm）色譜柱（安捷倫科技公司）；TU-1901型雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；KQ-700DV型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；LXJ-802醫(yī)用低速離心機(jī)（金壇市恒豐儀器廠）；Cascada超純水系統(tǒng)（Pall Corporation）；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；98-1磁力攪拌器（上海司樂(lè)儀器有限公司）；玻璃儀器超聲清洗1 h，用超純水洗凈后烘干備用。

1.2 色譜條件

流動(dòng)相：乙腈-水=70∶30(體積比);流速0.8 ml/min;柱溫：25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：220 nm；進(jìn)樣量：20 μl。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

用乙腈做溶劑，分別配制一定濃度的異丙草胺和異丙甲草胺的標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，做標(biāo)準(zhǔn)工作曲線時(shí)可將儲(chǔ)備液逐級(jí)稀釋使用。

1.4 樣品的前處理方法

將玉米、花生等農(nóng)作物秸稈晾干，切段，粉碎，用分析天平稱取2.0 g于250 ml磨口錐形瓶中，加入100 ml乙腈，封口后磁力攪拌提取30 min，將混合物轉(zhuǎn)移到離心管中，以4 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心，上清液在圓底燒瓶中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，加入2 ml流動(dòng)相溶解，用一次性有機(jī)濾頭過(guò)濾，得樣品溶液，在1.2節(jié)的色譜條件下待測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

實(shí)驗(yàn)中將異丙草胺和異丙甲草胺的標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋至適量濃度后，在紫外分光光度計(jì)上進(jìn)行紫外掃描，所得譜圖如圖1和圖2所示。由譜圖可知，異丙草胺和異丙甲草胺的最大吸收波長(zhǎng)均為220 nm，故選擇220 nm為最佳檢測(cè)波長(zhǎng)。

圖1 異丙草胺的紫外光譜

圖2 異丙甲草胺的紫外光譜

2.2 流動(dòng)相種類的選擇

高效液相色譜中流動(dòng)相的種類及配比對(duì)樣品峰及混合物的分離有著決定性的作用，兩個(gè)目標(biāo)峰之間的距離須足夠大及峰須足夠窄才能達(dá)到分離效果，當(dāng)儀器與色譜柱確定時(shí)，流動(dòng)相的種類及配比是影響兩種組分分離的決定性因素。實(shí)驗(yàn)中分別配制了甲醇-水和乙腈-水的流動(dòng)相，對(duì)異丙草胺標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行高效液相測(cè)定，得到譜圖3。

圖3 異丙草胺在不同流動(dòng)相下的色譜

從圖3可以看出，用甲醇-水做流動(dòng)相時(shí)，得到的色譜峰過(guò)寬，峰的對(duì)稱性差；而用乙腈-水做流動(dòng)相時(shí)峰形較好，因此，實(shí)驗(yàn)中選擇乙腈-水做流動(dòng)相。

2.3 流動(dòng)相配比的選擇

選擇流速分別為0.6、0.8、1.0 ml/min，在乙腈-水不同流動(dòng)相配比下測(cè)得異丙草胺和異丙甲草胺的色譜圖，根據(jù)色譜圖的相關(guān)信息，確定最佳流動(dòng)相配比。

由圖4和表1可知，隨著流動(dòng)相中乙腈含量的減少，保留時(shí)間延長(zhǎng)，在乙腈-水=60∶40時(shí)，保留時(shí)間最長(zhǎng)，峰寬最寬；在乙腈-水=70∶30時(shí)色譜峰形較好，峰寬較窄，異丙甲草胺和異丙草胺色譜峰的對(duì)稱因子分別為0.953和1.429，峰形較為理想，因此0.6 ml/min流速條件下選擇乙腈-水=70∶30作為流動(dòng)相。

圖4 流速為0.6 ml/min時(shí)異丙草胺和異丙甲草胺的不同流動(dòng)相配比色譜

表1 流速為0.6 ml/min時(shí)不同流動(dòng)相比例的色譜峰分析結(jié)果及系統(tǒng)評(píng)價(jià)

圖5 流速為0.8 ml/min時(shí)異丙草胺和異丙甲草胺的不同流動(dòng)相配比色譜

表2 流速為0.8 ml/min時(shí)不同流動(dòng)相比例的色譜峰分析結(jié)果及系統(tǒng)評(píng)價(jià)

由圖5和表2可知，隨著流動(dòng)相中乙腈含量的減少，保留時(shí)間增大，在乙腈-水=60∶40時(shí)，保留時(shí)間長(zhǎng)，峰寬較大；在乙腈-水=70∶30時(shí)得到的峰形較高，峰寬較小，峰的對(duì)稱性比較好，因此0.8 ml/min流速條件下選擇乙腈-水=70∶30作為流動(dòng)相。

圖6 流速為1.0 ml/min時(shí)異丙草胺和異丙甲草胺的不同流動(dòng)相配比色譜

表3 流速為1.0 ml/min時(shí)不同流動(dòng)相比例的色譜峰分析結(jié)果及系統(tǒng)評(píng)價(jià)

由圖6和表3可知隨著流動(dòng)相中乙腈含量的減少，保留時(shí)間增大，在乙腈-水=60∶40時(shí)，保留時(shí)間長(zhǎng)，峰寬較大；在乙腈-水=70∶30時(shí)得到的峰形較高，峰寬較小，峰的對(duì)稱性比較好，因此1.0 ml/min流速條件下選擇乙腈-水=70∶30作為流動(dòng)相。

綜合以上的分析結(jié)果，在不同的流速下，乙腈-水=70∶30時(shí)的分離效果最好，實(shí)驗(yàn)中確定最佳流動(dòng)相配比乙腈-水=70∶30。

2.4 流速的選擇

在高效液相色譜檢測(cè)中，流速對(duì)色譜峰的峰形，保留時(shí)間，對(duì)稱因子等因素有著決定性的作用。本實(shí)驗(yàn)在確定最佳流動(dòng)相配比乙腈-水=70∶30的前提下，對(duì)異丙草胺和異丙甲草胺混合標(biāo)準(zhǔn)溶液在不同流速下的色譜圖分析，以確定最佳流速，所得結(jié)果見(jiàn)圖7和表4。

由圖7和表4可知，隨著流速的增大，保留時(shí)間縮短，在流速為1.0 ml/min時(shí)，保留時(shí)間短，但是流速過(guò)快，柱壓較大，且色譜峰峰面積?。辉诹魉贋?.6 ml/min時(shí)，保留時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，峰太寬，對(duì)稱因子不好；在流速為0.8 ml/min時(shí)，保留時(shí)間適中，峰面積大，峰形較理想，因此實(shí)驗(yàn)流速確定為0.8 ml/min。

圖7 異丙草胺和異丙甲草胺在最佳流動(dòng)相配比下的不同流速色譜

表4 異丙草胺和異丙甲草胺在最佳流動(dòng)相配比下不同流速的色譜峰分析結(jié)果及系統(tǒng)評(píng)價(jià)

2.5 異丙草胺和異丙甲草胺保留時(shí)間的確定

本實(shí)驗(yàn)需要同時(shí)檢測(cè)異丙草胺和異丙甲草胺兩種目標(biāo)物，因此首先需確定出這兩種目標(biāo)物的保留時(shí)間以進(jìn)行定性分析。分別對(duì)異丙草胺和異丙甲草胺的標(biāo)準(zhǔn)溶液在1.2節(jié)的色譜條件下進(jìn)樣分析，以確定其保留時(shí)間；再在相同的色譜條件下分析異丙草胺和異丙甲草胺的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，根據(jù)二者的保留時(shí)間確定混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中的組分。所得結(jié)果見(jiàn)圖8，圖9和圖10。

圖8 異丙甲草胺標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜

圖9 異丙草胺標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜

圖10 異丙草胺和異丙甲草胺混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜

由結(jié)果可知，在1.2節(jié)色譜條件下，異丙甲草胺和異丙草胺的保留時(shí)間分別為8.301 min和10.383 min，二者的混合物可以得到很好的分離，且異丙甲草胺先于異丙草胺出峰。

表5 方法的性能數(shù)據(jù)

3 結(jié)論

本文的創(chuàng)新點(diǎn)是用高效液相色譜法同時(shí)檢測(cè)農(nóng)作物秸稈中異丙草胺和異丙甲草胺的含量，實(shí)驗(yàn)中對(duì)該方法的色譜條件進(jìn)行了探索，實(shí)驗(yàn)采用Agilent-1100高效液相色譜儀，Eclipse Plus C-18(5 μm，4.6 mm×250 mm)色譜柱，以乙腈-水=70∶30(體積比)為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm，柱溫為25℃，流速為0.8 ml/min的條件下確定了測(cè)定作物秸稈中異丙草胺和異丙甲草胺含量的方法。在該實(shí)驗(yàn)條件下異丙草胺和異丙甲草胺有較好的分離度，通過(guò)精密度實(shí)驗(yàn)和加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)等證明該方法穩(wěn)定可靠，可用于實(shí)際樣品的分析檢測(cè)。

（參考文獻(xiàn)12篇，刊略，需者可函索）