云南竹類植物磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(P E P C)含量比較*

唐國建，林樹燕，王曙光

(1．西南林業(yè)大學，云南 昆明650224;2．南京林業(yè)大學，江蘇 南京210037)

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 (PEPC)是光合作用C4途徑中的關鍵酶之一，廣泛分布于高等植物葉肉細胞的細胞質(zhì)中［1］。但PEPC并不是C4植物專屬酶，根據(jù)目前相關研究，無論C3植物還是C4植物均含有PEPC，不過類型不同［2］。近年來，也有人認為C3植物中可能存在著C4光合途徑。Duffus等［2］在研究C3植物大麥時發(fā)現(xiàn)其穎片中含有高于葉片中的PEPC含量，提出了C3植物中可能有C4途徑存在的假設;而后Nutbeam等［3］利用14C同位素示蹤技術證實了C3植物大麥中確實存在C4途徑;后來學者們陸續(xù)在其他C3植物中發(fā)現(xiàn)了C4途徑的存在［4～20］;通過同位素示蹤技術和LED技術，從酶學和四碳酸代謝兩方面研究證明，C3植物中確實存在C4途徑，而且同種植物中C4途徑的強弱在不同品系間以及不同器官中也有較大的差異［3～4，7～8，15］。李衛(wèi)華等［4］發(fā)現(xiàn)高等植物中碳同化的兩種類型 (C3途徑和C4途徑)是相互聯(lián)系的，且在一定條件下可以相互轉(zhuǎn)化，C3、C4植物的劃分也并非絕對。

PEPC既存在于C4植物中，也在許多C3植物中發(fā)現(xiàn)［4～16］。PEPC 在 C3植物中可能具有將呼吸作用產(chǎn)生的CO2重新固定，生成蘋果酸、天冬氨酸等有機酸，或者在三羧酸循環(huán)中回補草酰乙酸的功能等，但目前還無法得到確切的答案［4，8～9］。提高C3植物C4途徑同化CO2的強度將是以后研究熱點，然而，過去對PEPC的活性、結(jié)構(gòu)和功能進行了大量研究［1～22］，卻從未對植物體內(nèi)PEPC含量的差異進行研究。

本研究就竹類植物4屬8個竹種的成熟葉和云南箭竹在溫室內(nèi)、溫室外的衰老、成熟、幼嫩3個葉齡階段的葉片中PEPC含量的差異進行研究，測定了竹類植物種間PEPC含量的變化，分析竹種間PEPC含量的差異及原因，探討PEPC含量在竹子種屬分類中作為區(qū)分標準的可行性。

1 材料和方法

1.1 材料

本研究分別選取箭竹屬 (Fargesia)的云南箭竹 (F．yunnanensis)、棉花竹 (F．fungosa)和元江箭竹 (F．yuanjiangensis)，牡竹屬 (Dendrocalamus)的勃氏甜龍竹 (D．brandisii)和龍竹(D．giganteus)，箣竹屬 (Bambusa)的青皮竹(B．textilis)和佛肚竹 (B．ventricosa)以及剛竹屬(Phyllostachys)的 紫 竹 (P．nigra)和 毛 竹(P．heterocycla)，共4屬9個竹種作為試驗材料，所有材料均取自西南林業(yè)大學竹園內(nèi)。選取新鮮健康無蟲害、葉齡基本一致的葉片，洗凈去主脈，用濾紙吸干水分，用自封袋裝好，保存于4℃冰箱中，備用。

1.2 方法

1．2．1 PEPC 的提取

PEPC的提取參考《植物生理學實驗技術教程》［23］的方法，并略有改動。即稱取2～3 g葉片，用潔凈的剪刀剪碎，置于研缽中加入液氮進行研磨，最后按1︰3～1︰5(M/V)的比例加入pH 7．0的檸檬酸-磷酸緩沖液，研磨15 min，研磨充分后，盡量將勻漿液全部轉(zhuǎn)入15 mL離心管，5 000 rpm冷凍離心20 min，取上清液，即為粗酶液，將其分裝于1．5 mL離心管中，置于4℃冰箱中保存，備用。

1．2．2 PEPC 含量測定

按照植物磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 (PEPC)ELISA檢測試劑盒 (上海麗臣生物科技有限公司)的說明書，通過雷杜RT-6100酶標儀對PEPC含量的進行定量測定。即PEPC ELISA試劑盒室溫平衡20 min后，取出所需板條，設置標準孔、樣本孔和空白孔;標準孔中依次加入50 μL濃度為80 IU/L、40 IU/L、20 IU/L、10 IU/L、5 IU/L、2．5 IU/L 的標準品，空白孔什么都不加，樣本孔預先加樣本稀釋液40 μL，再加入待測樣品10 μL;隨后在標準孔和樣本孔中加入辣根過氧化物酶標記的抗體(抗原來源于擬南芥)100 μL，空白孔不加，用封板膜封住反應孔，37℃水浴60 min;去液體，在吸水紙上拍干液體，再加滿洗滌液，并靜置1 min，甩去洗滌液，再次拍干，如此重復5次;往所有孔中加入底物A、B各50 μL，37℃避光孵育15 min;最后往所有孔中加入反應終止液50 μL，15 min內(nèi)使用酶標儀在450 nm波長處測定各孔的OD值。

1．2．3 數(shù)據(jù)處理與分析

統(tǒng)計雷杜RT-6100酶標儀定量檢測的PEPC含量值，用SPSS 19．0軟件進行方差分析和多重比較。

表1 不同竹種的成熟葉片中PEPC含量Tab．1 The variation of PEPC contents from the mature leaves in different bamboo plants 1×10-3 IU/g·FW

2 結(jié)果與分析

2.1 溫室內(nèi)外云南箭竹成熟葉片中PEPC含量

溫室外的云南箭竹成熟葉片中PEPC含量顯著高于溫室內(nèi)的，說明環(huán)境因子對云南箭竹成熟葉片PEPC含量的影響較大，同時在溫室內(nèi)高溫、高濕的環(huán)境下，PEPC含量卻呈下降趨勢，因此，可以推測竹類植物應屬于C3植物，PEPC含量與植物碳同化途徑?jīng)]有相關性。

表2 云南箭竹葉片中PEPC含量Tab．2 The variation of PEPC contents from the leaves of F．yunnanensis 1×10-3 IU/g·FW

2.2 不同葉齡云南箭竹葉片中PEPC含量

云南箭竹成熟葉中PEPC的含量最高，其次為嫩葉，老葉中含量最少，且老葉與中葉和嫩葉的差異均顯著 (表2)。PEPC出現(xiàn)這種變化趨勢，與竹葉的發(fā)育階段有直接關系，中葉和嫩葉的代謝能力強于老葉，各種酶合成的能力高于老葉，也表明植物的不同發(fā)育階段對PEPC含量造成了顯著影響。

2.3 箭竹屬不同竹種間成熟葉片中PEPC含量

對箭竹屬不同竹種間成熟葉片中PEPC含量進行多重比較 (表1)，表明箭竹屬的3種竹種間PEPC含量差異均顯著，含量最高的為云南箭竹，其次為棉花竹，最低的為元江箭竹。

2.4 不同竹種間成熟葉片中PEPC含量

箭竹屬的元江箭竹 PEPC含量最低 (表1)，剛竹屬的紫竹PEPC含量最高。不同竹種間成熟葉片中的PEPC含量有些差異并不明顯，如同屬間的勃氏甜龍竹與龍竹，毛竹、棉花竹、青皮竹和佛肚竹4者間;有些差異明顯，如元江箭竹、云南箭竹及紫竹與另外8個竹種之間。特別是剛竹屬中的2個竹種間PEPC含量差異最為顯著，紫竹的PEPC含量竟是毛竹的2倍以上;箭竹屬的3個竹種、剛竹屬的2個竹種間成熟葉片中PEPC含量均存在顯著差異。而牡竹屬的2個竹種間、箣竹屬的2個竹種間的PEPC含量差異均不明顯。因此不同竹種間成熟葉片中的PEPC含量存在顯著差異。

2.5 不同屬間成熟葉片中PEPC含量

對不同屬的竹類植物間成熟葉片中PEPC的含量進行比較，發(fā)現(xiàn)箣竹屬的PEPC含量最低，剛竹屬的PEPC含量最高 (表1)。進行多重比較得出，剛竹屬竹子成熟葉片中PEPC含量，除與牡竹屬中的差異不顯著外，均與另外2個屬存在顯著差異;而牡竹屬竹種成熟葉片中的PEPC含量與其他3個屬間的差異均不顯著。剛竹屬中的毛竹、紫竹通常分布在低海拔、高緯度、涼性氣候的環(huán)境中，而箭竹屬竹種通常分布在低緯度、高海拔、涼性氣候環(huán)境之中，可能是海拔和緯度的不同對不同屬間的PEPC含量造成了遺傳上的差異。另外，箣竹屬和牡竹屬的竹子通常分布在低緯度、低海拔、暖性氣候的環(huán)境中，其成熟葉片中PEPC含量差異不明顯，可能是由于這2個屬的竹子在生境上分布是重疊的原因所造成的。

3 結(jié)論與討論

不同竹種間的PEPC含量差異較大，同種竹子不同葉齡之間和不同環(huán)境下，PEPC含量也存在著差異。

學者們對PEPC的活性和結(jié)構(gòu)進行了大量的研究［1，4，7～22］，而對 PEPC 含量的研究相對較少，施教耐等［17，19］和吳敏賢等［18，20～21］對植物 PEPC 進行了一系列的研究，得到了較高純度的酶制劑，并對其酶學性質(zhì)進行了大量的研究;査靜娟等［22］對高粱葉片中PEPC進行了分離純化，得到了具有4個相同亞基，分子量為380 kDa的蛋白質(zhì)，并認為不同植物的PEPC可能在結(jié)構(gòu)上存在著差異;郝乃斌等［7～8］認為植物PEPC的活性在同一物種不同品種間存在差異;魏愛麗等［14～15］對小麥不同綠色器官光合速率與碳同化酶活性及其基因型差異進行了研究，認為小麥不同器官中PEPC的活性在不同發(fā)育時期存在差異，非葉器官可能具有較強的C4光合機制;李衛(wèi)華等［4］總結(jié)前人的研究結(jié)果，認為不同物種間PEPC的活性存在差異，環(huán)境因素和不同發(fā)育階段也是PEPC的顯著影響因素。

所有試驗材料均取自西南林業(yè)大學竹園內(nèi)，避免了因生長地理環(huán)境因子的差異對PEPC含量的影響，同時，通過比較云南箭竹成熟葉片中PEPC含量在溫室內(nèi)與溫室外的變化情況，發(fā)現(xiàn)溫室內(nèi)的PEPC含量明顯低于溫室外的，進一步說明環(huán)境對PEPC含量的影響較大;然而溫室內(nèi)高溫、高濕的環(huán)境，并沒有促使PEPC含量的增加，反而出現(xiàn)下降的趨勢，因此，可以推測竹類植物因?qū)儆贑3植物，PEPC含量與植物碳同化途徑?jīng)]有相關性。另外，李衛(wèi)華等［5～6］對C3植物大豆不同發(fā)育時期葉片中C4循環(huán)途徑的相關酶進行了研究，發(fā)現(xiàn)PEPC在各個發(fā)育時期均存在，從苗期到初莢期，PEPC的活性呈逐漸升高的趨勢，且不同品種間的活性差異也較大。云南箭竹不同葉齡中的PEPC含量也隨著葉齡的增長，呈先上升后下降的趨勢，說明不同發(fā)育階段的葉片中PEPC含量差異顯著。

其次，箭竹屬3種竹子成熟葉片中的PEPC含量差異也較大，含量最高的為云南箭竹，其次為棉花竹，元江箭竹的PEPC含量最低，且3者間差異較為明顯。從竹子的地理種源來看，云南箭竹主要分布在四川西南部、云南北部，生長海拔在1 700～2 600 m［24］，其成熟葉片中PEPC含量最高;元江箭竹主要分布在云南南部的元江、石屏等地［24］，生長海拔在1 600 m左右的干熱河谷地帶，其PEPC含量最低，從南至北，從低海拔至高海拔，PEPC含量有上升的趨勢，緯度和海拔的變化對PEPC含量造成了顯著影響，暗示環(huán)境可能對不同竹種的遺傳基因造成影響，從而引起不同竹種PEPC含量的顯著差異。另外，在其他C3植物中(如小麥)，也有報道過，干旱脅迫對PEPC的活性造成顯著的影響［14］，其次，小麥的品種及不同器官均對 PEPC的活性造成了影響［14～16］。而有關PEPC含量在這方面的報道則相對較少，但同源性較高的PEPC基因在不同植物體內(nèi)表達也是有差異的，甚至同種植物的不同發(fā)育階段，PEPC的含量也差異較大［4～16］，在箭竹屬中，因自然分布環(huán)境的不同，對不同竹種成熟葉片中PEPC含量造成了顯著影響。

針對竹類植物，由于目前沒有一個明確的PEPC含量評定標準。盡管不同屬之間差異顯著，但同一屬之間不同竹種也差異特別顯著，而并不一致，例如箭竹屬中元江箭竹PEPC含量遠低于另外2個竹種，這種差異可能是由于元江箭竹自然分布于干熱河谷地帶而造成的遺傳差異。因此，PEPC含量受環(huán)境因子的影響巨大，也不能作為竹類植物，尤其不同屬、不同種之間系統(tǒng)分類的評定指標。竹類植物在高溫、高濕的溫室環(huán)境下，PEPC含量反而比溫室外的低，不同栽培環(huán)境和發(fā)育階段的同種竹子中PEPC含量也存在顯著差異，因此，推測竹類植物應屬于C3植物，PEPC含量的變化與光合作用碳同化的途徑之間沒有相關性。

［1］趙艷，陳麗梅，李坤志．磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的分子結(jié)構(gòu)研究進展［J］．生物技術通報，2007(5):9-13．

［2］Duffus C M，Rosie R．Some enzyme activities associated with the chlorophyll con-taining layers of the immature barley pericarp［J］．Planta，1973，114(3):219-226．

［3］Nutbeam A R，Duffus C M．Evidence for C4photosynthesis in barley pericarp tissue［J］．Biochemical and Biophysical Research Conmunications，1976，70(4):1198-1203．

［4］李衛(wèi)華，郝乃斌，戈巧英，等．C3植物中C4途徑的研究進展［J］．植物學通報，1999，16(2):97-106．

［5］李衛(wèi)華，盧慶陶，郝乃斌，等．大豆C4途徑與光系統(tǒng)Ⅱ光化學功能的相互關系［J］．植物學報，2000，42(7):689-692．

［6］李衛(wèi)華，盧慶陶，郝乃斌，等．大豆葉片C4循環(huán)途徑酶［J］．植物學報，2001，43(8):805-808．

［7］郝乃斌，譚克輝，那青松．C3植物綠色器官PEP羧化酶活性的比較研究［J］．植物學報，1991，33(9):692-697．

［8］郝乃斌，戈巧英，杜維廣．大豆高效育種光合生理研究進展［J］．植物學通報，1991，8(2):13-20．

［9］Hibberd J M，Quick W P．Characteristics of C4photosynthesis in stems and petioles of C3flowering plants［J］．Nature，2002，415:451-453．

［10］Aoyagi K，Bassham J A．Pyruvate orthophosphate dikkinase of C3seeds and leaves as compared to the enzyme from maize［J］．Plant Physiol，1984，75:387-392．

［11］劉振業(yè)，劉貞琦．光合作用的遺傳與育種［M］．貴陽:貴州人民出版社，1983．

［12］Hermans J，Westhoff P．Analysis of expression and evolutionary relationships of phosph-orenolpyruvate carboxylase genes in Flaveria trinervia(C4)and F．pringlei(C3)［J］．Mol Gen Genet，1990，224(3):459-468．

［13］Ku MSB，Kano Murakami Y，Matsuoka M．Evolution and expression of C4photo-synthesis genes［J］．Plant Physiol，1996，111:949-957．

［14］WEI Ai-li，WANG Zhi-min，ZHAI Zhi-xi，et al．Effect of Soil Drought on C4Photo-synthetic Enzyme Activities of Flag Leaf and Ear in Wheat［J］．Agricultural Sciences in China，2003，2(4):413-417．

［15］魏愛麗，張英華，黃琴，等．小麥不同綠色器官光合速率與碳同化酶活性及其基因型差異研究［J］．作物學報，2007，33(9):1426-1431．

［16］張英華，蘇達，張勝全，等．不同水分條件下冬小麥旗葉和穗器官的PEPC活性及其與粒重和蛋白質(zhì)含量的關系［J］．麥類作物學報，2009，29(6):997-1003．

［17］施教耐，吳敏賢，查靜娟．植物磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的研究Ⅰ．PEP羧化酶同工酶的分離和變構(gòu)特性的比較［J］．植物生理學報，1979，5:225-236．

［18］吳敏賢，查靜娟，施教耐．植物磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的研究Ⅱ．高粱葉片中PEP羧酶的代謝物調(diào)節(jié)特性和油酸抑制效應［J］．植物生理學報，1980，6:37-46．

［19］施教耐，吳敏賢，查靜娟．植物磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的研究Ⅴ．PEP羧化酶的可逆冷失活［J］．植物生理學報，1981，7:317-326．

［20］吳敏賢，查靜娟，施教耐植物磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的研究Ⅵ．G6P和甘氨酸對高粱葉片PEP羧化酶的穩(wěn)定效應［J］．植物生理學報，1982(8):9-16．

［21］吳敏賢，查靜娟，湯小儀，等．植物磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的研究Ⅷ．C4植物PEP羧化酶的光誘導形成［J］．植物生理學報，1982(8):101-110．

［22］查靜娟，吳敏賢，施教耐．高粱葉片磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的分離與純化［J］．植物生理學報，1983，9(1):23-30．

［23］張蜀秋．植物生理學實驗技術教程［M］．北京:科學出版社，2011．

［24］易同培，石軍義，馬麗莎，等．中國竹類圖志［M］．北京:科學出版社，2008．