箭竹DNA導(dǎo)入水稻后其遺傳背景、農(nóng)藝性狀及產(chǎn)量分析

劉華 梁發(fā)茂 張德建 徐俊英 李志新

摘要：【目的】將箭竹DNA導(dǎo)入水稻，并分析其遺傳背景、農(nóng)藝性狀及產(chǎn)量，為水稻遺傳育種提供技術(shù)參考?！痉椒ā坷没ǚ酃芡ǖ兰夹g(shù)將箭竹DNA導(dǎo)入4個(gè)水稻恢復(fù)系受體材料（9311、華占、Q7和揚(yáng)恢22）中，篩選出表型與受體材料存在差異的株系連續(xù)自交直至穩(wěn)定，并利用篩選出的49對(duì)多態(tài)性SSR引物鑒定變異株系的遺傳背景差異。以不同遺傳背景的變異株系與不育系3S和6303S配制雜交組合，并比較分析其農(nóng)藝性狀差異?！窘Y(jié)果】將箭竹DNA導(dǎo)入水稻后通過(guò)連續(xù)自交篩選出能穩(wěn)定遺傳的變異株系21個(gè)（T1～T21），其中9311、華占、Q7和揚(yáng)恢22的變異率分別為4.85%、1.30%、2.35%和2.65%。利用SSR標(biāo)記分析變異株系的遺傳背景，發(fā)現(xiàn)其與受體材料在49對(duì)SSR標(biāo)記在中存在差異的引物對(duì)數(shù)為2～24對(duì)，其中在24對(duì)標(biāo)準(zhǔn)引物中存在差異的對(duì)數(shù)范圍為0～11對(duì)，表明通過(guò)花粉管通道技術(shù)產(chǎn)生的變異具有一定的隨機(jī)性。不同遺傳背景變異株系與不育系組配的雜交組合在農(nóng)藝性狀和產(chǎn)量方面存在明顯差異，從中篩選出2個(gè)優(yōu)勢(shì)組合6303S×T10和6303S×T20，分別比我國(guó)長(zhǎng)江中下游中秈遲熟組篩選試驗(yàn)對(duì)照品種豐兩優(yōu)4號(hào)增產(chǎn)10.9%和12.9%?！窘Y(jié)論】將箭竹DNA導(dǎo)入水稻可產(chǎn)生穩(wěn)定遺傳的變異株系，從而獲得與其組配的優(yōu)勢(shì)雜交組合，即通過(guò)花粉管通道技術(shù)導(dǎo)入外源DNA或基因是水稻種質(zhì)資源創(chuàng)新及新品種選育的有效途徑。

關(guān)鍵詞： 水稻；箭竹；花粉管通道技術(shù)；SSR標(biāo)記；農(nóng)藝性狀；產(chǎn)量

中圖分類(lèi)號(hào)： S511.035.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2018）04-0619-09

Genetic backgroud， agronomic traits and yield of rice after introgression of Fargesia spathacea Franch.

LIU Hua1， LIANG Fa-mao2， ZHANG De-jian3， XU Jun-ying1*， LI Zhi-xin1*

（1College of Agronomy， Yangtze University/Hubei Collaborative Innovation Center for Crop Industry， Jingzhou，Hubei 434025， China； 2Yichang Academy of Agricultural Science， Yichang， Hubei 443004， China； 3Huazhong Agricultural University， Wuhan 430070， China）

Abstract：【Objective】DNA of Fargesia spathacea Franch. were introgressed into rice by pollen-tube pathway， then genetic background， agronomic traits and yield of rice were analyzed to provide reference for rice genetics and breeding. 【Method】DNA of F. spathacea were introgressed into four rice varieties（9311，Huazhan，Q7 and Yanghui 22） by pollen-tube pathway. The lines whose phenotypes were different from receptor materials were selected to self-breed till they were stable. Then genetic background differences between variant lines and receptor materials were identified by the screened 49 pairs of SSR markers. Cross combinations were established by variant lines with different genetic background and two sterile lines（3S and 6303S）， and their differences in agronomic traits were analyzed. 【Result】The results showed that after DNA of F. spathacea were introgressed into rice receptor materials and let them self-bred， 21 variant lines（T1-T21） that could transmit stably were obtained. Among them， variations of 9311， Huazhan， Q7 and Yanghui 22 were 4.85%， 1.30%， 2.35% and 2.65% respectively. Genetic background of the variant lines were analyzed by SSR markers. Among the 49 pairs of SSR markers， the variant lines were different from the receptor materials in 2-24 pairs of SSR markers； and among 24 pairs of standard primers， there were differences in 0-11 pairs. The results showed variation brought by po-llen-tube pathway was random. The hybrid combinations by variant lines with various genetic backgrounds and sterile lines had various agronomic traits and yields. Two advantage hybrid combinations， 6303S×T10 and 6303S×T20， from the cross combinations were selected. The yields of 6303S×T10 and 6303S×T20 increased by 10.9% and 12.9% than Fengliangyou 4， a control variety selected from middle-season late-mature indica rice combinations in the middle and lower reaches of Yangtze River. 【Conclusion】Introgression of DNA of F. spathacea into rice can obtain variant lines with stable heredity， then obtain advantage hybrid combinations that crosses with them. Introgression of exogenous gene by po-llen-tube pathway is an effective way in rice gerplasm resources innovation and variety breeding.

Key words： rice； Fargesia spathacea Franch.； pollen-tube pathway technique； SSR marker； agronomic traits； yield

0 引言

【研究意義】水稻（Oryza sativa L.）是我國(guó)最重要的糧食作物之一。矮桿水稻和雜交水稻品種的相繼推廣應(yīng)用使水稻產(chǎn)量大幅度提高。近年來(lái)，由于水稻親本間遺傳背景差異日益減小，難以選配出強(qiáng)優(yōu)勢(shì)雜交組合，因此，我國(guó)水稻育種和生產(chǎn)面臨巨大挑戰(zhàn)。結(jié)合現(xiàn)代生物技術(shù)創(chuàng)新水稻種質(zhì)資源以提高親本的遺傳多樣性，是選育出高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)新品種的關(guān)鍵。其中，花粉管通道技術(shù)是一種可應(yīng)用于任何開(kāi)花植物的基因或基因組轉(zhuǎn)化技術(shù)，不受基因型限制，能將供體材料的基因或基因組直接導(dǎo)入受體材料，并與其基因組進(jìn)行整合，致使受體材料產(chǎn)生變異（Zhou et al.，1983），不僅后代遺傳性狀穩(wěn)定，還可避免常規(guī)轉(zhuǎn)基因方法帶來(lái)的安全性爭(zhēng)議問(wèn)題，易于實(shí)現(xiàn)基因或基因組的大規(guī)模轉(zhuǎn)化，是創(chuàng)造新種質(zhì)和拓寬基因庫(kù)的有利途徑。箭竹（Fargesia spathacea Franch.）隸屬于禾本科箭竹屬，具有耐旱、耐寒、抗蟲(chóng)、抗倒伏、根系發(fā)達(dá)和再生力強(qiáng)等特性，通過(guò)花粉管通道技術(shù)將其DNA快速導(dǎo)入水稻，使水稻產(chǎn)生相關(guān)變異，對(duì)創(chuàng)新水稻種質(zhì)及遺傳育種具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】自1983年Zhou等建立花粉管通道技術(shù)以來(lái)，該技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于開(kāi)花植物的種質(zhì)創(chuàng)新及遺傳育種等研究，其基本原理是利用授粉經(jīng)伸長(zhǎng)的花粉管將外源DNA或基因沿珠心通道導(dǎo)入胚囊，轉(zhuǎn)化尚不具備正常細(xì)胞壁的卵、合子或早期胚胎細(xì)胞（周光宇等，1988）。Luo和Wu（1989）首次利用花粉管通道技術(shù)將含報(bào)告基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入水稻，經(jīng)Southern雜交和酶學(xué)鑒定，獲得外源基因整合并表達(dá)的轉(zhuǎn)基因水稻植株。王豐等（2004）通過(guò)花粉管導(dǎo)入法將稗草和玉米DNA導(dǎo)入水稻中，獲得穩(wěn)定的變異株系。王永斌等（2011）、肇瑩等（2015）將玉米和蘆葦?shù)腄NA通過(guò)花粉管通道法導(dǎo)入不同水稻品種受體，在轉(zhuǎn)化后代中篩選獲得光合效率、穗長(zhǎng)、每穗粒數(shù)、千粒重和抗鹽性均提高的變異株系。孫一丹等（2013）通過(guò)與花粉管通道技術(shù)同樣基于基因組“片段雜交”原理的穗莖注射技術(shù)，將小粒野生稻DNA導(dǎo)入水稻保持系V20B中，獲得株型和產(chǎn)量等方面均發(fā)生明顯變異的株系。除水稻外，通過(guò)花粉管通道技術(shù)還可將外源物種的DNA成功導(dǎo)入小麥、棉花和玉米等農(nóng)作物中，并獲得理想的變異材料（倪建福等，2005；劉冬梅等，2007；高樹(shù)仁等，2016）。此外，還有利用花粉管通道技術(shù)轉(zhuǎn)化外源基因組創(chuàng)新林木種質(zhì)資源的研究報(bào)道（陳洪偉，2008；趙鑫聞，2016）。以上研究證實(shí)，花粉管通道技術(shù)與遠(yuǎn)緣雜交相比，有效克服遠(yuǎn)緣雜交不親的難題，且成功率高、耗時(shí)少、穩(wěn)定快；與其他轉(zhuǎn)基因方法相比，不依賴(lài)組織培養(yǎng)技術(shù)，操作簡(jiǎn)單，成本低廉，安全性好，易推廣應(yīng)用。【本研究切入點(diǎn)】至今，鮮見(jiàn)利用花粉管通道技術(shù)將箭竹DNA快速導(dǎo)入水稻的相關(guān)研究報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】利用花粉管通道技術(shù)將箭竹DNA導(dǎo)入4個(gè)廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)的水稻恢復(fù)系（9311、華占、Q7和揚(yáng)恢22），從而獲得穩(wěn)定遺傳的變異株系，對(duì)其遺傳背景和農(nóng)藝性狀進(jìn)行分析，并與不育系3S和6303S組配雜交組合，分析其農(nóng)藝性狀和產(chǎn)量，以期獲得優(yōu)勢(shì)雜交組合，為水稻種質(zhì)資源創(chuàng)新及遺傳育種提供技術(shù)支持。

1 材料和方法

1. 1 試驗(yàn)材料

供體材料為箭竹，采自湖北十堰神農(nóng)架海拔2000 m左右的高山，抗性強(qiáng)，適應(yīng)性廣。受體材料為4個(gè)廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)的水稻恢復(fù)系，其中，9311、華占和揚(yáng)恢22由湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所提供，Q7由湖北省種子集團(tuán)有限公司提供。不育系3S和6303S分別由長(zhǎng)江大學(xué)農(nóng)學(xué)院和湖北荃銀高科種業(yè)有限公司提供，用于與受體恢復(fù)系及其變異株系配制兩系雜交組合，以期篩選出強(qiáng)優(yōu)勢(shì)雜交后代。豐兩優(yōu)4號(hào)由合肥豐樂(lè)種業(yè)有限公司提供。PCR擴(kuò)增及凝膠電泳所需的試劑均購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司。主要儀器設(shè)備：PCR儀（Bio-Rad T100）、離心機(jī)（eppendorf 5810R）、電泳儀（JY 5000）和電泳槽（JY-JX5）。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 箭竹和水稻DNA提取 取箭竹和水稻新鮮葉片60 mg，用液氮研磨成粉末，加入20 mL預(yù)熱的提取液[2% CTAB、0.1 mol/L Tris-HCl（pH 8.0）、0.02 mol/L Na2EDTA、1.4 mol/L NaCl和0.2%巰基乙醇]，65 ℃水浴30 min，期間顛倒數(shù)次后加入20 mL氯仿和異戊醇（24∶1），溫和顛倒混勻10 min，靜置5 min，4 ℃下8000 r/min離心10 min，取10 mL上清液加入等體積的氯仿和異戊醇（24∶1）再抽提1次，取1 mL上清液加入等體積的異丙醇，輕輕顛倒混勻，-20 ℃放置30 min，4 ℃下10000 r/min離心5 min，棄上清液，用75%乙醇洗滌沉淀2次，涼干后用ddH2O溶解，DNA（OD260/OD280為1.8～2.0）稀釋至100 μg/mL，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 2. 2 箭竹DNA轉(zhuǎn)化 轉(zhuǎn)化時(shí)間為水稻開(kāi)花后1.5～3.0 h。除去水稻穗上已開(kāi)和未開(kāi)穎花，用鑷子將水稻當(dāng)天開(kāi)放穎花的內(nèi)外穎分開(kāi)，刀片切掉柱頭（不傷及子房），用移液槍向切口處滴入10.00 μL箭竹DNA（100 μg/mL），合上穎殼，套袋隔離，收獲成熟的種子。以ddH2O轉(zhuǎn)化水稻作為對(duì)照。

1. 2. 3 變異株系篩選 變異株系篩選試驗(yàn)在湖北省荊州市和海南省陵水縣光坡鎮(zhèn)進(jìn)行，一年篩選兩代。對(duì)收獲的種子進(jìn)行田間種植觀察，抽穗期進(jìn)行套袋自交，每株收取主穗。下一世代各種植50株（10株/行，共5行），株行距為16.6 cm×20.0 cm。以受體親本為對(duì)照，考查各轉(zhuǎn)化株系的播始?xì)v期、分蘗數(shù)、株高、粒型、穗粒數(shù)、千粒重和結(jié)實(shí)率等農(nóng)藝性狀，篩選出變異株系。連續(xù)種植變異株系（10株/行，共3行），株行距為16.6 cm×20.0 cm，從苗期開(kāi)始考查其主要農(nóng)藝性狀，開(kāi)花期單株套袋自交，成熟期考查產(chǎn)量性狀，選擇變異單株連續(xù)自交，直至性狀穩(wěn)定。

1. 2. 4 SSR標(biāo)記分析

1. 2. 4. 1 引物篩選及合成 從國(guó)家水稻數(shù)據(jù)中心（http：//www.ricedata.cn/marker/index.htm）獲取84對(duì)平均分布在12個(gè)連鎖群上的SSR引物序列，對(duì)變異株系和4個(gè)受體材料進(jìn)行遺傳背景分析，從中篩選出49對(duì)具有多態(tài)性的SSR引物（表1），其中24對(duì)為構(gòu)建DNA指紋圖譜的標(biāo)準(zhǔn)引物。所有引物序列均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1. 2. 4. 2 PCR擴(kuò)增SSR標(biāo)記 PCR反應(yīng)體系15.00 μL：10×Buffer（含Mg2+）1.50 μL，10 μmol/L上、下游引物各0.45 μL，2 mmol/L dNTPs 0.75 μL，Taq DNA聚合酶0.35 μL，10 ng/μL DNA模板2.00 μL，ddH2O補(bǔ)足至15.00 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃ 45 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，進(jìn)行36個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)體系中加入1.00 μL溴酚藍(lán)，混勻，用7%聚丙烯凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增片段的多態(tài)性，分析變異株系與受體材料的遺傳背景。

1. 2. 4. 3 農(nóng)藝性狀及產(chǎn)量分析 從不同遺傳背景變異株系中挑選田間表現(xiàn)較好的株系各2份，按不完全雙列雜交設(shè)計(jì)，分別與不育系3S和6303S配制雜交組合，試驗(yàn)在長(zhǎng)江大學(xué)農(nóng)學(xué)院基地進(jìn)行。采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，3次重復(fù)。5月1日播種，薄膜覆蓋育苗，6月2日移栽，單本植，株行距為16.6 cm×20.0 cm，每小區(qū)種植30株（10株/行，共3行），大田常規(guī)管理。抽穗時(shí)調(diào)查始穗期，成熟時(shí)取各小區(qū)中間行連續(xù)6株長(zhǎng)勢(shì)基本相同的單株進(jìn)行考種，測(cè)定其株高、單株有效穗數(shù)、單穗長(zhǎng)、每穗總粒數(shù)、每穗實(shí)粒數(shù)、結(jié)實(shí)率和千粒重等性狀。各小區(qū)分別混收測(cè)產(chǎn)，產(chǎn)量為考種植株產(chǎn)量在內(nèi)的30株水稻產(chǎn)量之和。由于豐兩優(yōu)4號(hào)為長(zhǎng)江中下游地區(qū)水稻中秈遲熟組的對(duì)照品種，在品種篩選及審定過(guò)程中均以其為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，因此本研究也以其產(chǎn)量與各組合的產(chǎn)量進(jìn)行比較分析。

1. 3 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 19.0進(jìn)行各性狀間的相關(guān)分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 變異株系篩選結(jié)果

水稻開(kāi)花后1.5～3.0 h，將箭竹DNA導(dǎo)入4個(gè)受體材料共1095朵穎花中，收獲839粒種子，成粒率為76.60%，田間種植成苗數(shù)為792株，成苗率為94.39%（表2）。在苗期和成熟期進(jìn)行主要農(nóng)藝性狀考察及測(cè)定，結(jié)果篩選出42個(gè)在播始?xì)v期、分蘗數(shù)、株高、穗粒數(shù)、干粒重、粒型和結(jié)實(shí)率等性狀上發(fā)生變異的單株，平均轉(zhuǎn)化率為5.30%。通過(guò)連續(xù)自交篩選出能穩(wěn)定遺傳的變異株系21個(gè)（T1～T21），其中9311、華占、Q7和揚(yáng)恢22的變異率分別為4.85%、1.30%、2.35%和2.65%（表2）。

2. 2 SSR標(biāo)記的遺傳背景差異分析結(jié)果

利用49對(duì)多態(tài)性SSR引物對(duì)篩選出的21個(gè)變異株系和4個(gè)受體材料進(jìn)行遺傳背景差異分析，結(jié)果如表3所示。變異株系與受體材料存在差異的引物對(duì)數(shù)為2～24對(duì)，其中在24對(duì)標(biāo)準(zhǔn)引物中存在差異的對(duì)數(shù)為0～11對(duì)，表明變異株系與受體材料具有不同的遺傳背景，而相同受體材料產(chǎn)生的不同變異株系間的遺傳背景也存在一定差異?？梢?jiàn)，通過(guò)花粉管通道技術(shù)產(chǎn)生的變異具有一定的隨機(jī)性。根據(jù)水稻品種鑒定標(biāo)準(zhǔn)（NYT 1433—2007），當(dāng)檢測(cè)到待測(cè)品種在24對(duì)標(biāo)準(zhǔn)引物中存在2對(duì)及以上差異時(shí)即可判定為不同品種。在21個(gè)變異株系中有13個(gè)可與受體材料完全區(qū)分開(kāi)，另外8個(gè)變異株系也能在其他位點(diǎn)上找到與受體材料的差異，其中，以9311為遺傳背景的變異株系有8個(gè)（T1～T8），以華占為遺傳背景的變異株系有3個(gè)（T9～T11），以Q7為遺傳背景的變異株系有4個(gè)（T12～T15），以揚(yáng)恢22為遺傳背景的變異株系有6個(gè)（T16～T21）。由此進(jìn)一步證實(shí)，田間篩選獲得的21個(gè)農(nóng)藝性狀穩(wěn)定變異株系在遺傳上也存在明顯變異。

由表4可知，利用49對(duì)多態(tài)性SSR引物從21個(gè)變異株系中共檢測(cè)出135個(gè)等位變異位點(diǎn)，每對(duì)引物檢測(cè)出的等位變異數(shù)為2～5個(gè)，其中檢測(cè)出等位變異數(shù)目最多的是RM232和RM304，均為5個(gè)，平均每對(duì)引物的變異位點(diǎn)為2.90個(gè)，表明21個(gè)變異株系的變異位點(diǎn)豐富且隨機(jī)。部分引物RM35、RM258、RM208和RM297凝膠電泳結(jié)果如圖1所示。雖然21個(gè)變異株系在遺傳上與其受體材料均存在差異，但從應(yīng)用價(jià)值角度篩選出田間表現(xiàn)較好的8個(gè)變異株系，包括以9311為遺傳背景的變異株系T1和T2，以華占為遺傳背景的變異株系T9和T10，以Q7為遺傳背景的變異株系T14和T15，以揚(yáng)恢22為遺傳背景的變異株系T20和T21。按不完全雙列雜交設(shè)計(jì)，與不育系3S和6303S配制雜交組合，以期篩選出強(qiáng)優(yōu)勢(shì)雜交組合供生產(chǎn)應(yīng)用。但組合3S×Q7、3S×T20、3S×T21、3S×揚(yáng)恢22、3S×T20和3S×T21因感光性太強(qiáng)，未能正常抽穗。

2. 3 9311遺傳背景變異株系及其與不育系組配雜交組合的農(nóng)藝性狀及產(chǎn)量分析結(jié)果

由表5可知，變異株系T1的播始?xì)v期和株高顯著低于受體材料9311（P<0.05，下同），但千粒重顯著增加，單穗長(zhǎng)、單株有效穗數(shù)、每穗總粒數(shù)和結(jié)實(shí)率無(wú)顯著差異（P>0.05，下同）；變異株系T2的單株有效穗數(shù)和每穗粒數(shù)均顯著高于受體材料9311，但單穗長(zhǎng)顯著降低，播始?xì)v期、株高、結(jié)實(shí)率和千粒重?zé)o顯著差異。綜上所述，變異株系T2的單株有效穗數(shù)和每穗總粒數(shù)為有利變異，具有較大的應(yīng)用潛力。

變異株系T1和T2分別與不育系3S和6303S組配雜交組合的農(nóng)藝性狀如表5所示。組合3S×T1的播始?xì)v期、株高、結(jié)實(shí)率和千粒重較受體組合3S×9311顯著降低，但單株有效穗數(shù)顯著增加，其他性狀無(wú)顯著差異；組合3S×T2的播始?xì)v期、每穗總粒數(shù)和結(jié)實(shí)率較受體組合3S×9311均顯著降低，單株有效穗數(shù)和千粒重均顯著增加，其他性狀無(wú)顯著差異。組合6303S×T1的每穗總粒數(shù)和千粒重較受體組合6303S×9311顯著降低，其他性狀無(wú)顯著差異；組合6303S×T2的單穗長(zhǎng)、單株有效穗數(shù)、每穗總粒數(shù)和千粒重較受體組合6303S×9311顯著降低，其他性狀無(wú)顯著差異。在變異株系與不育系組配的4個(gè)組合中，以組合3S×T1產(chǎn)量表現(xiàn)最優(yōu)，較受體組合3S×9311顯著增產(chǎn)21.5%，較豐兩優(yōu)4號(hào)（11476.6 kg/ha）增產(chǎn)3.2%，該組合的優(yōu)勢(shì)在于具有較高的單株有效穗數(shù)。綜上所述，雖然變異株系T1的千粒重較受體材料9311顯著增加，變異株系T2的單株有效穗數(shù)和每穗總粒數(shù)較9311也顯著增加，但與其組配的組合在相應(yīng)性狀上未表現(xiàn)出優(yōu)勢(shì)，其原因是雜種組合性狀表現(xiàn)受父母本間特殊配合力的影響，后期可根據(jù)特殊配合力分析結(jié)果進(jìn)行組配，仍有望篩選出強(qiáng)優(yōu)勢(shì)組合。

2. 4 華占遺傳背景變異株系及其與不育系組配雜交組合的農(nóng)藝性狀及產(chǎn)量分析結(jié)果

由表6可知，變異株系T9的每穗總粒數(shù)和千粒重均顯著高于受體材料華占，而其他性狀無(wú)顯著差異。變異株系T9與受體材料華占的穗型比較見(jiàn)圖2，可看出變異株系T9的每穗總粒數(shù)明顯多于華占。變異株系T10的播始?xì)v期較受體材料華占顯著降低，單株有效穗數(shù)和千粒重顯著增加，其他性狀無(wú)顯著差異。綜上所述，變異株系T9的每穗總粒數(shù)和千粒重及變異株系T10的單株有效穗數(shù)和千粒重均為有利變異，具有較大的應(yīng)用潛力。

變異株系與不育系3S和6303S配制雜交組合的農(nóng)藝性狀如表6所示。組合3S×T9的單株有效穗數(shù)較受體組合3S×華占顯著減少，千粒重顯著增加，其他性狀無(wú)顯著差異；組合3S×T10的株高較受體組合3S×華占顯著降低，千粒重和單株有效穗數(shù)顯著增加，其他性狀無(wú)顯著差異。組合6303S×T9的單株有效穗數(shù)較受體組合6303S×華占顯著減少，但千粒重顯著增加，其他性狀無(wú)顯著差異；組合6303S×T10的播始?xì)v期、株高、每穗總粒數(shù)和千粒重較受體組合6303S×華占顯著增加，單株有效穗數(shù)顯著降低。在變異株系與不育系組配的4個(gè)組合中，以組合6303S×T10產(chǎn)量表現(xiàn)最優(yōu)，較受體組合6303S×華占顯著增產(chǎn)10.8%，較豐兩優(yōu)4號(hào)增產(chǎn)10.9%，可作為新優(yōu)勢(shì)組合進(jìn)一步篩選。

2. 5 Q7遺傳背景變異株系及其與不育系組配雜交組合的農(nóng)藝性狀及產(chǎn)量分析結(jié)果

由表7可知，變異株系T14的播始?xì)v期、株高和單株有效穗數(shù)較受體材料Q7顯著增加，其他性狀均無(wú)顯著差異；變異株系T15的播始?xì)v期和株高較受體材料Q7顯著增加，但單株有效穗數(shù)和每穗總粒數(shù)顯著減少?？梢?jiàn)，變異株系T14僅在單株有效穗數(shù)上較受體材料Q7有所改良，為有利變異，而變異株系T15的單株有效穗數(shù)和每穗總粒數(shù)均較受體材料Q7差。

變異株系與不育系6303S配制雜交組合的農(nóng)藝性狀如表7所示。組合6303S×T14的播始?xì)v期、株高、單穗長(zhǎng)、結(jié)實(shí)率和千粒重較受體組合6303S×Q7顯著增加，但單株有效穗數(shù)顯著減少；組合6303S×T15的株高、結(jié)實(shí)率和千粒重較受體組合6303S×Q7顯著增加，而每穗總粒數(shù)和有效穗數(shù)顯著減少。在變異株系與不育系組配的2個(gè)組合中，以組合6303S×T14產(chǎn)量表現(xiàn)最優(yōu)，較受體組合6303S×Q7顯著增產(chǎn)20.9%，但較豐兩優(yōu)4號(hào)減產(chǎn)20.0%，應(yīng)予以淘汰。

2. 6 揚(yáng)恢22遺傳背景變異株系及與不育系組配雜交組合的農(nóng)藝性狀及產(chǎn)量分析結(jié)果

由表8可看出，變異株系T20和T21的播始?xì)v期較揚(yáng)恢22顯著減少，但單株有效穗數(shù)、單穗長(zhǎng)、每穗總粒數(shù)和千粒重均顯著增加，表明兩個(gè)變異株系的主要產(chǎn)量構(gòu)成性狀均顯著提升。

變異株系T20和T21與不育系6303S配制雜交組合的農(nóng)藝性狀如表8所示。組合6303S×T20和6303S×T21較受體組合6303S×揚(yáng)恢22的播始?xì)v期顯著減少，株高和千粒重顯著增加。其中，組合6303S×T20的單株有效穗數(shù)較受體組合6303S×揚(yáng)恢22顯著增加，組合6303S×T21的每穗總粒數(shù)較受體組合6303S×揚(yáng)恢22顯著增加。在變異株系與不育系組配的2個(gè)組合中，以組合6303S×T20產(chǎn)量表現(xiàn)最優(yōu)，較受體組合6303S×揚(yáng)恢22顯著增產(chǎn)45.7%，較豐兩優(yōu)4號(hào)增產(chǎn)12.9%，可作為新優(yōu)勢(shì)組合進(jìn)一步篩選。

3 討論

花粉管通道技術(shù)作為一種簡(jiǎn)單有效的外源DNA導(dǎo)入方法，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于水稻（王豐等，2004）、小麥（倪建福等，2005）、棉花（劉冬梅等，2007）、玉米（董春林等，2011）及林木（趙鑫聞，2016）的研究領(lǐng)域?；ǚ酃芡ǖ兰夹g(shù)的轉(zhuǎn)化率與轉(zhuǎn)化時(shí)間密切相關(guān)，最佳的轉(zhuǎn)化時(shí)期是受精初期，外源DNA通過(guò)花粉管進(jìn)入胚囊（周光宇等，1988）。但不同植物的最佳轉(zhuǎn)化時(shí)間存在差異，王豐等（2004）在水稻授粉后的1.5～2.0 h進(jìn)行轉(zhuǎn)化，變異率可達(dá)1.48%～3.80%；丁建庭等（2009）研究發(fā)現(xiàn)，水稻授粉后0.5～2.5 h是最佳轉(zhuǎn)化時(shí)間；周巖等（2011）研究發(fā)現(xiàn)，小麥最佳轉(zhuǎn)化時(shí)期是開(kāi)花后1.0～1.5 h。本研究于水稻授粉后的1.5～3.0 h進(jìn)行轉(zhuǎn)化，變異率為1.30%～4.85%，與上述的研究結(jié)果基本一致。

將外源DNA或基因?qū)胧荏w材料中具有誘變和基因轉(zhuǎn)移雙重作用。本研究利用花粉管通道技術(shù)將箭竹DNA導(dǎo)入水稻是由于二者均屬于禾本科植物，具有一定的親緣關(guān)系，在部分染色體區(qū)域可能發(fā)生交換與重組。通過(guò)SSR標(biāo)記分析，發(fā)現(xiàn)受體材料與變異株系間存在遺傳背景差異，說(shuō)明外源DNA導(dǎo)入可改變受體材料的遺傳背景。因此，通過(guò)外源DNA導(dǎo)入不僅能為遺傳學(xué)研究提供特異材料，還可為育種創(chuàng)造有利的變異材料。唐清杰等（2010）將海南疣粒野生稻基因?qū)朐耘嗟局?，獲得單穗長(zhǎng)、產(chǎn)量和抗性均較優(yōu)的變異材料；王永斌等（2011）將玉米DNA導(dǎo)入水稻中獲得高光效的變異材料；魏霞等（2015）將高梁DNA導(dǎo)入水稻獲得抗旱性較強(qiáng)的變異材料；賈影影等（2016）將大豆DNA導(dǎo)入小麥中，獲得產(chǎn)量和品質(zhì)均較優(yōu)的變異材料。本研究發(fā)現(xiàn)，將箭竹DNA導(dǎo)入4個(gè)水稻恢復(fù)系受體材料中，獲得的變異株系保留了受體材料的主要特性，但單株有效穗數(shù)、每穗總粒數(shù)、穗長(zhǎng)和千粒重等性狀存在明顯差異，且變異株系與不育系組配的組合在農(nóng)藝性狀和產(chǎn)量方面與受體組合也存在明顯差異，其中有2個(gè)優(yōu)勢(shì)組合6303S×T10和6303S×T20較我國(guó)長(zhǎng)江中下游中秈遲熟組篩選試驗(yàn)對(duì)照品種豐兩優(yōu)4號(hào)增產(chǎn)10.0%以上，可作為新優(yōu)勢(shì)組合進(jìn)一步篩選。

利用花粉管通道技術(shù)導(dǎo)入外源DNA可產(chǎn)生穩(wěn)定遺傳的有利變異，是物種種質(zhì)資源創(chuàng)新的有效途徑。但本研究發(fā)現(xiàn)，利用花粉管通道技術(shù)導(dǎo)入外源DNA產(chǎn)生變異具有一定的隨機(jī)性，可重復(fù)性較低，且產(chǎn)生變異的分子機(jī)理尚不明確，可能是尚未被廣泛接受的主要原因。但隨著該技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用及其產(chǎn)生變異的分子機(jī)理研究不斷深入，將會(huì)被廣泛應(yīng)用于各研究領(lǐng)域。

4 結(jié)論

將箭竹DNA導(dǎo)入水稻可產(chǎn)生穩(wěn)定遺傳的變異株系，從而獲得與其組配的優(yōu)勢(shì)雜交組合，即通過(guò)花粉管通道技術(shù)導(dǎo)入外源DNA或基因是水稻種質(zhì)資源創(chuàng)新及新品種選育的有效途徑。

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（責(zé)任編輯 陳 燕）