淀粉對轉移因子膠囊質(zhì)量控制方法的影響

殷書平，張國柱，盧 勤，楊雅媛（.陜西醫(yī)藥控股集團生物有限公司，漢中 723000；2.漢中市食品藥品檢驗所，漢中723000）

淀粉對轉移因子膠囊質(zhì)量控制方法的影響

殷書平1，張國柱2＊，盧 勤1，楊雅媛1（1.陜西醫(yī)藥控股集團生物有限公司，漢中 723000；2.漢中市食品藥品檢驗所，漢中723000）

目的 考查淀粉對轉移因子膠囊在251與280nm波長處的吸光度的比值（純度檢查）的影響。方法 選取不同的淀粉并對比2種不同的樣品處理方法對測定結果的影響。結果 淀粉的存在確實能使轉移因子膠囊在251與280nm波長處的吸光度的比值降低，且造成結果不穩(wěn)定。結論 測定含淀粉轉移因子膠囊的樣品時，宜先將樣品制成較高質(zhì)量濃度，濾去不溶或微溶輔料后，稀釋至適宜的質(zhì)量濃度測定，以盡可能減少輔料的干擾。

轉移因子膠囊；分光光度法；吸光度比值

轉移因子膠囊為免疫調(diào)節(jié)藥，可用于某些抗生素難以控制的病毒性或霉菌性細胞內(nèi)感染的輔助治療，也可作為惡性腫瘤的輔助治療劑［1］。

本品收載于《國家食品藥品監(jiān)督管理局國家藥品標準化學藥品地方標準上升國家標準第十六冊》，系用健康豬或牛脾臟為原料，經(jīng)去脂肪、細胞破碎、透析或超濾制成的相對分子質(zhì)量小于6 000道爾頓的多肽、氨基酸和多核苷酸混合物的溶液，經(jīng)冷凍干燥與淀粉或經(jīng)制粒的淀粉混勻后裝膠囊而成［1］。該藥品標準規(guī)定其鑒別為：取裝量差異項下細粉，加水制成每1mL中含多肽1.5mg的溶液，濾過，濾液用水制成每1mL中含多肽20μg的溶液，照分光光度法測定（即先過濾再稀釋），在251±2nm（豬脾）或261± 2nm（牛脾）與280nm波長處吸光度的比值不得低于1.9［1］。筆者在實際工作中發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)的檢驗人員都是直接取樣品，加水制成每1mL中含多肽20μg的溶液，濾過，照分光光度法測定（即先稀釋再過濾）。與同行交流時大多數(shù)人也認為，后一種方法沒有什么問題，且更為簡便。但按照后一種方法，某生物有限公司生產(chǎn)的數(shù)批轉移因子膠囊都存在凍干原粉的251與280nm吸光度的比值（以下簡稱比值或寫為A251／A280）均在1.90以上，且結果穩(wěn)定，而與淀粉混合后所得混合粉或成品比值有所降低，有的甚至低于1.85而成為不合格品，且重復性差，嚴重影響了該生物研究所的正常生產(chǎn)。對生產(chǎn)過程進行了解，證實凍干原粉除了與適量淀粉混勻外，未作任何加工。為證實淀粉對其是否存在影響，筆者選取了不同的淀粉并按不同的方法制備了樣品進行了考察，發(fā)現(xiàn)造成該現(xiàn)象的原因隱蔽，易于疏忽，也容易被實驗人員誤解，且這類紫外分光光度法測定吸光度比值測不準的現(xiàn)象較為常見，但尚未見文獻對其解釋?，F(xiàn)將分析結果報道如下，與同行商榷，并為此類用分光光度法測定吸光度比值的鑒別實驗提供思路及借鑒。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 美國PE lambda 35型紫外分光光度計；德國賽多利斯CPA225D型電子天平。

1.2 試藥 HZ淀粉（批號分別為20110311，20130201，20130315，20130407與AK淀粉（批號分別為130407，130505）均由陜西醫(yī)藥控股集團生物有限公司提供；轉移因子凍干原粉（批號分別為130408，130412，130501，130503，130307，130507，130509，130601），轉移因子膠囊分別由上述凍干原粉與淀粉或經(jīng)制粒的淀粉混合裝膠囊制成，均由陜西醫(yī)藥控股集團生物有限公司提供；純化水，漢中市食品藥品檢驗所化學室提供。

2 方法與結果

2.1 方法1 取約相當于多肽3mg的不同批號的凍干原粉加水150mL，制成每1mL中含多肽20μg的溶液，濾過，取續(xù)濾液照分光光度法測定；另取由同批原粉制得的膠囊內(nèi)容物適量，加水150mL，制成每1mL中含多肽20μg的溶液，濾過，取續(xù)濾液照分光光度法測定。結果見圖1、表1和表2。

圖1 部分樣品的典型紫外圖譜1.比值低于1.8的樣品；2～4.比值約為1.9的樣品；5.比值大于2.3的樣品Fig.1 Ultraviolet spectra of different samples1.sample of ratio less than 1.8；2－4.sample of ratio around 1.9；5.sample of ratio exceed 2.3

表1 凍干粉的測得結果（方法1）Tab.1 Results of freeze－dried powder（method 1）

表2 膠囊的測得結果（方法1）Tab.2 Results of capsules（method 1）

2.2 方法2 取約相當于多肽30mg的凍干原粉加水20mL，制成每1mL中含多肽1.5mg的溶液，濾過，取續(xù)濾液2mL，加水至150mL搖勻，照分光光度法測定，另取由同批原粉制得的膠囊內(nèi)容物適量，加水20mL，制成每1mL中含多肽1.5mg的溶液，濾過，取續(xù)濾液2mL，加水至150mL，搖勻，照分光光度法測定，結果見表3和表4。

表3 凍干粉的測得結果（方法2）Tab.3 Results of freeze－dried powder（method 2）

表4 膠囊的測得結果（方法2）Tab.4 Results of capsules（method 2）

2.3 淀粉對樣品測定的影響 取淀粉或經(jīng)制粒的淀粉約0.3g，加水150mL，振搖，制成懸濁液，放置，取上層清液濾過，取續(xù)濾液照分光光度法測定，結果見表5和圖2。

表5 不同淀粉的溶液在251和280 nm的吸光度Tab.5 Absorbance of different starches at 251and 280nm

由表1和表2可知，凍干原粉制成膠囊后，用2.1方法制樣測定，其在251和280nm的比值相應減小；由表3和表4可以看出，用2.2方法測定，凍干原粉制成膠囊后，其在251和280nm的比值則無明顯變化；了解生產(chǎn)過程證實凍干原粉除了與適量淀粉混勻外，未作任何其他加工；且李華等認為轉移因子穩(wěn)定性良好［2］；黨昶永等認為轉移因子熱穩(wěn)定性好［3］；充分說明，淀粉是影響其比值變化的關鍵因素。

圖2 不同淀粉的紫外吸收圖譜1.AK淀粉130407；2.AK淀粉130505；3.AK淀粉130505制粒；4.HZ淀粉20130315；5.HZ淀粉20130201；6.HZ淀粉20130315制粒；7.HZ淀粉20130201制粒；8.HZ淀粉20110311Fig.2 Ultraviolet spectra of different starches1.AK starch 130407；2.AK starch 130505；3.AK starch 130505 granulated；4.HZ starch 20130315；5.HZ starch 20130201；6.HZ starch 20130315granulated；7.HZ starch 20130201granulated；8.Hz starch 20110311

淀粉不溶于冷水［4］，但對表3數(shù)據(jù)及圖譜3進行觀察，發(fā)現(xiàn)不同的淀粉在200～300nm之間均有不同程度的紫外吸收，吸光度大約為0.03～0.08，吸收曲線幾乎為一條直線，在251和280nm均無吸收峰值，其在251和280nm的吸光度基本相同。這是多數(shù)實驗人員認為淀粉對實驗結果沒有影響、可以按2.1的制樣方法直接將膠囊內(nèi)容物稀釋成每1mL中含多肽20μg的溶液測定的依據(jù)。

淀粉對轉移因子紫外吸收曲線的形狀無影響，但對其吸收值有影響，通常每1mL中含多肽20μg的轉移因子溶液，在251nm的吸光度A約為0.3，當比值為1.9時，280nm的吸光度則應為0.157 9，假設溶液中淀粉的吸光度分別為0.03，0.04，0.05，0.06，0.07和0.08，按2.1方法制備的轉移因子膠囊的溶液的紫外吸收圖譜中，均含有0.03～0.08的淀粉的吸收，則樣品的理論吸光度及其在251和280nm的吸光度比值應如表6所示。

表6 淀粉的吸收對樣品吸光度比值的影響Tab.6The influence of starch on the absorbance ratio

由表6可知，淀粉的存在的確能使吸光度比值降低，而且淀粉水溶液本身的吸光度越大，比值降低越嚴重。我們曾做過轉移因子質(zhì)量濃度與比值的關系的考察，將同一批轉移因子膠囊按2.1方法分別制成每1mL中含多肽80，60，40，20，10及5μg的溶液，測定其在251和280nm波長處吸光度的比值，發(fā)現(xiàn)質(zhì)量濃度越大，比值越高，其原因是淀粉在水中的溶解度雖然極其微小，吸光度只有0.03～0.08，但隨著轉移因子質(zhì)量濃度的增加和吸光度的相應增加，淀粉產(chǎn)生的吸收對比值的影響就會越來越小，這一點在數(shù)學上能夠簡單地證明。這同時解釋了同一樣品多次測定得不到穩(wěn)定的比值的原因。

結合表1和表2數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，轉移因子凍干原粉按2.1制樣和按2.2制樣測定，其比值無明顯變化，是因為凍干原粉中不含淀粉，沒有淀粉的影響，按2.1制樣和按2.2制樣均可。這也進一步證實了淀粉是影響比值的主要因素。

3 討論

轉移因子不止一種物質(zhì)，它含有多種游離氨基酸、多肽、多核苷酸、多種堿基及核酸降解產(chǎn)物、前列腺素、葉酸、組織胺等［5］。蛋白質(zhì)、多肽因為其結構中含有絲氨酸、酪氨酸殘基等共軛體系，在280nm波長處有最大吸收［6］；而多核苷酸則因含有嘌呤、嘧啶等共軛系統(tǒng)在260nm波長附近對紫外光有較強吸收，而不同的堿基其最大吸收波長不同［6］。因此一般認為，251nm的吸收（豬脾）主要與轉移因子中多核苷酸的量有關，而280nm的吸收則主要與樣品中蛋白質(zhì)、多肽、游離氨基酸等的量有關。251和280nm吸光度的比值理論上與產(chǎn)品中核酸和多肽這兩類物質(zhì)的量的相對量有相關性。轉移因子中的蛋白質(zhì)越少越好，比值則可以反映轉移因子的純度，比值應該越大越好，如宋愿智等認為紫外分光光度法測定的是多肽和核酸兩者之間的比值［7］。生產(chǎn)中發(fā)現(xiàn)，部分樣品比值可以達到2.3，如圖1中的5；也有的樣品比值達不到1.8，如圖1中的1；而對于圖1中類似2，3，4一類的樣品，則需按照2.2中的方法準確測定其吸光度的比值，否則可能將合格藥品判為不合格藥品；如果生產(chǎn)出的凍干原粉比值達不到1.9，則應從生產(chǎn)中找原因，提高生產(chǎn)工藝進而提高藥物的質(zhì)量。

在實驗過程中，251nm的吸收取的是轉移因子樣品紫外光譜的最大吸收峰值，而其在280nm無最大吸收峰值（圖1）。因此280nm的吸收是一個固定波長處的吸收，考慮到儀器誤差可能帶來的影響，實驗前應對儀器進行校準，以免產(chǎn)生較大的誤差。

本文只考察了淀粉對轉移因子膠囊鑒別的影響，但其他藥物成分或輔料對這種通過吸光度比值進行鑒別的實驗方法也可能造成類似的影響。希望本文為此類方法提供思路及借鑒。

4 結論

綜上所述，要得到正確的實驗結果，應該按照方法2.2制備樣品溶液，即取約相當于多肽30mg的凍干原粉或取膠囊10粒，傾出內(nèi)容物，加水20mL，制成每1mL中約含多肽1.5mg的溶液，濾過，取續(xù)濾液2mL，加水至150mL，搖勻，照分光光度法測定。將淀粉濾除后再稀釋濾液，這樣就將淀粉在水中的質(zhì)量濃度稀釋約75倍，淀粉產(chǎn)生0.03～0.08的吸收理論上變成0.000 4～0.001，這樣的吸收對比值的影響可以忽略不計。而按1.1的制樣方法直接將膠囊內(nèi)容物稀釋成每1mL中含多肽20μg的溶液測定的做法是不妥當?shù)?，是造成從凍干原粉到成品?51和280nm吸光度比值降低的主要原因。

［1］ 國家藥典委員會.國家藥品標準：第十六冊［S］.2003：103－111.

［2］ 李華，謝忠平，柯華昕，等.轉移因子的穩(wěn)定性考查［J］.中國藥業(yè)，2006，15（2）：39.

［3］ 黨昶永，程建杰，殷書平，等.轉移因子耐熱性的研究［J］.中國藥師，2011，14（9）：1363－1364.

［4］ 國家藥典委員會.中國藥典2010年版［S］.二部.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：1228.

［5］ 宋愿智，蔡曉民，崔玉綿，等.轉移因子質(zhì)量標準異同淺析［J］.西北藥學雜志，2000，15（5）：219－220.

［6］ 查錫良.生物化學［M］.7版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2008：11－60.

Influence of starch on the quality control method of Transfer Factor Capsules

YIN Shuping1，ZHANG Guozhu2＊，LU Qin1，YANG Yayuan1（1.Shaanxi Pharmaceutical Holding Group Biological Products Limited Company，Hanzhong 723000，China；2.Hanzhong Institute for Food and Drug Control，Hanzhong 723000，China）

Objective To examine the starch′s influence on the UV absorbance ratio at 251and 280nm of Transfer Factor Capsules.Methods Different amount of starches were added and the influence was observed.Results Starch can influence the determination of absorbance ratio，causing the ratio unstable.Conclusion In the determination of absorbance ratio，when samples contained starch and other accessories，filtration is necessary to reduce the interference of accessories.

Transfer Factor Capsules；spectrophotometric method；absorbance ratio

2,ebook=35

10.3969／j.issn.1004－2407.2015.02.011

R917

A

1004－2407（2015）02－0141－04

2014－07－20）

殷書平，男，副主任藥師

＊通信作者：張國柱，男，副主任藥師