三甲胺、二甲胺及氧化三甲胺含量測定方法的研究進(jìn)展

陳錦文，崔燕芒，趙 燕＊（.第四軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院，西安 7003；.解放軍第536醫(yī)院藥械科，西寧 80000）

三甲胺、二甲胺及氧化三甲胺含量測定方法的研究進(jìn)展

陳錦文1，崔燕芒2，趙 燕1＊（1.第四軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院，西安 710032；2.解放軍第536醫(yī)院藥械科，西寧 810000）

目的 綜述多種檢測二甲胺（DMA）、三甲胺（TMA）、氧化三甲胺（TMAO）含量的方法，并比較其優(yōu)缺點(diǎn)，旨在找到一種靈敏度高、選擇性強(qiáng)、操作簡單的方法。方法 查閱國內(nèi)外關(guān)于胺類化合物檢測方法的基礎(chǔ)性研究文獻(xiàn)，并歸納總結(jié)。結(jié)果與結(jié)論采用衍生化氣質(zhì)聯(lián)用法同時(shí)測定這三者的含量，可一次性批量處理多個(gè)樣品，且靈敏度高、選擇性強(qiáng)。

三甲胺；氧化三甲胺；二甲胺；含量測定

人體中三甲胺的來源一是直接從富含三甲胺（TMA）的食物中獲取，二是由膽堿、左旋肉堿、甜菜堿等生物堿在腸道菌類的作用下轉(zhuǎn)化為TMA。TMA在腸道中被有效吸收，并于肝臟中在三甲胺氧化酶（FMO3）的作用下轉(zhuǎn)化為TMAO，后經(jīng)腎臟代謝隨尿液排出。DMA、TMA及其代謝產(chǎn)物氧化三甲胺（TMAO）微量分布于人體體液中，檢測TMA、DMA、TMAO的含量，可作為臨床診斷遺傳性代謝紊亂疾病的指標(biāo)［1］。更有研究證明，血管內(nèi)過量TMAO將促使人體動(dòng)脈粥樣硬化，并導(dǎo)致患心臟病的風(fēng)險(xiǎn)上升［2］。在腎臟器質(zhì)性病變的患者體液中，TMA和DMA含量明顯上升［3］，且TMA會(huì)使末期腎病患者的神經(jīng)毒性和尿毒癥病情加重［4］。測定體液樣品中這三者的含量，可幫助判斷罹患心血管疾病和腎病的風(fēng)險(xiǎn)，警戒人們預(yù)防疾病的發(fā)生。此外，尿液樣品中TMA、TMAO的含量則為臨床診斷三甲胺尿癥提供有利依據(jù)。因此，選擇高效、簡便的檢測方法有著重大的臨床實(shí)用意義。通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)，本文將現(xiàn)有TMA，DMA和TMAO常用檢測方法列舉如下。

1 分光光度法

由于低級(jí)脂肪胺沒有發(fā)色團(tuán)，無紫外吸收特征，故一般要對(duì)TMA和DMA進(jìn)行衍生化處理。

1.1 苦味酸比色法 用無水甲苯將樣品中的易揮發(fā)堿性物質(zhì)TMA萃取到苯層，TMA與苦味酸反應(yīng)生成黃色的苦味酸三甲胺鹽，該化合物在410nm處有最大吸收波長，用紫外分光光度計(jì)測定萃取溶液在410nm處的吸光度，TMA濃度與吸光度之間線性關(guān)系良好，可用標(biāo)準(zhǔn)曲線法對(duì)TMA進(jìn)行定量分析［5］。對(duì)于TMAO定量分析［6］，可用三氯化鈦（TiCl3）還原成TMA，測得還原所得TMA的量，進(jìn)而換算出樣品中TMAO的含量。

1.2 雷氏鹽比色法 TMAO也可在pH為1時(shí)，置于冰浴中與雷氏鹽反應(yīng)生成紅色沉淀，將沉淀溶于體積分?jǐn)?shù)70%丙酮中，用分光光度計(jì)在最大吸收波長525nm處測得其吸光度值，標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量［7］。

分光光度法測定DMA含量則是由二甲胺與氯化銅及二硫化碳反應(yīng)生成黃棕色二甲氨基二硫代甲酸銅，在430nm處測量溶液的吸光度，比色定量［8］。分光光度法是TMA、DMA、TMAO的經(jīng)典檢測方法，但是雷氏鹽和苦味酸與樣品中其他胺類物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，常使測量結(jié)果偏高。該方法靈敏度低，檢出限較高，效率低且重復(fù)性差，常用于檢測飼料及水產(chǎn)動(dòng)物中TMAO的含量。

2 氣相色譜法

Namies＇nik［9］探索出用固相微萃取技術(shù)對(duì)空氣中的揮發(fā)性低級(jí)脂肪胺進(jìn)行分離、濃集，H2作為載氣，氫火焰離子化檢測器的氣相色譜儀對(duì)各組分進(jìn)行分析，再用標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量的方法。秦輝等［10］采用頂空氣相色譜法測量河蟹中TMA的含量，將蟹肉組織研磨后，取一定量樣品放入頂空瓶中，加入氫氧化鈉，使TMA從組織中游離出來，超聲波處理，40℃下保存30min后，不分流進(jìn)樣，1.5mL·min－1高純度氮?dú)狻?7mL·min－1氫氣、400mL·min－1空氣作為載氣，采用程序升溫的方式使沸點(diǎn)不同的組分在合適的溫度得到分離（初始柱溫40℃，保留3min，升溫速率10℃·min－1，最終溫度180℃，保留4min，用標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量。Kamarei等［11］用溶劑棒液相微萃取技術(shù)（SBME）富集萃取廢水樣品中的脂肪胺類物質(zhì)，氫火焰離子化－氣相色譜法測定其含量。SBME與液液萃取原理相同，但有機(jī)溶劑用量只需幾十微升，是一種非損耗型萃取方法。通過優(yōu)化SBME條件，如：萃取劑的種類、接受相的離子強(qiáng)度、攪拌速率、提取時(shí)間、溫度，可以達(dá)到最佳的提取效率。在壬醇為萃取劑，苯胺作為內(nèi)標(biāo)物，以200g·L－1氯化鈉和0.1mol·L－1氫氧化鈉混合溶液作接受相離子強(qiáng)度調(diào)節(jié)劑，攪拌速率為700r·min－1，溶液溫度為45℃的條件下，萃取廢水中的脂肪胺類物質(zhì)趨近平衡，效率高。萃取完成后，用GC進(jìn)樣針抽取棒內(nèi)溶劑，排除空氣后，取1μL直接進(jìn)GC分析。氣相色譜中常用有機(jī)萃取和頂空進(jìn)樣以此避免繁雜的樣品前處理，但是TMAO不具揮發(fā)性，需要在密閉的試管中還原成TMA，并加強(qiáng)堿使之呈氣態(tài)，再采用頂空進(jìn)樣－氣相色譜法測定含量，但在具體操作時(shí)易造成氣態(tài)TMA的損失。氣相色譜法靈敏度高、分析速度快，適用于痕量分析，但是低級(jí)脂肪胺類極性大，容易吸附在硅烷和硅氧烷等極性固定相上，造成拖尾峰和重影現(xiàn)象，重復(fù)性差。

3 氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用

測定生物樣品中這三者的含量，因其濃度低需采用靈敏度高、高選擇性的分析方法才能確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用分析靈敏度高，適于低分子揮發(fā)性化合物的分析，分離效率高，可用于定量分析復(fù)雜混合物。生物樣品的分析包括樣品的前處理（分離、純化、富集）和對(duì)最終提取物的定量分析。對(duì)TMA、DMA和TMAO進(jìn)行含量測定，在相關(guān)文獻(xiàn)中報(bào)道了以下幾種生物樣品前處理方法。

3.1 衍生化法 衍生化法適用于被測物質(zhì)不易被檢測時(shí)，將其進(jìn)行處理，如加上生色團(tuán)等，使其生成可被檢測的物質(zhì)。孔彬［12］采用6－氨基喹啉－N－羥基琥珀酰亞氨基甲酸酯（AQC）作為柱前衍生化試劑，建立一種衍生化反相高效液相色譜－熒光檢測法同時(shí)檢測人體血液中17種氨基酸。在氣相色譜中應(yīng)用衍生反應(yīng)處理樣品則是為了增加其穩(wěn)定性和提高檢測靈敏度。

由于在室溫下TMA、DMA呈氣態(tài)，樣品儲(chǔ)存過程中易揮發(fā)，且相對(duì)分子質(zhì)量越小的脂肪胺類有機(jī)物越易吸附在極性固定相的表面，形成拖尾峰。DaCosta［13］將內(nèi)標(biāo)物TMA－d6、DMA－d6加入到待測生物樣品中，處理后得到酸化的生物液體。在密閉的試管中進(jìn)行衍生化，DMA與對(duì)甲苯磺酰氯反應(yīng)生成N，N－二甲基對(duì)甲基磺酰胺，2，2，2－三氯乙基氯甲酸酯與TMA衍生化反應(yīng)生成2，2，2－三氯乙基－N，N－二甲基氨基乙酸酯，所得衍生物均具有良好的穩(wěn)定性，并且在氣相分析過程中不會(huì)發(fā)生熱分解。衍生物再用氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)定量分析。而測定生物樣品中的TMAO含量，則是先將其在三氯化鈦（TiCl3）作用下還原為TMA，再將TMA衍生化后進(jìn)樣分析測定。根據(jù)同位素內(nèi)標(biāo)法計(jì)算出樣品中待測組分的含量。Sacher［14］用衍生化－氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)測定了廢水中一級(jí)胺和二級(jí)胺的含量，比較了2，4－二硝基氟苯和苯磺酰氯分別作為胺類衍生試劑對(duì)含量測定的影響，得出使用苯磺酰胺作衍生試劑的方法靈敏度更高、結(jié)果重復(fù)性更好的結(jié)論。衍生化法使樣品中的TMA和DMA形成穩(wěn)定的化合物，減少了樣品儲(chǔ)存過程中TMA和DMA的損失，實(shí)驗(yàn)結(jié)果更為可靠，且具有重復(fù)性好、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)。

3.2 固相微萃取 固相微萃?。⊿PME）是將樣品進(jìn)行前期處理與富集，將探針浸入樣品溶液或頂空氣體中，待平衡后將纖維頭取出插入汽化室，靠流動(dòng)相將其導(dǎo)入色譜柱，完成提取、分離、濃縮的全過程，特別適用于樣品中揮發(fā)性和半揮發(fā)性有機(jī)物的分析［15］。Chan［16］采用頂空固相微萃取－氣質(zhì)聯(lián)用法同時(shí)測定了魚肉組織中TMA、DMA和MA的含量，以此作為評(píng)判魚肉新鮮程度的指標(biāo)。經(jīng)酸化的生物樣品中加入丙胺（NPA）作為內(nèi)標(biāo)物，加入氫氧化鉀將TMA從樣品中游離出來，用復(fù)合型二乙烯基苯－羧基聚二甲硅氧烷固相微萃取纖維頭，從樣品上方的頂空氣體中直接吸附萃取TMA、DMA，然后將纖維頭插入氣質(zhì)聯(lián)用色譜儀中進(jìn)行定量分析，最后用內(nèi)標(biāo)法算出樣品中兩者的含量。對(duì)于樣品中TMAO的測定，需要在酸性條件下用三價(jià)鈦還原成TMA，再按照TMA測定方法測量。此法操作簡便，快速，不需要使用溶劑，與氣相、液相色譜儀聯(lián)用有良好的線性和靈敏度，但SPME需要專門的萃取器，價(jià)格昂貴，且纖維頭使用壽命有限，需要不停地更換，使測量成本變高，且樣品不好保存，萃取后要立刻進(jìn)樣分析，實(shí)驗(yàn)操作繁雜。

3.3 采樣管吸附－熱解吸 Rahman［17］使用采樣管吸附－熱解吸－氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)測定了被污染的環(huán)境樣品中揮發(fā)性脂肪酸類物質(zhì)、吲哚、糞臭素、苯酚、三甲胺的含量。發(fā)現(xiàn)了質(zhì)譜提取離子流色譜模式和總離子流色譜模式對(duì)TMA含量測定結(jié)果不同，是由于TMA與采集管填充的吸附劑某些組分發(fā)生共溶析，所以最終選擇了質(zhì)譜檢測器的提取離子流色譜模式檢測TMA的含量。

4 離子色譜法

離子色譜法中，流動(dòng)相攜帶TMA、DMA、TMAO進(jìn)入分離柱時(shí)，因各陽離子對(duì)樹脂親和能力不同而分離，進(jìn)入電導(dǎo)池檢測后，得到色譜峰，再按照色譜定性定量方法進(jìn)行待測組分的分析。樣品進(jìn)行離心處理后，取上層清液，用超純水按一定比例稀釋定容，直接進(jìn)樣測量。李豐［18］采用了非抑制型離子色譜法同時(shí)測定水產(chǎn)品中TMA、DMA、TMAO的含量，以3mmol·L－1甲磺酸作為流動(dòng)相，流速為0.8mL·min－1，柱溫30℃，電導(dǎo)池溫度為35℃，得到了峰形好、分離度高的色譜峰。孫永［19］建立了一種同時(shí)測定水產(chǎn)品中TMAO及其分解產(chǎn)物TMA、DMA的非抑制性離子色譜法，4mmol·L－1硝酸＋體積分?jǐn)?shù)為3%的乙腈混合溶液為淋洗液，流速為0.9mL·min－1，在此條件下，可在10min內(nèi)完成待測組分的分析，縮短了分析時(shí)間，提高了分析效率。但由于生物樣品中包含一些常見陽離子，如Ca2＋、Na＋、K＋、Mg2＋，考慮到這些離子會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)造成較大干擾，離子交換色譜法并不是測量生物樣品中胺類物質(zhì)的最佳方案。

5 液相色譜法

液相色譜法是測定水中低級(jí)脂肪胺類含量的經(jīng)典測量方法，由于該類化合物極性大、溶于水、具有揮發(fā)性，且對(duì)液相色譜檢測器的響應(yīng)值較高，無發(fā)色團(tuán)，無熒光特性和紫外吸收特征，故往往要先將其衍生化以便達(dá)到易于分離、檢測的目的。Campins－Falco等［20］將尿液中的β－苯乙胺萃取到C18固相微萃取柱上，與氯甲酸－9－芴甲酯（FMOC）衍生化，取100μL樣品到液相色譜儀中分析含量。特別指出，在衍生化前，用pH為10的1g·L－1碳酸鹽緩沖液沖洗萃取柱來消除尿液樣品基質(zhì)的干擾，使色譜分離效果更好。實(shí)驗(yàn)還測得丙胺、二甲胺與FMOC衍生化產(chǎn)率分別為101%和85%。也已有文獻(xiàn)詳細(xì)探討了FMOC與胺類物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，得到轉(zhuǎn)化率高的衍生產(chǎn)物所需要的實(shí)驗(yàn)條件［21］。Herr＇aez［22］比較了3種固相微萃取技術(shù)和衍生化反應(yīng)過程，F(xiàn)MOC作為衍生化試劑，采用液相色譜儀對(duì)水中的MA、DMA、TMA定量分析。結(jié)果顯示，如果樣品中的胺類先與FMOC反應(yīng)再對(duì)衍生產(chǎn)物進(jìn)行萃取，測量TMA的靈敏度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于一級(jí)胺、二級(jí)胺，而用涂布FMOC的纖維頭對(duì)水中DMA、TMA同時(shí)進(jìn)行衍生化和萃取，該方法效果良好，檢出限為5ng·mL－1，但其局限性在于纖維頭上涂層面積有限，被分析物吸附率低。Campins－Falco［23］用毛細(xì)管內(nèi)微萃?。╥n－tube SPME）作為水樣品的預(yù)處理辦法，在管內(nèi)壁上涂布體積分?jǐn)?shù)為95%羧基聚二甲硅氧烷和體積分?jǐn)?shù)為5%聚二苯基硅氧烷混合溶液作為固定相，F(xiàn)MOC作為衍生試劑涂布在固定相上，樣品流經(jīng)管內(nèi)時(shí)，胺類物質(zhì)被萃取吸附在固定相上，并與FMOC反應(yīng)，形成衍生物在吸附柱中得以洗脫，通過開關(guān)裝置轉(zhuǎn)換吸附柱和分析柱，在分析柱中以乙腈作為流動(dòng)相，實(shí)現(xiàn)對(duì)水樣品中低級(jí)脂肪胺類物質(zhì)在線聯(lián)用分析。

6 毛細(xì)管電泳法

Dabek－Zlotorzynska［24］采用柱前衍生化法使DMA與異硫氰酸熒光素酯（FITC）反應(yīng)，激光誘導(dǎo)熒光檢測器的毛細(xì)管電泳儀分離、測定DMA和其他低相對(duì)分子質(zhì)量的胺類化合物，并探討確定了在最佳的衍生化反應(yīng)條件下得到的相對(duì)熒光強(qiáng)度為100%的DMA－FITC衍生物。在20mmol·L－1硼酸鹽＋體積分?jǐn)?shù)為20%的丙酮溶液、5mmol·L－1的二甲基－β－環(huán)糊精（DM－β－CD）為緩沖溶液，工作電壓為25kV的條件下，分離效果最佳。此方法測定DMA的含量檢出限為10－9mol·L－1，低于氣相色譜法和高效液相色譜法，靈敏度高，可用來監(jiān)測大氣氣溶膠或其他環(huán)境樣品中DMA及其他低相對(duì)分子質(zhì)量的胺類化合物的含量，但重復(fù)性較差。Timm［25］用毛細(xì)管電泳儀間接紫外檢測法同時(shí)測定了魚肉中TMA、DMA、TMAO的含量。4mmol·L－1甲酸、5mmol·L－1硫酸銅、3mmol·L－1冠醚、18－冠醚－6作為緩沖液，壓力進(jìn)樣，可在5～10min內(nèi)完成整個(gè)分析過程，檢出限為0.04mmol·L－1。此法樣品提取過程簡單，不需要衍生化處理，分析速度快，但由于毛細(xì)管直徑小，光路短，使用紫外檢測器時(shí)，靈敏度較低，且影響電滲的因素多，進(jìn)而影響重復(fù)性。

7 質(zhì)譜法

質(zhì)譜法是指將物質(zhì)粒子轉(zhuǎn)化為帶正電的離子，并通過適當(dāng)?shù)碾妶?、磁場將其按照質(zhì)荷比大小依次排列成圖譜記錄下來。快原子轟擊質(zhì)譜以高速Ar原子轟擊樣品分子使之離子化，避免了對(duì)有機(jī)化合物的加熱，適用于熱不穩(wěn)定的、難氣化的、極性大的有機(jī)化合物分析。Mamer［26］用快原子轟擊質(zhì)譜和穩(wěn)定同位素稀釋法分別測定了尿液樣品中TMA、TMAO含量，在已酸化的樣品中加入內(nèi)標(biāo)15N－TMA·HCl，經(jīng)乙醚提取，在冰水溫度下加入氫氧化鈉，再經(jīng)乙醚萃取后，取20μL萃取物與氘代碘甲烷CD3I反應(yīng)形成［15N（CH3）3C2H3］＋、［14N（CH3）3C2H3］＋，蒸發(fā)除去乙醚，加入30μL蒸餾水溶解殘余物，取10μL進(jìn)樣，六乙二醇作為基質(zhì)以減少雜質(zhì)峰的干擾，用質(zhì)譜法檢測到碎片離子峰m／z77和78。在正常尿液樣品中加入不同質(zhì)量的14N－TMA對(duì)照品，檢測到2種離子峰，以加入的14N－TMA的量為橫坐標(biāo)、離子峰強(qiáng)度之比為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，所得曲線線性關(guān)系良好。測量TMAO的方法則是先將15N－TMA·HCl溶解于蒸餾水中，經(jīng)雙氧水氧化形成15N－TMAO鹽酸溶液。將2μL15N－TMAO加入到100μL尿樣中，取10μL進(jìn)樣，六乙二醇作為基質(zhì)，質(zhì)譜儀檢測到［15N（CH3）3OH］＋、［14N（CH3）3OH］＋，分別對(duì)應(yīng)離子峰m／z76和77。用該法繪得標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好。同位素稀釋法不需要定量嚴(yán)格地分離出被測化合物，避免了對(duì)復(fù)雜混合物的純化，在酸化的尿液樣品中加入已知量的15N－TMA作為內(nèi)標(biāo)物，可消除基質(zhì)效應(yīng)造成的誤差。此法以15N－TMAO為內(nèi)標(biāo)物，直接對(duì)尿液樣品中的TMAO定量分析，避免了將TMAO還原為TMA時(shí)轉(zhuǎn)化不完全造成的誤差。

8 結(jié)語

三甲胺具有魚腥臭味，是判定海產(chǎn)品新鮮程度的標(biāo)準(zhǔn)之一。三甲胺還與人類健康密不可分，三甲胺在酶作用下形成次級(jí)代謝產(chǎn)物氧化三甲胺，若在血管中積聚得過多易導(dǎo)致心血管疾病的發(fā)生。而患有腎臟疾病的患者體液中，二甲胺、三甲胺含量均明顯上升。此外，測定尿液中的氧化三甲胺與三甲胺含量之比，已成為判斷代謝紊亂疾病三甲胺尿癥的臨床指標(biāo)。對(duì)于胺類化合物的含量測定一直是研究的熱點(diǎn)，現(xiàn)有文獻(xiàn)大多報(bào)道的是采用海產(chǎn)品、環(huán)境樣品為基質(zhì)的測定方法，而生物樣品本身有別于其他樣品，因此，無論在樣品預(yù)處理還是在儀器的選用上，都需要深入研究。因此探討出一種檢測生物樣品中三甲胺及其代謝產(chǎn)物的簡單、高效的方法是很有必要的。現(xiàn)有的方法中，氣質(zhì)聯(lián)用法和毛細(xì)管電泳法對(duì)于三甲胺的檢測限低，分別在10－8～10－9mol·L－1之間，但由于毛細(xì)管電泳法的重復(fù)性差，不建議使用該法。采用氣質(zhì)聯(lián)用－衍生化法可一次性將多個(gè)樣品中的胺類物質(zhì)衍生化，形成穩(wěn)定的衍生物易于保存，而固相萃取技術(shù)不能同時(shí)進(jìn)行多個(gè)樣品的萃取保存。因此，可以采用氣質(zhì)聯(lián)用－衍生化法，選擇合適的衍生試劑和內(nèi)標(biāo)物，并根據(jù)胺類化合物的化學(xué)性質(zhì)，調(diào)整色譜條件對(duì)生物樣品中的三甲胺、二甲胺、氧化三甲胺進(jìn)行定量分析。

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Research progress of content determination methods of trimethylamine，dimethylamine and trimethylamine－N－oxide

CHEN Jinwen1，CUI Yanmang2，ZHAO Yan1＊（1.School of Pharmacy，the Forth Military Medical University，Xi′an 710032，China；2.Devision of Drug and Device，People′s Liberation Army 536Hospital，Xining 810000，China）

Objective To review the methods for determining the contents of dimethylamine，trimethylamine and trimethylamine－N－oxide，also compare their advantages and disadvantages，then to find a method that has the characteristics of high sensitivity，strong selectivity，and operational simplicity.Methods The methods of detection of amines were summarized through reading the research literatures of domestic and abroad.Result and Conclusion Gas chromatography－mass spectrometry after derivatization can simultaneously measure the three amines，which could process samples in batches with high sensitivity and strong selectivity.

trimethylamine；trimethylamine－N－oxide；dimethylamine；content determination

10.3969／j.issn.1004－2407.2015.02.036

R917

A

1004－2407（2015）02－0216－04

2014－09－10）

陳錦文，女，在讀碩士研究生

＊通信作者：趙燕，女，副教授，碩士生導(dǎo)師