醫(yī)療器械細胞毒性試驗方法標準化探討

賀學英，王 蕊，王會如

(北京市醫(yī)療器械檢驗所，北京101111)

醫(yī)療器械細胞毒性試驗方法標準化探討

賀學英，王 蕊，王會如

(北京市醫(yī)療器械檢驗所，北京101111)

細胞毒性是醫(yī)療器械生物相容性評價的重要項目之一。四唑鹽MTT法是經(jīng)典定量細胞毒性試驗方法，該實驗研究了細胞濃度、培養(yǎng)時間對試驗結(jié)果的影響。結(jié)果表明應(yīng)用不同試驗條件的MTT法對同一待檢物會得到不同的細胞毒性結(jié)果，因此標準化MTT試驗方法對醫(yī)療器械細胞毒性試驗評價非常重要。

MTT法細胞毒性試驗;細胞生長曲線;L929細胞系

0 前言

細胞毒性是醫(yī)療器械生物相容性評價的重要項目之一。GB/T16886.5－2005《醫(yī)療器械生物學評價—體外細胞毒性試驗(ISO 10993.5:1999，IDT)》中給出了浸提液法、直接接觸法、濾膜擴散法等方法的原則，并簡要介紹了細胞毒性可定性或定量評價，但該標準并未給出各方法的標準操作程序(SOP)。MTT法是一種經(jīng)典的定量細胞毒性試驗方法，GB/T14233.2－2005給出了該方法的SOP，目前國內(nèi)廣泛采用這一方法對醫(yī)療器械進行細胞毒性評價。我國尚未轉(zhuǎn)化的ISO10993－5:2009(以下稱2009版國際標準)較1999年版本發(fā)生了較大變化，新版標準具體化了細胞毒性試驗方法，在附錄c中詳細給出了MTT法細胞毒性試驗的SOP，該SOP與GB/T14233.2－2005給出方法有較大不同。不同的MTT試驗方法對同一待檢物會是否能得出一致的結(jié)果是本研究要解決的問題，這關(guān)系到能否對待檢物做出客觀科學的評價。

1 材料與方法

(1)L929細胞系(ATCC)，MEM細胞培養(yǎng)基，3－(4，5－二甲基噻唑－2) －2，5－二苯基四氮唑溴鹽(簡稱MTT)。

(2)取100μL濃度為1×104/mL，1.5×104/mL，2× 104/mL，5×104/mL，8×104/mL，1×105/mL，2×105/mL的L929細胞分別接種于96微孔板中，相當于每孔分別接種細胞數(shù)約1×103，1.5×103，2×103，5×103，8×103，1×104，2×104，培養(yǎng)4 h～120 h，每24 h以MTT摻入的方式監(jiān)測細胞增殖情況并繪制生長曲線。

(3)同一被檢物分別應(yīng)用 GB/T14233.2－2005及ISO10993－5:2009給出的MTT試驗方法檢測其細胞毒性。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同起始細胞密度L929細胞生長曲線測定

當接種濃度較低為1×104/mL，1.5×104/mL，2×104/mL時，L929細胞在72 h之前都處于增殖緩慢狀態(tài);在8× 104/mL，1×105/mL兩個個濃度下，細胞在生長24 h后進入對數(shù)生長期，并在72～96 h進入平臺期;2×105/mL濃度組細胞貼壁后即進入對數(shù)生長期，48 h起即進入平臺期。如表1，不同起始接種濃度L929細胞隨培養(yǎng)時間生長增殖情況，以酶標儀570nm與630nm測定吸光度差值表示;圖1直觀顯示了細胞生長曲線。

表1 不同接種密度L929細胞增殖情況

細胞生長進入對數(shù)生長期之前，對生長環(huán)境的變化反應(yīng)較敏感，因此為排除細胞本身生長帶來的干擾，細胞毒性試驗應(yīng)選擇處于對數(shù)生長期階段給予刺激物，以真實反應(yīng)待檢物對細胞生長的抑制程度，這一點在2009版國際標準中特別進行了強調(diào)。

2.2 同一被檢物細胞毒性試驗

選取一高分子材料分別應(yīng)用 GB/T14233.2－2005及ISO10993－5:2009給出的MTT試驗方法檢測其細胞毒性，結(jié)果如下:

(1)GB/T 14233.2－2005中8.5.6 a)方法:L929初始接種濃度為1×104/mL，生長24 h后加入待檢物浸提液，培養(yǎng)72 h，細胞相對增殖率為15.9%，可判為有毒性。

圖1 L929細胞在不同起始密度生長曲線

(2)ISO 10993－5:2009附錄c方法:L929初始接種濃度為1×105/mL，生長24 h后加入待檢物浸提液，培養(yǎng)24 h，細胞相對增殖率為94.3%，可判為無毒性。

同一待檢物以不同MTT試驗方法得到完全不同的細胞毒性結(jié)果，對需做出依據(jù)試驗結(jié)果做出合格判斷的機構(gòu)來說會帶來很大困惑。

從圖1生長曲線可以看出GB/T 14233.2－2005方法要求接種細胞的初始濃度較小，細胞在生長24 h后還未進入對數(shù)生長期，對任何因素的變化都會有較敏感的反應(yīng)，可能會放大待檢物微小的細胞抑制作用;而在ISO 10993－5: 2009方法中，細胞初始接種量是GB/T 14233.2－2005的10倍，24 h后細胞已進入對數(shù)生長期，可較客觀地反應(yīng)待檢物對細胞生長的影響。

根據(jù)細胞生長曲線，還有一個需要特別注意的問題:“加入待檢物后，細胞還應(yīng)培養(yǎng)多久?是不是越久越能反應(yīng)出待檢物的毒性?”

2009版國際標準規(guī)定:在待檢物作用24 h后細胞讀取結(jié)果，這時候?qū)φ战M細胞仍應(yīng)處于對數(shù)生長期，實驗組與處于對數(shù)生長期的對照組相比較得到其真實增殖率;如果待檢物加入后培養(yǎng)48 h或更長時間，從圖1可以看到，這時候?qū)φ战M已開始進入平臺期，進入平臺期后細胞的增殖會受到抑制并開始凋亡，而當待檢物對細胞只有抑制作用而非殺傷作用時，實驗組細胞生長達到平臺期的時間會延后，經(jīng)過較長時間的培養(yǎng)后，實驗組細胞的增殖程度可能反而會趕上或超過對照組，當計算相對增殖率時會得到假陰性結(jié)果，也就是說有時延長培養(yǎng)時間反而不能反映出待檢物的細胞毒性。

綜上，MTT試驗的標準操作規(guī)程(SOP)需明確規(guī)定合理的細胞初始接種量及待檢物加入后的培養(yǎng)時間，不能在SOP中出現(xiàn)彈性的要求，如“加入待檢物后培養(yǎng)時間不小于24 h”，或“培養(yǎng)24～72 h”;當細胞相對增殖率超過100%時，要特別密切關(guān)注試驗的原始吸光值，分析結(jié)果是否合理;如應(yīng)用編好的程序直接讀取細胞相對增殖率，不記錄原始吸光值度，則會產(chǎn)生較大風險。

3 結(jié)論

應(yīng)依據(jù)所應(yīng)用細胞系生長特性，選擇MTT法細胞毒性試驗條件，并應(yīng)標準化，隨意改變試驗條件會得到不同的試驗結(jié)果，不利于對醫(yī)療器械細胞毒性進行客觀、科學的評價。

［1］GB/T 14233.2－2005醫(yī)用輸血、輸液、注射器具檢驗方 第2部分:生物學試驗方法［S］.

［2］ISO10993－5:2009 Biological evaluation of medical devices—Part 5:Tests for in vitro cytotoxicity［S］.

R197.39

A

1002－2376(2015)07－0009－02

2015－05－04