雙輔料炮制對鹽附子傳統(tǒng)性狀和酯型生物堿的影響

國 偉， 譚 鵬， 吳月嬌， 秦語欣， 趙玲玲， 李 飛

（北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京100102）

雙輔料炮制對鹽附子傳統(tǒng)性狀和酯型生物堿的影響

國 偉， 譚 鵬， 吳月嬌， 秦語欣， 趙玲玲， 李 飛*

（北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京100102）

目的研究甘草、黑豆炮制對鹽附子外觀性狀和化學(xué)成分的影響。方法按 《中國藥典》中方法制備淡附片、甘草制及黑豆制對照飲片，采用HPLC法測定3種雙酯型生物堿總量和3種單酯型生物堿總量，采用HPLC-MS分析成分組成。結(jié)果與鹽附子比較，淡附片、甘草和黑豆制兩種對照飲片中所含3種雙酯型生物堿總量均降低97%以上，淡附片中3種單酯型生物堿總量增加1.26倍，兩種對照飲片均增加60%左右。由于加入輔料炮制，淡附片中帶入了甘草成分甘草苷和芒柄花苷。結(jié)論甘草和黑豆共制淡附片中的有效成分單酯型生物堿量明顯高于甘草及黑豆分制的對照飲片。

附子；淡附片；甘草；黑豆；烏頭堿

附子為毛茛科植物烏頭Aconitum carmichaelii Debx.的子根加工品， 《中國藥典》2010年版（以下簡稱 “藥典”）收載的淡附片是漂盡鹽分的鹽附子與甘草、黑豆煮制而得［1］。歷代均曾有醫(yī)家將甘草和黑豆應(yīng)用于附子炮制， 《景岳全書》［2］記載 “……用甘草者，蓋以附子之性急，得甘草而后緩；附子之性毒，得甘草而后解；附子之性走，得甘草而后益心脾；附子之性散，得甘草而后調(diào)營衛(wèi)……”。甘草具有解毒、調(diào)和諸藥之功，黑豆具有益精、解毒之功?，F(xiàn)代藥理研究表明，甘草可通過提高附子的中毒劑量、促進(jìn)藥物代謝、降低各腸段對附子成分的吸收、保護(hù)心肌細(xì)胞、降低附子的毒性，并保持附子原有的抗心衰的作用［3-9］。目前，尚未見甘草、黑豆炮制對鹽附子的外觀性狀和酯型生物堿影響的研究報道，本研究按照藥典附子項下淡附片炮制方法制備了淡附片及甘草、黑豆單一輔料制的對照飲片，采用HPLC法檢測3種雙酯型生物堿和3種單酯型生物堿總量，采用HPLCMS分析成分組成，分析甘草、黑豆炮制對附子外觀性狀及物質(zhì)基礎(chǔ)的影響，為研究甘草、黑豆炮制附子科學(xué)內(nèi)涵提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1100高效液相色譜儀（1100色譜泵，DAD檢測器，自動進(jìn)樣器，在線脫氣，LC/MSP Trap XCT Plus）；超聲波清洗器（SB25-12DTDN型寧波新芝生物科技股份有限公司）；循環(huán)多用真空泵 （SHB-3型，鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 （RE-52型，上海振捷實驗設(shè)備有限公司）；手持折光鹽度計 （上海天壘儀器儀表有限公司）。

1.2 試藥 烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿對照品供含量測定用，購自中國食品藥品檢定研究院 （批號分別為：110720-201111、110798-201106、110799-201106、111794-201102、111795-201002、111796-201002）。乙腈、四氫呋喃為色譜純 （德國Merck公司）；水為純凈水；其他試劑均為分析純。鹽附子購自四川江油中壩附子科技發(fā)展有限公司，經(jīng)中國食品藥品檢定研究院中藥所張繼主任藥師鑒定為毛茛科植物烏頭Aconitum carmichaelii Debx.的子根的加工品。甘草為豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch的干燥根和根莖，黑豆為豆科植物大豆Glycinemax（L.）Merr.的干燥成熟種子，均購自北京同仁堂藥店。

2 方法與結(jié)果

2.1 炮制品的制備 按照藥典附子項下淡附片炮制方法制備淡附片，取鹽附子，用清水浸漂，每日換水2～3次，至鹽分漂盡，與甘草、黑豆加水共煮透心，至切開后口嘗無麻舌感時，取出，除去甘草，黑豆，切薄片，曬干。

按照上述方法，分別制備單一輔料甘草制對照飲片和黑豆制對照飲片。

以上炮制品分別粉碎，過三號篩，備用，各炮制品重復(fù)制備1次。

2.2 炮制品外觀性狀的觀察 淡附片外皮褐色，切面褐色，半透明，有縱向?qū)Ч苁|(zhì)硬，斷面角質(zhì)樣，味淡，口嘗無麻舌感，符合 《中國藥典》2010年版對淡附片外觀性狀的要求。甘草制對照飲片、黑豆制對照飲片的外觀性狀與淡附片基本一致。

2.3 6種生物堿的測定

2.3.1 供試品溶液的制備 取鹽附子粉末約2 g，精密稱定，加入異丙醇-乙酸乙酯 （1∶1）混合溶液50mL、氨試液3mL，精密稱定質(zhì)量，超聲處理（功率300W，頻率40 kHz，水溫在25℃以下）30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用異丙醇-乙酸乙酯（1∶1）混合溶液補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液25mL。40℃以下減壓回收溶劑至干，殘渣精密加入異丙醇-三氯甲烷 （1∶1）混合溶液3 mL溶解，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3.2 對照品溶液的制備 精密稱取適量3種雙酯型生物堿和3種單酯型生物堿對照品于10 mL量瓶中，加入異丙醇-三氯甲烷 （1∶1）混合溶液，定容，配制成含烏頭堿161μg/mL、次烏頭堿362 μg/mL、新烏頭堿335μg/mL、苯甲酰烏頭原堿81 μg/mL、苯甲酰次烏頭原堿79μg/mL、苯甲酰新烏頭原堿188μg/mL的溶液，備用。

2.3.3 色譜條件 Agilent Extend C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm），流動相A為0.1 mol/L醋酸銨溶液 （每1 000 mL加冰醋酸0.5 mL），流動相B為乙腈-四氫呋喃 （25∶15），梯度洗脫 （0～13 min，5%～15%B；13～54 min，15%～24%B；54～55 min，24%～35%B），檢測波長為235 nm，柱溫為22℃，體積流量為1 mL/min，進(jìn)樣量為10μL。

2.3.4 線性關(guān)系考察 取 “2.3.2”項下所配對照品溶液并分別精密移取2、1、0.5、0.2、0.1、0.05 mL于10 mL量瓶中，加入異丙醇-三氯甲烷（1∶1）混合溶液，定容，備用。取各質(zhì)量濃度混合對照品溶液按照 “2.3.3”項下色譜條件測定，記錄色譜峰峰面積。以各成分進(jìn)樣質(zhì)量濃度x（μg/mL）為橫坐標(biāo)，峰面積y為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，經(jīng)計算得各成分回歸方程，6種成分在一定范圍內(nèi)，線性良好，結(jié)果見表1。

表1 各成分線性關(guān)系考察Tab.1 Linear relationship of constituents

2.3.5 精密度 吸取同一混合對照品溶液，按“2.3.3”項下色譜條件測定，連續(xù)進(jìn)樣6次，測得烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿峰面積，計算各成分峰面積的 RSD，結(jié)果分別為1.3%、1.1%、0.38%、1.4%、1.2%、0.60%，表明本法具有良好的精密度。

2.3.6 穩(wěn)定性 取同一供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、20、24 h進(jìn)針，記錄烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿的峰面積計算各成分峰面積的RSD，結(jié)果分別為1.0%、1.2%、0.97%、0.14%、1.5%、1.9%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.7 重復(fù)性 取同一批次鹽附子粉末6份，按照 “2.3.1”項下方法分別制備供試品溶液，分別進(jìn)樣10μL，按照 “2.3.3”項下色譜條件測定6種成分的峰面積，測得供試品溶液中烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿的質(zhì)量濃度分別為39.1、249、210、7.13、9.33、38.0μg/g。計算各成分含有量的 RSD，結(jié)果分別為 1.8%、2.5%、1.8%、2.1%、2.8%、2.0%，表明供試品溶液的制備方法重復(fù)性良好。

2.3.8 加樣回收率 取已知含有量鹽附子粉末6份，每份1 g，精密稱定，分別加入含烏頭堿161 μg/mL、次烏頭堿362μg/mL、新烏頭堿335 μg/mL的溶液0.5 mL，按照“2.3.1”項下制備供試品溶液，按照 “2.3.3”項下色譜條件依次測定，計算烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿平均回收率，結(jié)果分別為101%、101%、99.1%，RSD分別為2.7%、2.0%、2.7%。取已知含有量鹽附子粉末6份，每份1 g，精密稱定，分別加入含苯甲酰烏頭原堿16.2μg/mL、苯甲酰次烏頭原堿15.8 μg/mL、苯甲酰新烏頭原堿37.6μg/mL的溶液1 mL，按照 “2.3.1”項下制備供試品溶液，按照“2.3.3”項下色譜條件依次測定，計算苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿平均回收率，結(jié)果分別為 102%、100%、100%，RSD分別為2.6%、2.9%、1.7%。

2.3.9 樣品測定 分別取 “2.1”項下各樣品粉末，按照“2.3.1”項下方法制備供試品溶液，按照 “2.3.3”項下色譜條件進(jìn)行檢測，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算各成分，各炮制品色譜圖見圖1，測定結(jié)果見表2。

取稀釋5倍的 “2.3.2”項下對照品溶液，按照 “2.3.3”項下色譜條件進(jìn)行檢測，色譜圖見圖1A，供樣品中各成分定性指認(rèn)。

分別精密吸取5.87 mg/mL苯甲酸溶液、異丙醇各10μL，按照 “2.3.3”項下色譜條件進(jìn)行檢測，結(jié)果表明圖1中峰1為苯甲酸的色譜峰，峰2為溶劑中異丙醇的色譜峰。

圖1 對照品 （A）、淡附片 （B）、甘草制對照飲片 （C）和黑豆制對照飲片（D）HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram s of reference substance（A），Danfupian（B）and two single auxiliary material prepared products（C、D）

采用Spss 16.0軟件對炮制后的淡附片、甘草制對照飲片和黑豆制對照飲片中的雙酯型生物堿總量和單酯型生物堿總量分別做方差分析，兩類成分的分析結(jié)果均為：淡附片與甘草制對照飲片、黑豆制對照飲片兩兩比較均P＜0.05，具有顯著性差異，甘草和黑豆2種對照飲片之間P＞0.05，無顯著性差異。

2.4 高效液相圖譜中未知成分峰的MS檢測

表2 各炮制品中雙酯型生物堿總量、單酯型生物堿總量 （%，n=2）Tab.2 Contents of diester alkaloid and monoester alkaloid in p repared products（%，n=2）

2.4.1 質(zhì)譜條件 Agilent Extend C18色譜柱（4.6 mm×250mm，5μm）；5mmol/L醋酸銨溶液（每1 000 mL加冰醋酸60μL） （A）-乙腈（B），梯度洗脫，檢測波長為235 nm，柱溫為22℃，體積流量為1 m L/min，進(jìn)樣量為10μL，正電離電壓為3 000 V，負(fù)電離電壓為4 000 V，干燥器體積流量為11.0 L/min，干燥器溫度為350℃，分別采用正、負(fù)離子模式進(jìn)行檢測。

2.4.2 MS檢測 淡附片和甘草制淡附片的HPLC色譜圖中，在25～26 min之間出現(xiàn)了一個新的峰（圖1峰9），說明加入輔料炮制后，使淡附片的物質(zhì)組成發(fā)生變化，按照 “2.3.1”項方法制備供試品溶液，按 “2.4.1”項下質(zhì)譜方法進(jìn)一步對該峰進(jìn)行定性鑒別研究，檢測結(jié)果見圖2、3，在該條件下檢測，質(zhì)譜信息表明該峰為兩個成分的混合峰。

圖2 未知成分（一）的MS定性鑒別Fig.2 Identification of unknown com ponents I by MS

圖3 未知成分（二）MS定性鑒別Fig.2 Identification of unknown components IIby MS

未知成分 （一）正離子檢測模式：419［M+ H］+、257［M-Glu+H］+、457［M+K］+、238［M-Glu+H-H2O］+。負(fù)離子檢測模式：417［MH］-、254［M-Glu］-。結(jié)合質(zhì)譜所得碎片分子質(zhì)量和信息推測未知成分中含有甘草苷［10］。

未知成分 （二）正離子模式：489［M+ CH3COO］-、266［M-CH3COO-Glu］-、251［MCH3COO–Glu-CH3］-。負(fù)離子檢測模式：431［M-H］-、268［M-Glu］-。結(jié)合質(zhì)譜所得碎片分子質(zhì)量和信息推測未知成分中含有芒柄花苷［11］。

3 小結(jié)與討論

烏頭類藥材的減毒原理為烏頭堿等雙酯型生物堿脫去乙酸，生成苯甲酰烏頭原堿等單酯型生物堿，單酯型生物堿可繼續(xù)水解脫去苯甲酸，生成烏頭原堿等氨基醇型烏頭原堿，上述各步驟水解反應(yīng)的物質(zhì)的量的比均為1∶1。現(xiàn)代藥理研究表明，氨基醇型生物堿在強心、抗炎方面具有生理活性［12-14］，有必要對其進(jìn)行定量測定，但是，這類生物堿無共軛結(jié)構(gòu)，不具有紫外吸收，而另外的二級水解產(chǎn)物苯甲酸則可以通過紫外-可見檢測器檢測并定量。目前，已有研究將苯甲酸用于間接測定氨基醇型生物堿的含量［15］。因此，本研究對苯甲酸進(jìn)行了定性檢測，為表示雙酯型生物堿的二級水解情況提供依據(jù)。

淡附片的外觀性狀符合藥典的規(guī)定，甘草、黑豆單一炮制的對照飲片的外觀性狀與淡附片基本一致。本研究的炮制對象為鹽附子，鹽附子經(jīng)產(chǎn)地加工后，斷面顏色由白色變?yōu)榛液稚?，煮制后，顏色加深至褐色，而輔料煮后的液體顏色為黃色，不會導(dǎo)致炮制品顏色發(fā)生明顯變化；附子富含淀粉，煮制過程中，淀粉糊化，干燥后，質(zhì)地變?yōu)榻琴|(zhì)樣、質(zhì)硬，上述炮制品均按藥典要求煮制透心，因此，三者質(zhì)地均為角質(zhì)；此外，煮制透心與否可直接影響炮制品的麻舌感，煮制透心后，飲片無麻舌感。因此，雙輔料或者單一輔料炮制后的外觀性狀沒有顯著差異。

淡附片中的毒性成分雙酯型生物堿較炮制前的鹽附子降低了約97%；單酯型生物堿較鹽附子增加了約1.26倍，而甘草制對照飲片及黑豆制對照飲片的雙酯型生物堿均降低了約98%，單酯型生物堿均增加了約0.6倍，由甘草黑豆兩種輔料共同炮制的淡附片所含的單酯型生物堿的總量明顯高于甘草或黑豆單一輔料炮制品。

在淡附片中檢測到的未知峰9，與甘草制對照飲片的峰9保留時間基本一致，經(jīng)HPLC-MS法初步證實該峰可能是加入甘草炮制帶入的甘草苷、芒柄花苷等成分，表明加輔料炮制會影響附子的物質(zhì)組成。

雙輔料炮制或者甘草、黑豆單一輔料炮制對外觀性狀沒有明顯的影響，以外觀性狀為指標(biāo)無法分析雙或單一輔料炮制品之間的差異。甘草、黑豆共同制備淡附片提高單酯型生物堿的總量，增強藥效；同時，帶入輔料成分，可能會影響附子的藥效，但其加輔料炮制機理尚待深入研究。

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Effect of adjuvants on trait and the ester alkaloid from salt-Fuzi

GUOWei， TAN Peng， WU Yue-jiao， QIN Yu-xin， ZHAO Ling-ling， LIFei*
（Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100102，China）

AIMTo study the effect of Gancao（Glycyrrhizae Radix et Rhizoma）and Heidou（Sojae Semen nigrum）on traitand their ester alkaloids of salt-Fuzi（Aconiti lateralis Radix praeparata）.METHODSDanfupian（saltfree-Fuzi）and Fuziprocessed with Gancao and with Heidou were prepared consistentwith China Pharmacopeia.Three diester alkaloids and threemonoester alkaloids from processed Fuziwere determined by HPLC，and HPLC-MSwas used for the component analysis.RESULTSAs compared with salt-Fuzi，diester alkaloids contents from three processed Fuzi decreased about 97%.Three monoester alkaloids from Danfupian increased about 1.26 time，of Fuziprocessed with Gancao and with Heidou only rose about60%.Adding adjuvantsmade Danfupian contain liquiritin and ononin contentswhich originated from Gancao.CONCLUSIONMonoesteralkaloids content from Danfupian processed by Gancao and Heidou is higher than that processed separately.

Fuzi（Aconiti lateralis Radix praeparata）；Danfupian；Gancao（Glycyrrhizae Radix et Rhizoma）；Heidou（Sojae Semen nigrum）；aconitine

R283.1

：A

：1001-1528（2015）06-1289-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.06.028

2014-11-27

中醫(yī)藥行業(yè)科研專項項目 （201107008）；國家自然科學(xué)基金課題 （81102807）；國家973計劃中醫(yī)基礎(chǔ)理論專項（2009CB522800；2009CB522805）

國 偉（1990—）女，碩士生，研究方向為中藥炮制。Tel：15810627628，E-mail：guoweizaizai@163.com

*通信作者：李 飛（1963—），教授，研究方向為中藥炮制。Tel：13601291660，E-mail：lf668@sina.com