HPLC法同時測定荷葉中金絲桃苷、異槲皮苷和槲皮素

朱瀅澗， 王新財(cái)

（1.湖州市中醫(yī)院，浙江湖州 313000；2.湖州市食品藥品檢驗(yàn)研究院，浙江湖州313000）

HPLC法同時測定荷葉中金絲桃苷、異槲皮苷和槲皮素

朱瀅澗1， 王新財(cái)2

（1.湖州市中醫(yī)院，浙江湖州 313000；2.湖州市食品藥品檢驗(yàn)研究院，浙江湖州313000）

目的建立HPLC法同時測定荷葉中金絲桃苷、異槲皮苷和槲皮素。方法荷葉甲醇提取液采用Agilent Eclipse XDB C18柱 （250 mm×4.6 mm，5μm）分析；流動相為磷酸鹽緩沖液 （pH=4.0）-乙腈，梯度洗脫；體積流量1.0 mL/min；檢測波長356 nm；柱溫30℃。結(jié)果金絲桃苷、異槲皮苷和槲皮素分別在0.041 6～0.416 0μg、0.038 0～0.380 0μg和0.008 8～0.088 0μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均回收率分別為98.7%、98.5%和100.4%，RSD分別為1.1%、1.4%和2.2%。結(jié)論該方法操作簡便準(zhǔn)確，重復(fù)性較好，可為荷葉中黃酮類化合物的開發(fā)利用提供質(zhì)量評價(jià)依據(jù)。

荷葉；黃酮類化合物；金絲桃苷；異槲皮苷；槲皮素；高效液相色譜法

荷葉為睡蓮科植物蓮Nelumbo nucifera Gaertn的干燥葉［1］，在我國大部分地區(qū)均有種植，為衛(wèi)生部規(guī)定的第二批 “既是食品又是藥品”的品種，廣泛用于食品與藥品領(lǐng)域。目前對荷葉的開發(fā)利用主要側(cè)重在生物堿類成分，而黃酮類成分相對較少。文獻(xiàn)報(bào)道，荷葉中含有較多的黃酮類化合物，具有降血脂、抑菌、抗氧化等作用［2-6］，應(yīng)用前景較好。然而，其中黃酮類化合物結(jié)構(gòu)相似，難以分離，給檢測分析帶來較大難度。目前，荷葉中黃酮類化合物的檢測多采用紫外可見分光光度法測定總黃酮［7-9］，該方法雖然簡便，但定量不準(zhǔn)確，且無法確定黃酮的具體種類。此外，有文獻(xiàn)報(bào)道采用高效液相色譜法測定荷葉中單一黃酮類化合物［10-13］，但檢測效率較低。筆者采用HPLC法同時測定荷葉中3種主要的黃酮類成分金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮素，以彌補(bǔ)上述檢測方法中存在的不足，可用于荷葉選育和黃酮提取工藝研究，為更有效地開發(fā)利用荷葉黃酮提供可靠的篩選方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1200高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；USC-502超聲波清洗儀（上海波龍電子設(shè)備有限公司）；XS205 Dual Range分析天平（瑞士METTLER TOLEDO公司）。

1.2 試藥 金絲桃苷對照品 （批號111521-201004，純度 93.9%，中國食品藥品檢定研究院）；異槲皮苷對照品 （批號10391，純度93.0%，德國HWIANALYTIK公司）；槲皮素對照品（批號100081-200406，純度97.3%，中國食品藥品檢定研究院）；乙腈為色譜純 （德國Merck公司）；水為重蒸水；其他試劑為分析純。荷葉采自湖州市南太湖地區(qū)，經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院谷滿倉博士鑒定為睡蓮科植物蓮的葉。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱為Agilent Eclipse XDB C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；磷酸鹽緩沖液（0.2%磷酸溶液，用10%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至4.0，即得）-乙腈為流動相，梯度洗脫 （0～45 min，8%乙腈；45～55 min，8%～18%乙腈；55～65 min，18%-30%乙腈；65～66 min，30%～8%乙腈；66～75min，8%乙腈）；體積流量為1.0 mL/min；檢測波長為356 nm；柱溫為30℃；進(jìn)樣體積為5μL。

2.2 對照品溶液的制備 精密稱取金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮素對照品適量，分別置于25 mL、50 mL、100 mL量瓶中，加80%甲醇溶液溶解并稀釋至刻度，制成每1 mL含金絲桃苷0.520 mg、異槲皮苷0.475mg、槲皮素0.110mg的對照品貯備液。精密量取各貯備液1 mL，置于25 mL量瓶中，加80%甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3 供試品溶液的制備 取荷葉粉末 （荷葉自然晾干后，105℃下干燥3 h，粉碎，過5號篩）0.25 g，置于50 mL量瓶中，加80%甲醇溶液30 mL，超聲處理30 min，加80%甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻后，過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.4 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 取上述對照品溶液和供試品溶液，按 “2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，結(jié)果見圖1。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，供試品中其他組分不干擾金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮素的測定，待測組分峰與其他峰分離度良好，且理論塔板數(shù)均不低于3 000。

圖1 供試品 （A）、金絲桃苷對照品 （B）、異槲皮苷對照品 （C）、槲皮素對照品 （D）色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of sam ple（A），hyperoside（B），isoquercitrin（C），quercetin（D）

2.5 線性關(guān)系考察 分別精密量取對照品溶液2、4、8、14、20μL，按 “2.1”項(xiàng)下色譜條件測定。以對照品的峰面積為縱坐標(biāo) （Y），對照品的進(jìn)樣量 （μg）為橫坐標(biāo) （X）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程金絲桃苷Y=40.9X+3.72，r=0.999 7；異槲皮苷Y=43.8X+4.73，r=0.999 5；槲皮素Y= 15.3X-1.06，r=0.999 5。表明金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮素分別在 0.041 6～0.416 0μg、0.038 0～0.380 0μg、0.008 8～0.088 0μg濃度范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

2.6 精密度試驗(yàn) 取對照品溶液，連續(xù)測定6次，結(jié)果金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮素峰面積的RSD分別為0.7%、0.5%、0.9%，表明精密度良好。2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，于0、2、4、6、8、10、12 h進(jìn)樣測定。結(jié)果，金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮素峰面積的RSD分別為0.9%、1.3%、1.7%，表明精密度良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一樣品，按 “2.3”項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，按 “2.1”項(xiàng)下色譜條件測定并計(jì)算。結(jié)果，金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮素的RSD分別為0.5%、0.6%、1.7%，表明精密度良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含有量 （金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮素分別為5.23、4.19、0.38 mg/g）的同一樣品6份，每份約0.125 g，分別精密加入金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮素對照品貯備液1.2、1.0、0.4 mL，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按 “2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，計(jì)算金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮素的回收率，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab.1 Results of recovery tests（n=6）

2.10 樣品的測定 取4批供試品，按 “2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按 “2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，按外標(biāo)法計(jì)算金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮素的量，結(jié)果見表2。

表2 樣品測定結(jié)果（n=3）Tab.2 Determ ination resu lts of sam p les（n=3）

3 討論

3.1 提取方法的選擇 在供試品溶液制備過程中，選用了不同體積分?jǐn)?shù)的甲醇溶液作為提取溶劑，考察了回流和超聲兩種方法的提取效果，結(jié)果顯示80%甲醇溶液超聲提取效果最佳。然后，比較了超聲10、20、30 min樣品中各組分的提取率，發(fā)現(xiàn)30min時各組分的提取率不再增加，因此選擇超聲時間為30 min。

3.2 色譜條件的選擇 金絲桃苷和異槲皮苷分子結(jié)構(gòu)相似，不易完全分離，因此選擇了多組流動相進(jìn)行比較。結(jié)果顯示，磷酸鹽緩沖液 （pH4.0）-乙腈為流動相進(jìn)行梯度洗脫時，金絲桃苷和異槲皮苷出峰時間適宜，實(shí)現(xiàn)基線分離，并且極性較低的槲皮素也能較快出峰，縮短分析時間，提高檢測效率。

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Sim ultaneous determ ination of hyperoside，isoquercitrin and quercetin from Nelumbinis Folium by HPLC

ZHU Ying-jian1， WANG Xin-cai2
（1.Huzhou Hospital of Traditional ChineseMedicine，Huzhou 313000，China；2.Huzhou Institute for Food and Drug Control，Huzhou 313000，China）

AIMTo establish an HPLC method for simultaneous determining hyperoside，isoquercitrin and quercetin from Nelumbinis Folium.METHODSThe separation of N.Folium methanolic extractwas achieved on an Agilent Eclipse XDB C18column（250 mm×4.6 mm，5μm）.The mobile phase consisted of acetonitrilephosphate buffer solution（pH=4.0）in a gradient elution mode at the flow rate of 1.0 mL/min.The detection wavelength was set at356 nm，and the column temperature wasmaintained at30℃.RESULTSGood linearities of hyperoside，isoquercitrin and quercetin were obtained within the ranges of 0.041 6-0.416 0，0.038 0-0.380 0，and 0.008 8-0.088 0μg，respectively.Their average recoverieswere98.7%，98.5%and 100.4%，and the RSDs were 1.1%，1.4%and 2.2%，respectively.CONCLUSIONThe method is simple，accurate and reproducible，which can provide a basis for exploitation and utilization of N.folium.

Nelumbinis Folium；flavonoids；hyperoside；isoquercitrin；quercetin；HPLC

R284.1

：A

：1001-1528（2015）06-1276-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.06.025

2014-09-25

湖州市生物醫(yī)藥重大科技專項(xiàng)重點(diǎn)項(xiàng)目 （2009ZD2003-2）

朱瀅澗（1983—），女，中藥師，從事中藥分析與鑒定工作。E-mail：clerk2003@sohu.com