壺瓶棗多糖的分離及其抗氧化活性

張耀雷， 黃立新*， 張彩虹，2， 謝普軍， 游 鳳

（1.中國林業(yè)科學研究院林產(chǎn)化學工業(yè)研究所，生物質化學利用國家工程實驗室，國家林業(yè)局林產(chǎn)化學工程重點開放性實驗室，江蘇省生物質能源與材料重點實驗室，江蘇南京210042；2.中國林業(yè)科學院林業(yè)新技術研究所，北京100091）

壺瓶棗多糖的分離及其抗氧化活性

張耀雷1， 黃立新1*， 張彩虹1，2， 謝普軍1， 游 鳳1

（1.中國林業(yè)科學研究院林產(chǎn)化學工業(yè)研究所，生物質化學利用國家工程實驗室，國家林業(yè)局林產(chǎn)化學工程重點開放性實驗室，江蘇省生物質能源與材料重點實驗室，江蘇南京210042；2.中國林業(yè)科學院林業(yè)新技術研究所，北京100091）

目的研究壺瓶棗多糖的分離純化及其抗氧化活性。方法壺瓶棗粗多糖用D900型大孔吸附樹脂和DEAE-纖維素-52柱層析分離，以去離子水和0～1mol/L的NaCl溶液梯度洗脫，并考察其不同組分清除DPPH自由基、羥基自由基和超氧陰離子自由基的能力。結果分離純化得到3個中性多糖組分（ZJP-1、ZJP-3和ZJP-5）和2個酸性多糖組分（ZJP-2和ZJP-4），并對DPPH自由基均有一定的清除能力。其中ZJP-2清除超氧陰離子自由基能力較強；ZJP-4清除羥基自由基能力較強；ZJP-5清除以上兩種自由基能力均較強。結論D900型大孔吸附樹脂和DEAE-纖維素-52的分離純化效果較好，而且分離所得的5種多糖組分的抗氧化活性各有特點。

壺瓶棗；多糖；純化；抗氧化活性

紅棗是鼠李科棗屬植物棗樹Ziziphus Jujuba Mill.的果實，在我國栽培歷史悠久，種植面積大，現(xiàn)已發(fā)展出包括壺瓶棗Ziziphus Jujuba Mill. cv.Hupingzao在內的700多個品種。紅棗不僅是滋補佳品，而且也是一味傳統(tǒng)的中藥，因富含營養(yǎng)和保健成分而享譽中外，為我國傳統(tǒng)藥食兼用果品［1］。多糖是自然界濃度最豐富的生物聚合物，是構成生命的四大基本物質之一。研究發(fā)現(xiàn)多糖為紅棗的主要功能性成分之一［2］，具有抗腫瘤、降血脂、抗衰老、抗病毒、抗?jié)兊榷喾N生理活性［3］，并且多糖類藥物在癌癥的輔助治療中，具有毒副作用小、安全性高、抑瘤效果好等優(yōu)點［4］。因此，多糖類產(chǎn)品是紅棗深加工的可選擇方向之一。目前關于紅棗多糖的研究主要停留在提取分離階段，而其后續(xù)研究相對較少。本實驗采用D900型大孔吸附樹脂和DEAE-纖維素-52柱層析對壺瓶棗粗多糖進行分離純化，并研究了其不同組分的抗氧化作用，以期獲得具有良好生物活性的高純度多糖組分，為開發(fā)紅棗功能性食品及藥品提供理論基礎，進一步提高我國紅棗資源的深加工附加值。

1 材料與儀器

1.1 材料 紅棗，產(chǎn)地為山西省太谷縣，購于南京市鎖金村農貿市場，經(jīng)中國林科院林產(chǎn)化學工業(yè)研究所王成章研究員鑒定為壺瓶棗；D900型大孔吸附樹脂，購于滄州寶恩吸附材料科技有限公司；DEAE-纖維素-52，購于阿拉丁試劑有限公司；MD44透析袋（分子質量為3 500），購于Biosharp生物科技有限公司。

1.2 試劑 葡萄糖、濃硫酸、苯酚、乙醇、DPPH、考馬斯亮藍G-250、磷酸、七水合氯化亞鐵、水楊酸、雙氧水、三羥甲基氨基甲烷、Vc、鹽酸、鄰苯三酚，均為分析純 （國藥集團化學試劑有限公司）。

1.3 儀器設備 JM型膠體磨（溫州市康而達實業(yè)有限公司）；DHG-9070A型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海索譜儀器有限公司）；Wizard 2.0型真空冷凍干燥機（美國VirTis公司）；分析天平（美國奧豪斯公司）；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵和RE-5299型旋轉蒸發(fā)儀 （上海東璽制冷儀器有限公司）；UV-2102PC紫外可見分光光度儀 （上海尤尼科光譜設備有限公司）；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司）。

2 實驗及測定方法

2.1 壺瓶棗粗多糖的分離純化 壺瓶棗粗多糖溶液400 mL（多糖質量濃度20.12 mg/mL），以D900型大孔吸附樹脂作為柱子 （75 mm×1 200 mm）的層析填料進行分離純化，4倍體積的去離子水以10 m L/min的體積流量進行洗脫，每50 m L隔管檢測，作洗脫曲線 （苯酚-硫酸法跟蹤檢測多糖質量濃度，280 nm下吸光值跟蹤檢測蛋白質濃度）；用DEAE-纖維素-52層析柱（20 mm×500 mm）對所得不同組分多糖進行純化，用去離子水和0～1 mol/L的NaCl溶液以0.5 mL/min的體積流量洗脫，每6 mL隔管檢測，作洗脫曲線，收集不同組分，濃縮后透析48 h。

2.2 多糖的測定 采用苯酚-硫酸法［5］，制作葡萄糖標準曲線：準確稱取80℃下干燥至恒定質量的葡萄糖對照品0.100 g，定容至1 000 mL，配成0.1 mg/mL的標準溶液。精確移取標準溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，置于帶塞試管中，各以蒸餾水補充至2.0 mL，加入質量分數(shù)為6%的重蒸苯酚1.0 mL及濃硫酸5.0 mL，水浴10 min，室溫放置20 min后，于490 nm下測吸光度，得標準曲線的回歸方程C=0.066 6A-0.000 3（r= 0.999 1）。

2.3 蛋白質的測定 采用考馬斯亮藍法［6］，制作牛血清白蛋白 （BSA）標準曲線：準確稱取0.1 g牛血清白蛋白，定容至100 m L，配成1 mg/mL的標準溶液，精確移取標準溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于試管中，各以蒸餾水補充至1.0 mL，加入4 mL考馬斯亮藍溶液，室溫下反應5 min，在595 nm下測其吸光度，得標準曲線的回歸方程C=0.123 2A-0.006 5（r=0.998 1）。

2.4 多糖的紫外-可見光譜分析 取壺瓶棗粗多糖溶液與D900型大孔吸附樹脂柱層析后所得不同組分多糖，配制成多糖質量濃度為0.4 mg/m L的溶液，在190～700 nm的紫外-可見波長范圍內進行掃描，考察純化效果。

2.5 多糖的抗氧化活性分析

2.5.1 DPPH自由基清除能力的測定 參照文獻［7］并做部分修改，1 mg/mL的多糖溶液2 mL與0.2 mmol/L的DPPH乙醇溶液2 mL在室溫下保存30 min于517 nm下測吸光值A1；取蒸餾水代替多糖溶液，測吸光值A0；取乙醇代替DPPH溶液，測吸光值A2，按下式計算清除率，以VC作對照。

2.5.2 羥基自由基清除能力的測定 采用Fenton體系產(chǎn)生·OH，水楊酸法檢測羥基及樣品清除·OH的能力［8］。1 mg/m L的多糖溶液1 mL，9 mmol/L的FeSO4溶液1 m L，9 mmol/L的水楊酸乙醇溶液1 mL，8.8 mmol/L的H2O2溶液1 mL在37℃下水浴30 min，于510 nm下測吸光值A1；取蒸餾水代替多糖溶液，測吸光值A0；1 mL多糖溶液與3 mL蒸餾水混合，測吸光值A2，按下式計算清除率，以VC作對照。

2.5.3 超氧陰離子自由基清除能力的測定 采用鄰苯三酚自氧化法［9］，1 mg/mL的多糖溶液0.5 mL與5mL PH為8.2的Tris-HCl溶液于25℃下反應20 min，加10 mmol/L鄰苯三酚0.5 mL于320 nm下測吸光度A1；取蒸餾水代替多糖溶液，測吸光值A0，繪制吸光度值與時間曲線，斜率即為自氧化速率。按下式計算清除率，以VC作對照。

3 結果與討論

3.1 壺瓶棗粗多糖的分離 利用D900型大孔吸附樹脂層析柱對壺瓶棗粗多糖進行分離純化，洗脫結果如圖1所示。由圖1可知，粗多糖經(jīng)過柱色譜洗脫分離后，可以收到Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ三個部分，多糖回收率為86.75%，脫蛋白率為89.41%。

圖1 粗多糖的D900型大孔吸附樹脂柱層析洗脫曲線Fig.1 Elution curve of crude polysaccharides on themacroporous adsorption resin D900 colum n

3.2 多糖的紫外-可見光譜分析 為了考察D900型大孔吸附樹脂柱的分離純化效果，對原液及Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ三部分多糖溶液進行全波長掃描，結果見圖2。由圖2可知，未經(jīng)色譜柱處理的壺瓶棗粗多糖溶液在280 nm處有一個肩峰，且在可見光區(qū)有較大吸收，經(jīng)層析后，280 nm處肩峰消失，且多糖溶液在可見光區(qū)無吸收，說明粗多糖的分離純化效果較為明顯。這是因為D900型大孔吸附樹脂可吸附含羥基、氨基、共扼雙鍵和氫鍵的物質。由于蛋白質是一種富含氨基酸和氫鍵的物質，因此可以被大孔樹脂吸附［10］，并且蒸餾水不能將其洗脫下來。多糖雖然具有多羥基結構，但由于其易形成分子內氫鍵，故減弱了與大孔樹脂形成氫鍵的能力［11］，因此，蒸餾水可以將多糖從D900型大孔吸附樹脂柱上洗脫下來，達到將其與蛋白質及其他雜質分離的目的。

圖2 多糖溶液的紫外-可見光吸收曲線Fig.2 Ultraviolet-visible absorption curve of the polysaccharides solution

3.3 粗多糖的分級純化 用DEAE-纖維素-52層析柱對Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ三部分多糖進行分級純化，洗脫曲線分別見圖3、圖4及圖5。在洗脫曲線中，各個組分洗脫峰狹窄對稱，說明分離效果較好。由圖3和圖4可知，組分Ⅰ和Ⅱ的多糖經(jīng)柱層析后均可得到兩個組分，其中由去離子水洗脫后，可得到一個中性多糖組分和一個酸性多糖組分，分別為ZJP-1和ZJP-3；由0～1.0 mol/L的NaCl溶液線性梯度洗脫后，可得到一個酸性多糖組分，分別為ZJP-2和ZJP-4。由圖5可知，組分Ⅲ經(jīng)柱層析后，只得到一個中性多糖組分ZJP-5。

3.4 5種多糖組分的抗氧化活性

3.4.1 5種多糖組分的DPPH自由基清除能力

圖3 組分Ⅰ的DEAE-纖維素-52柱層析洗脫曲線Fig.3 Elution curve of fractionⅠon the DEAE-cellulose-52 column

圖4 組分Ⅱ的DEAE-纖維素-52柱層析洗脫曲線Fig.4 Elution curve of fractionⅡon the DEAE-cellulose-52 column

圖5 組分Ⅲ的DEAE-纖維素-52柱層析洗脫曲線Fig.5 Elution curve of fractionⅢon the DEAE-cellulose-52 column

DPPH自由基在有機溶劑中是一種穩(wěn)定的自由基，其孤對電子在517 nm附近有強吸收，有機清除劑可使孤對電子被配對，通過測定吸收減弱的程度可評價自由基清除劑的活性［12］。由圖6可知，5種多糖組分均具有一定的DPPH自由基清除能力，但作用較弱，且其清除率隨濃度變化而增加緩慢；同質量濃度壺瓶棗多糖的DPPH自由基清除能力弱于Vc，順序為ZJP-5＞ZJP-4＞ZJP-1＞ZJP-2＞ZJP-3，其中當ZJP-5質量濃度為3.5 mg/mL時，其清除率趨于穩(wěn)定，為21.32%。

圖6 5種多糖組分的DPPH自由基清除能力Fig.6 Scavenging capacity to·DPPH of five fractions

3.4.2 5種多糖組分的羥基自由基清除能力 羥基自由基是活性氧中最活潑的自由基，但是毒性最大，它幾乎能與活細胞中任何分子發(fā)生反應，且反應速度極快，對機體破壞作用最大，因此羥基自由基清除率是反映藥物抗氧化作用的重要指標［13］。由圖7可知，5種多糖組分均具有羥基自由基清除能力，與多糖濃度在一定范圍內呈正相關，質量濃度越高，其清除能力越強；同質量濃度壺瓶棗多糖的羥基自由基清除能力弱于Vc，順序為ZJP-5＞ZJP-4＞ZJP-2＞ZJP-3＞ZJP-1，其中當ZJP-4和ZJP-5質量濃度為3.5 mg/mL時，其清除率分別為43.82%和53.31%。

圖7 5種多糖組分的羥基自由基清除能力Fig.7 Scavenging capacity to hydroxyl radical of five fractions

3.4.3 5種多糖組分的超氧陰離子自由基清除能力 超氧陰離子自由基在氧化反應中扮演著非常重要的角色，是所有自由基的前身。在生物體內氧化還原反應中，有2%～5%的氧會產(chǎn)生超氧陰離子自由基，其毒性是機體發(fā)生氧中毒的主要原因，因此超氧陰離子自由基清除率也是反映藥物抗氧化作用的重要指標之一［14］。由圖8可知，5種多糖組分均具有超氧陰離子自由基清除能力，與多糖質量濃度在一定范圍內呈正相關，質量濃度越高，其清除能力越強；同質量濃度壺瓶棗多糖的羥基自由基清除能力弱于Vc，順序為ZJP-2＞ZJP-5＞ZJP-3＞ZJP-1＞ZJP-4，其中當ZJP-2和ZJP-5質量濃度為3.5 mg/mL時，其清除率分別為 46.12%和32.30%。

圖8 5種多糖組分的超氧陰離子自由基清除能力Fig.8 Scavenging capacity to superoxide anion radical of five fractions

4 結論

壺瓶棗粗多糖經(jīng)過D900型大孔吸附樹脂柱層析后可得到Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ三個部分，多糖回收率和脫蛋白率分別為86.75%和89.41%；全波長掃描后發(fā)現(xiàn)，三個部分多糖在可見光區(qū)幾乎無吸收，在280 nm處也無吸收峰。綜上可知，D900型大孔吸附樹脂柱的分離純化效果較為明顯。

DEAE-纖維素-52層析柱對所得3個組分進行純化，其中組分Ⅰ可得到一個中性多糖組分ZJP-1和一個酸性多糖組分ZJP-2，組分Ⅱ可得到一個中性多糖組分ZJP-3和一個酸性多糖組分ZJP-4，組分Ⅲ只能得到一個中性多糖組分ZJP-5。

對純化后所得5種多糖組分進行抗氧化活性研究，以Vc作參照物。結果表明，多糖的抗氧化活性均弱于Vc，且5種多糖組分對DPPH自由基的清除能力均較弱；ZJP-2清除超氧陰離子自由基能力較強，當多糖質量濃度為3.5 mg/mL時，其清除率為46.12%；ZJP-4清除羥基自由基能力較強，當多糖質量濃度為3.5 mg/mL時，其清除率為43.82%；ZJP-5清除羥基自由基和超氧陰離子自由基能力都比較強，當多糖質量濃度為3.5 mg/m L時，其清除率分別為53.31%和32.30%。因此，ZJP-2、ZJP-4和ZJP-5的組成有必要做進一步分析，以確定其中活性多糖組分。

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Purification of polysaccharides from Ziziphus Jujuba M ill.cv.Hupingzao and the antioxidant activities

ZHANG Yao-lei1， HUANG Li-xin1*， ZHANG Cai-hong1，2， XIE Pu-jun1， YOU Feng1
（1.Instituteof Chemical Industry of Forest Products，Chinese Academy of Forestry；National Engineering Laboratory for BiomassChemical Utilization；Key and Open Laboratory on Forest Chemical Engineering，State Forestry Administration；Key Laboratory of Biomass Energy and Material，Nanjing 210042，China；2.Institute of New Technology of Forestry，Chinese Academy of Forestry，Beijing 100091，China）

AIMTo study the isolation and purification of polysaccharides from Ziziphus Jujuba Mill.cv. Hupingzao and the antioxidantactivity of these polysaccharides.METHODSThe crude polysaccharideswere purified bymacroporous adsorption resin D900 and DEAE-cellulose-52 column chromatography，eluted with deionized water and 0～1 mol/L NaCl solution.The scavenging capacities of DPPH，hydroxy-and superoxide-free radicals were alsomeasured.RESULTSThree neutral polysaccharide fractions（ZJP-1，ZJP-3，ZJP-5）and two acidic polysaccharide fractions（ZJP-2，ZJP-4）were obtained.The five fractions all had scavenging capacity for DPPH. Among them，ZJP-5 was the strong scavenger for hydroxyl and superoxide anion radicals，ZJP-2 for superoxide anion radical，and ZJP-4 for hydroxyl radical.CONCLUSIONThemacroporous adsorption resin D900 and DEAE-cellulose-52 both have good purifying effect on polysaccharides，and the antioxidant activities of isolated five polysaccharides have different characteristics.

Ziziphus Jujuba Mill.cv.Hupingzao；polysaccharide；purification；antioxidant activity

R284.1

：A

：1001-1528（2015）06-1267-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.06.023

2014-09-16

國家林業(yè)局948項目 （2012-4-12）；中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務費專項資金 （CAFINT2013C04）

張耀雷 （1989—），男，碩士，從事農林產(chǎn)品深加工研究工作。

*通信作者：黃立新 （1967—），男，博士，研究員，博士生導師，從事天然產(chǎn)物提取分離純化及新型干燥技術研究。E-mail：l_x_ huang@163.com