雷公藤紅素對肝癌細(xì)胞SMMC-7721凋亡和周期的調(diào)控作用及機制

許陽賢， 宋海燕， 季 光*

（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院普外科，上海 200032；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)脾胃病研究所，上海200032）

XU Yang-xian1， SONG Hai-yan2， JIGuang2*

（1.Departmentof General Surgery，Longhua Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional ChineseMedicine，Shanghai200032，China；2.Institute of Digestive Diseases，Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 200032，China）

［藥理］

雷公藤紅素對肝癌細(xì)胞SMMC-7721凋亡和周期的調(diào)控作用及機制

許陽賢1， 宋海燕2， 季 光2*

（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院普外科，上海 200032；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)脾胃病研究所，上海200032）

目的研究雷公藤紅素對肝癌細(xì)胞SMMC-7721的增殖和凋亡的影響及機制。方法應(yīng)用CCK8試劑檢測雷公藤紅素對SMMC-7721細(xì)胞的毒性和增殖影響，用軟瓊脂克隆形成試驗檢測藥物對肝癌細(xì)胞的克隆形成能力的干預(yù)，通過核染色及檢測活化caspase-3水平觀察細(xì)胞凋亡情況，用流式細(xì)胞術(shù)檢測藥物干預(yù)對細(xì)胞周期分布的影響，并用Western blot檢測細(xì)胞周期相關(guān)蛋白細(xì)胞周期素B1（cyclin B1）及細(xì)胞分裂周期蛋白2（cell division cycle protein 2，cdc2）水平。結(jié)果雷公藤紅素以劑量依賴性方式使SMMC-7721細(xì)胞的增殖下降和克隆形成減少，使細(xì)胞凋亡增加及細(xì)胞周期阻滯在G2/M期，同時增加失活cdc2表達(dá)，并導(dǎo)致cyclin B1的積聚。結(jié)論雷公藤紅素可顯著抑制肝癌細(xì)胞SMMC-7721的增殖并促進細(xì)胞凋亡，對分裂周期相關(guān)蛋白調(diào)控導(dǎo)致的分裂阻滯可能是影響其對細(xì)胞凋亡和增殖作用的機制之一。

肝細(xì)胞癌；雷公藤紅素；凋亡；細(xì)胞周期阻滯

肝癌是臨床常見的診治困難、預(yù)后極差的一種惡性腫瘤，全球肝癌病死率在各種癌癥中位居第三［1］。我國由于肝炎和肝炎轉(zhuǎn)肝硬化的病人眾多，肝癌發(fā)病率和病死率均高于世界平均水平［2］。手術(shù)是早期肝癌治療的首選方法，但復(fù)發(fā)率高，放、化療是中晚期肝癌及轉(zhuǎn)移性肝癌常用的治療方法，然而療效非常有限［3］。

中醫(yī)藥在臨床治療中晚期肝癌有一定療效，近年來從中草藥中提取的多種化合物被證實有治療腫瘤的潛力［4］。其中雷公藤紅素（celastrol）是醌甲基三萜類物質(zhì)，主要從雷公藤的根皮中提取獲得，研究表明其具有抗炎、抗動脈粥樣硬化、抗神經(jīng)退行性疾病等藥理學(xué)作用［5］。近年來雷公藤紅素在多種腫瘤中的作用受到廣泛關(guān)注［6］，其對肝細(xì)胞癌的作用研究主要為體外試驗，使用的細(xì)胞株包括C3A、HepG2、Huh7等［7-11］。SMMC-7721是一種低分化惡性度較高的肝癌細(xì)胞株，且易對阿霉素、順鉑等藥耐藥，因此本研究擬觀察雷公藤紅素是否對SMMC-7721細(xì)胞增殖和凋亡有干預(yù)作用，這對于探索惡性度較高的中晚期肝癌的藥物治療具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器Bio-Rad電泳系列及Trans-Blot TurboTM半干轉(zhuǎn)膜儀；Syngene GBOX Chemi XT4多功能成像系統(tǒng)；Bio Tek Synergy H4微孔板檢測儀；Thermo CO2培養(yǎng)箱；Thermo Herasafe KSA2二級生物安全柜；Olympus倒置熒光相差顯微鏡；BD FACSVerse流式細(xì)胞儀。

1.1.2 細(xì)胞 SMMC-7721肝癌細(xì)胞，購于中國科學(xué)院細(xì)胞庫，由本實驗室長期培養(yǎng)和凍存。

1.1.3 藥物與試劑 雷公藤紅素 （純度大于98%）購于上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司，溶于DMSO配制成50 mmol/L貯存液保存于-20℃。DMEM高糖培養(yǎng)基為Gibco產(chǎn)品，胎牛血清（FBS）、青霉素/鏈霉素、胰酶等細(xì)胞培養(yǎng)試劑均為法國Biowest公司產(chǎn)品。細(xì)胞增殖和毒性實驗試劑CCK-8為日本同仁化學(xué)研究所（Dojindo）產(chǎn)品。Difco Bacto瓊脂粉為BD產(chǎn)品。PVDF膜、化學(xué)發(fā)光液為Millipore產(chǎn)品，cleaved caspase-3、cyclin B1、phospho-cdc2抗體及羊抗兔IgG購于Cell Signaling Technology公司，β-actin內(nèi)參抗體為華安生物公司產(chǎn)品。二甲基亞砜 （DMSO）、核熒光染料DAPI及PI購自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 SMMC-7721細(xì)胞培養(yǎng) SMMC-7721細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、50 U/m L青霉素和50 μg/mL鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，生長至80%融合度時，0.25%胰酶消化傳代。

1.2.2 細(xì)胞毒性和增殖檢測 每孔5×103個細(xì)胞培養(yǎng)于96孔板中，24 h后棄培養(yǎng)液，加入含雷公藤紅素不同濃度 （0.1、0.5、1、2.5、5、10 μmol/L）的培養(yǎng)基，以不含藥孔為對照，置培養(yǎng)箱內(nèi)孵育48 h，用培養(yǎng)基洗2次，每孔加入100μL新鮮培養(yǎng)基及10μL CCK8試劑，孵育4 h，應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測450 nm波長吸光度，并減去630 nm干擾吸光度值。應(yīng)用公式計算：細(xì)胞活力 （%） =［A（加藥）-A（空白）］/［A（正常）-A（空白）］× 100%，計算其半抑制濃度 （IC50）。

細(xì)胞增殖試驗將2×103個細(xì)胞/孔培養(yǎng)于96孔板中，加入含雷公藤紅素1、2.5、5μmol/L的培養(yǎng)基，以不含藥孔為對照，培養(yǎng)24、48、72 h，如上操作加入CCK8及檢測吸光度。

1.2.3 克隆形成試驗 6孔培養(yǎng)板中鋪入7 mL含0.5%Difco Bacto瓊脂的DMEM作為基底層，上層鋪入混懸有2×103個細(xì)胞的含0.3%瓊脂的培養(yǎng)基1.5 m L，置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d，顯微鏡下計數(shù)超過50個細(xì)胞的克隆數(shù)，每板計數(shù)5個視野。1.2.4 細(xì)胞核形態(tài)觀察 將2×105個細(xì)胞培養(yǎng)于6孔板中，加入含雷公藤紅素不同濃度 （1、2.5、5μmol/L）的培養(yǎng)基，以不含藥孔為對照，72 h后用多聚甲醛固定，加入DAPI染核，于熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.5 細(xì)胞周期檢測 2×105個細(xì)胞培養(yǎng)于6孔板中，加入含雷公藤紅素不同濃度 （1、2.5、5 μmol/L）的培養(yǎng)基，以不含藥孔為對照，48 h后收集并用70%預(yù)冷乙醇固定，無水乙醇固定過夜，用100μg/mL RNase A處理后用0.5 mg/mL PI溶液孵育30 min，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。

1.2.6 Western Blot檢測蛋白水平 細(xì)胞用RIPA溶液裂解提取蛋白，用BCA法測定濃度。50μg蛋白用SDS-PAGE電泳分離并轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%牛奶封閉后，加一抗孵育過夜，二抗室溫下孵育1 h，化學(xué)發(fā)光液孵育10 min后用成像系統(tǒng)拍照并分析條帶光密度值，以β-actin條帶作為上樣量參照，計算蛋白相對表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 實驗數(shù)據(jù)以x±s表示，應(yīng)用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，用GraphPad Prism 5作圖，采用單因素方差分析進行多組間比較，組間兩兩比較用Tukey-Kramer's法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 雷公藤紅素抑制SMMC-7721細(xì)胞增殖和克隆形成 應(yīng)用雷公藤紅素對細(xì)胞毒性檢測，計算得出其IC50為3.57μmol/L，因此后續(xù)試驗選用1、2.5、5μmol/L 3個劑量觀察其抗腫瘤作用。圖1增殖試驗顯示，相對于對照，雷公藤紅素1 μmol/L對細(xì)胞吸光度有輕度下調(diào)作用，在2.5、5 μmol/L從24 h起即顯著下調(diào)吸光度值，并有劑量依賴性。圖2顯示細(xì)胞克隆形成實驗結(jié)果，隨著雷公藤紅素濃度增加，細(xì)胞克隆數(shù)逐漸減少，數(shù)量均明顯下降，兩個較大劑量組較對照有顯著性差異。

圖1 雷公藤紅素對SMMC-7721細(xì)胞增殖的影響Fig.1 Effect of celastrol on SMMC-7721 cell proliferation

圖2 雷公藤紅素對SMMC-7721細(xì)胞克隆形成的影響Fig.2 Effect of celastrol on colony form ation of SMMC-7721 cell

2.2 雷公藤紅素促進SMMC-7721細(xì)胞凋亡 應(yīng)用倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞核的形態(tài)變化，對照組細(xì)胞核基本為圓形或橢圓形，雷公藤紅素干預(yù)組中部分細(xì)胞核皺縮甚至成為碎片狀，并隨其劑量增加程度越嚴(yán)重，正常細(xì)胞核明顯減少 （圖3A）。圖3B顯示，SMMC-7721細(xì)胞中活化的caspase-3水平隨雷公藤紅素劑量增加而升高，caspase-3是細(xì)胞凋亡的標(biāo)志物，因此提示細(xì)胞凋亡與該化合物密切相關(guān)。

圖3 雷公藤紅素對SMMC-7721細(xì)胞凋亡的影響Fig.3 Effect of celastrol on apop tosis of SMMC-7721 cell

2.3 雷公藤紅素對SMMC-7721細(xì)胞周期分布的影響 圖4顯示，與對照組相比，細(xì)胞周期各時相在雷公藤紅素干預(yù)下有所改變，細(xì)胞G2/M期細(xì)胞比例在對照及雷公藤紅素1、2.5、5μmol/L干預(yù)組中的比例分別為：14%、19%、26%、31%，逐漸增加，說明該化合物使細(xì)胞周期阻滯在G2/M階段，細(xì)胞分裂減少，并相應(yīng)引起進入G0/G1期的細(xì)胞數(shù)有一定下降。

圖4 雷公藤紅素對SMMC-7721細(xì)胞周期分布的影響Fig.4 Effect of celastrol on cell cycle d istribution of SMMC-7721 cell

2.4 雷公藤紅素對SMMC-7721細(xì)胞cyclin B1及磷酸化cdc2蛋白水平的影響 細(xì)胞分裂G2/M期主要受cyclin B1-cdc2復(fù)合物的調(diào)控，該復(fù)合物發(fā)揮作用需要使cdc2去磷酸化而活化。圖5顯示，磷酸化cdc2在雷公藤紅素2.5及5μmol/L濃度時含量顯著高于對照細(xì)胞，而cyclin B1蛋白水平也隨著其劑量增加而上升。

圖5 雷公藤紅素對SMMC-7721細(xì)胞中Cyclin B1及失活cdc-2蛋白水平的影響Fig.5 Effect of celastrol on the protein level of cyclin B1 and phosphor-cdc-2 in SMMC-7721 cell

3 討論

既往對雷公藤紅素抗腫瘤作用研究表明，其作用機制包括誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制血管生成、干預(yù)腫瘤壞死因子及核因子-κB信號通路、影響細(xì)胞微管、調(diào)節(jié)熱休克反應(yīng)等［6］。幾項對肝癌作用的相關(guān)研究報道顯示，雷公藤紅素可單獨或協(xié)同其它化療藥物促進肝癌細(xì)胞凋亡、抑制增殖及細(xì)胞侵襲，分子機理包括對STAT3/JAK2通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等通路的調(diào)控作用［7-8，10-11］。本研究結(jié)果顯示，雷公藤紅素可有效抑制肝癌細(xì)胞SMMC-7721增殖和克隆形成能力，并顯著促進細(xì)胞凋亡，與文獻報道其在其它肝癌細(xì)胞株中的作用一致［8，10，12］。另外，既往報道高劑量雷公藤紅素可抑制肝癌細(xì)胞周期，使細(xì)胞阻滯在G0/G1期［7-8］，而本研究顯示雷公藤紅素干預(yù)是阻滯在G2/M期細(xì)胞增多，這與Jiang H L等在Huh7細(xì)胞中的研究結(jié)果一致［10］。

細(xì)胞周期是調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞增殖的關(guān)鍵機制，周期過程由周期素-周期依賴性激酶復(fù)合物緊密調(diào)控，cyclin B-cdc2復(fù)合物驅(qū)動G2/M轉(zhuǎn)化從而促進細(xì)胞分裂［13］。本研究中雷公藤紅素干預(yù)細(xì)胞使失活的cdc2水平增加，導(dǎo)致cyclin B-cdc2復(fù)合物不能正?；罨至阎衅诟鞣N相關(guān)下游分子，細(xì)胞阻滯在G2/M相，影響細(xì)胞的增殖水平，cyclin B1分子也因此不能被降解而積聚。cdc2的活化能確保細(xì)胞正確進入分裂相，DNA損傷時通過相關(guān)分子使cdc2失活，從而阻滯細(xì)胞分裂以修復(fù)DNA，而大量G2/M阻滯將導(dǎo)致細(xì)胞最終凋亡［14-15］。因此我們推測雷公藤紅素可能使細(xì)胞DNA受損，引起cdc2失活，并最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

本研究表明中藥來源的化合物雷公藤紅素，可有效抑制高惡性度的肝癌細(xì)胞SMMC-7721的增殖和活性，促進細(xì)胞凋亡，對于導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯相關(guān)的cyclin B、cdc2等分子的調(diào)控可能是其發(fā)揮抗腫瘤作用的途徑，其具體機制有待于進一步探討。

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Effect and underlyingmechanism of celastrol on apoptosis and cell cycle in hepatocarcinoma cell line SMMC-7721

AIMTo study the effect and potentialmechanism of celastrol on apoptosis and cell cycle of hepatocarcinoma cell line SMMC-7721.METHODSCytotoxicity and the effect of celastrol on cell proliferation were assessed by CCK8 assay.Colony formation assay was used to determine the intervention of the compound for the ability of cell growth and tumorigenesis.The appearance of cellular nucleiwas observed through DAPI stain.Cell cycle was determined using a fow cytometer after PI stain.And Western blot was used to detect protein level of cleaved caspase-3，cyclin B1 and phospho-cdc2.RESULTSCompared with control，celastrol decreased cell proliferation，retarded colony formation in a dose dependentmanner.The compound increased cell apoptosis and cell cycle arrest at the G2/M phase.Simultaneously，it increased the level of inactive cdc2 and the expression of cyclin B1.CONCLUSIONCelastrol could inhibit SMMC-7721 cell proliferation and promote cell apoptosis. Themitotic cycle arrest by this compound through regulation of cell cycle related proteinsmight partially contribute to the underlyingmechanism.

hepatocellular carcinoma；celastrol；apoptosis；cell cycle arrest

R966

：A

：1001-1528（2015）06-1153-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.06.001

XU Yang-xian1， SONG Hai-yan2， JIGuang2*

（1.Departmentof General Surgery，Longhua Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional ChineseMedicine，Shanghai200032，China；2.Institute of Digestive Diseases，Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 200032，China）

2015-02-20

上海市教委預(yù)算內(nèi)科研項目 （2012JW39）；國家自然科學(xué)基金項目 （81202667）

許陽賢（1971—），男，碩士，副主任醫(yī)師，從事中西醫(yī)結(jié)合治療消化道腫瘤研究。E-mail：xuyangxian@163.com

*通信作者：季 光（1968—），男，博士，教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，從事慢性肝病中醫(yī)藥治療研究。E-mail：jiliver@vip.sina.com