巖黃連的高頻再生體系建立與優(yōu)化

韋范+李翠+韋坤華+王曉峰+郭曉云+李林軒

摘要：以巖黃連（CorydalissaxicolaBunting）莖尖為外植體，以MS、1/2MS為基本培養(yǎng)基，采用正交試驗探討植物生長調(diào)節(jié)劑多因素組合（6-BA、NAA、IAA、IBA、AC）對巖黃連初代誘導、不定芽分化、誘導生根的影響。結(jié)果表明，巖黃連不定芽最佳誘導培養(yǎng)基為：MS+0.5mg/L6-BA+0.2mg/LIAA。6-BA濃度過低會導致植物叢生芽較少、繁殖速度減緩，6-BA濃度過高又會導致叢生芽出現(xiàn)玻璃化、變形。在MS+0.6mg/L6-BA+0.2mg/LIBA+0.2mg/LIAA培養(yǎng)基中，巖黃連不定芽能夠進行高效繁殖，不但增殖倍數(shù)非常高，而且芽苗質(zhì)量非常好。

關鍵詞：巖黃連；組織培養(yǎng)；不定芽；基質(zhì)

中圖分類號：R284；S567.23+9.043文獻標志碼：A文章編號：1002-1302（2014）11-0068-03

巖黃連（CorydalissaxicolaBunting）別稱石生黃堇，為紫堇科紫堇屬多年生草本植物，全草含脫氫卡維?。◣r黃連堿）等活性成分，具有顯著的抗菌、消炎、鎮(zhèn)痛、安定作用，并有抑制腫瘤細胞作用，主治瘡癤腫毒、肝炎、肝硬化、肝癌等癥，多見于桂西北山區(qū)[1-3]。巖黃連總生物堿注射劑、片劑等中藥制劑及產(chǎn)品已被研制出來，并已批量投產(chǎn)[4]。由于人為破壞、生境脆弱等原因，巖黃連野生資源瀕臨枯竭，難以滿足藥材市場的需求。本研究利用現(xiàn)代生物技術，建立巖黃連高頻再生體系，為巖黃連組織培養(yǎng)規(guī)模化生產(chǎn)育苗提供技術支撐，旨在為更好地開發(fā)利用巖黃連藥用植物資源提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

巖黃連采自廣西藥用植物園科研基地，采用其莖尖作為材料展開誘導。將巖黃連莖尖洗凈，用75%乙醇滅菌30s，再用無菌水涮洗1遍，將洗干凈的莖尖置于0.1%HgCl2溶液（加1～2點表面活性物質(zhì)吐溫）中浸泡消毒5～10min，用無菌水浸洗2次，每次浸洗5min，用無菌紙將材料表層水分吸干，然后置于MS培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，平均光照度為2000lx，光照時間12h/d，溫度（25±3）℃。

1.2不定芽誘導

在MS培育基上以NAA（0.1、0.2、0.4mg/L）、IAA（0.1、0.2、0.4mg/L）、6-BA（0、0.5、1.0mg/L）3種不同類型激素的3個水平進行正交試驗，對巖黃連不定芽誘導進行改進與優(yōu)化，每處理10瓶，每瓶4個外植體，30d后記錄外植體的誘導情況，比較不同組合誘導不定芽能力的差異。

1.3叢生芽繁殖

在MS培育基上以6-BA（0.3、0.6、1.0mg/L）、IAA（0.1、0.2、0.4mg/L）、IBA（0.1、0.2、0.4mg/L）3種激素的3個水平進行正交試驗，對巖黃連的繁殖培養(yǎng)基進行優(yōu)化，每處理10瓶，每瓶4個單芽，30d后測試管苗生長情況、芽增殖倍數(shù)。

1.4生根培養(yǎng)

為了選擇最理想的生根培育基，在1/2MS培育基上以IBA（0.2、0.5、1.0mg/L）、NAA（0.1、0.3、0.5mg/L）、AC（0、0.3、0.5g/L）3種激素的3個水平進行正交試驗，對巖黃連的生根培養(yǎng)基進行優(yōu)化，每處理10瓶，每瓶10個單芽，30d之后記錄生根率與生根數(shù)。

1.5煉苗及移栽

挑選生長旺盛、根系發(fā)達的試管苗移入常溫室內(nèi)，在蓋上蓋子的狀態(tài)下松開蓋子，2d后掀開蓋子，讓巖黃連幼苗與空氣完全接觸，其間向瓶內(nèi)灑水保持瓶內(nèi)水分充足。3d后取出幼苗，洗凈根部的培養(yǎng)基，移入裝有事先消毒好的黃沙、蛭石、泥炭、泥炭+蛭石（1∶1）、泥炭+黃沙（1∶1）5種不同基質(zhì)上，適度遮陰，并保持一定的濕度，30d后統(tǒng)計不同基質(zhì)中組培苗的成活率。

2結(jié)果與分析

2.1消毒時間篩選

消毒時間分別設5、6、7、8、9、10min6個梯度，接種后15d統(tǒng)計巖黃連的污染率與成活率。由表1可知，持續(xù)消毒滅菌8min，消毒滅菌效果最佳，成功率高達85%。消毒8min，污染率較高，滅菌時間超過8min，污染率有所下降，但是死亡率明顯上升，消毒10min的外植體死亡率達60%。

2.2不定芽的誘導

用莖尖作為外植體接入初代誘導培養(yǎng)基，7d左右切口處開始增大疏松，顏色逐漸變?nèi)辄S色，15d左右培養(yǎng)基上長出翠綠色的不定芽，20d時不定芽成簇生長，呈翠綠色。從表2可以看出，0.5mg/L6-BA+0.2mg/LIAA+0.2mg/LNAA條件下，不定芽個數(shù)最多。各激素對不定芽的誘導影響由大到小依次為：6-BA>IAA>NAA。當6-BA濃度保持在0～0.5mg/L之間時，不定芽數(shù)量與濃度成正比；當6-BA濃度高于0.5mg/L時，二者成反比關系，并且不定芽變?yōu)辄S綠色，說明6-BA濃度過高會對不定芽誘導起到抑制影響。低濃度生長素有利于不定芽誘導及生長。當IAA濃度在0.1～0.2mg/L范圍時，不定芽數(shù)量與濃度成正比，當其濃度高于0.2mg/L，就會起到相反的效果。NAA對不定芽的誘導影響不顯著，可以不考慮（表3）。所以，選取MS+0.5mg/L6-BA+0.2mg/LIAA培養(yǎng)基誘導巖黃連不定芽（圖1）。

2.3叢生芽繼代

將長0.5～1.0cm的不定芽切下接種到繁殖培養(yǎng)基上。由表4、表5可見，6-BA對巖黃連不定芽增殖倍數(shù)影響極顯著。不定芽增殖倍數(shù)的范圍為3.4～7.3。當6-BA濃度為1.0mg/L時，巖黃連生長現(xiàn)象異常，如有輕微玻璃化；當6-BA濃度為0.6mg/L時，巖黃連植株健壯、展葉良好。IBA濃度對巖黃連增殖倍數(shù)影響不顯著，但對苗質(zhì)量有影響，當IBA濃度為0.2mg/L時，芽苗翠綠色，長勢快，質(zhì)量好，有利于后期誘導生根。因此，在MS+0.6mg/L6-BA+0.2mg/L

IBA+0.2mg/LIAA培養(yǎng)基中，巖黃連不定芽能夠進行高效繁殖。重復試驗發(fā)現(xiàn)，在此培養(yǎng)基上不但增殖倍數(shù)非常高，而且芽苗質(zhì)量也非常好（圖2）。

2.4叢生芽誘導生根試驗

將生長健壯的芽苗單切接入巖黃連生根培養(yǎng)基中，30d后統(tǒng)計生根率及平均生根數(shù)（表6）。IBA濃度對試管苗生根率影響極顯著，NAA對試管苗生根率影響顯著，AC對巖黃連試管苗生根率影響不大（表7、表8）。生根率、平均生根數(shù)都主要受IBA濃度的影響，當IBA濃度為0.2～0.5mg/L，隨著IBA濃度升高，巖黃連試管苗生根率、平均生根數(shù)增加；當IBA濃度大于0.5mg/L，生根率、平均生根數(shù)均降低。當NAA濃度在0.1～0.3mg/L范圍內(nèi)時，巖黃連試管苗平均生根數(shù)、生根率均與濃度呈正比，但是如果NAA濃度超出0.3mg/L，則兩者均降低，NAA濃度過高會影響叢生芽的進一步生根。1/2MS+0.5mg/LIBA+0.3mg/LNAA+0.5g/LAC生根培養(yǎng)基中，巖黃連試管苗生根率達100%，平均生根數(shù)達26.7條（圖3）。

2.5再生苗的移栽

由表9可知，不同基質(zhì)成活率由高到低依次為泥炭+蛭石（1∶1）>泥炭+黃沙（1∶1）>蛭石>黃沙>泥炭。因此，試管苗移栽最適宜基質(zhì)為泥炭+蛭石（1∶1），移栽30d成活率為84%。

3結(jié)論與討論

理生化過程受基因的控制。促進植物發(fā)育物質(zhì)的濃度與分類、外植物體的屬性、不同植物激素的比例成分都會對不定芽的生成產(chǎn)生至關重要的影響。本研究表明，沒有細胞分裂素（6-BA）的對照組不定芽誘導率較低，說明巖黃連莖尖不定芽誘導中，細胞分裂素是必需的。低濃度的IAA有助于不定芽的形成。本研究表明，巖黃連不定芽最佳誘導培養(yǎng)基為MS+6-BA0.5mg/L+IAA0.2mg/L。本試驗中，6-BA濃度過低會導致植物叢生芽較少、繁殖速度減緩，6-BA濃度過高又會導致叢生芽玻璃化、變形。IBA屬于植物內(nèi)源生長素，植物無需借助其他外力就能夠自動生成，具有促進細胞分裂、發(fā)育等功能。在組織培養(yǎng)過程中，內(nèi)源激素形成速度較慢，無法滿足植物生長的需求，需要從培養(yǎng)基中吸收。不同種類的生產(chǎn)調(diào)節(jié)素多管齊下，效果要比只使用1種激素好很多[5-8]。本研究表明，在MS+0.6mg/L6-BA+0.2mg/LIBA+0.2mg/LIAA培養(yǎng)基中，巖黃連不定芽能夠進行高效繁殖，不但增殖倍數(shù)非常高，而且芽苗質(zhì)量非常好。生根的關鍵因素是選苗，主要是依據(jù)苗的健壯程度進行，雖然苗高也可作為1項參考指標，但并不是主要因素。生根時應選擇健壯度與高度都達到要求的組培苗進行生根培養(yǎng)。巖黃連移栽試驗出現(xiàn)萎蔫現(xiàn)象主要是由于巖黃連移栽之后，根部與土壤基質(zhì)還沒有相互適應，但是根系及葉片的呼吸作用沒有停止，產(chǎn)

生大量水分，葉片利用二氧化碳、陽光進行光合作用，消耗營養(yǎng)，導致葉片在消耗水分、養(yǎng)分，但是根部又供應不上。巖黃連所生之處主要集中在山巖邊緣等危險、陰涼區(qū)域。因此在栽培中要保持一定的濕度及溫度，每天給葉片噴灑少量水，移栽5d后可在水中加入少量液體生根培養(yǎng)基促進根的生長。

參考文獻：

[1]文和群，許兆然，Villa-LobosJ，等.中國南部石灰?guī)r稀有瀕危植物名錄[J].廣西植物，1993，13（2）：110-127.

[2]廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生廳.廣西中藥材標準[M].南寧：廣西科學技術出版社，1992.

[3]毛宇昂，梁永紅.巖黃連的研究綜述[J].時珍國醫(yī)國藥，2006，17（4）：630-631.

[4]蔣水元，胡興華，趙瑞峰.巖黃連引種栽培研究[J].廣西植物，2002，22（5）：469-473.

[5]姜靈敏，徐有明，張冬梅，等.紅刺玫愈傷組織誘導再生體系的建立[J].江蘇農(nóng)業(yè)學報，2012，28（4）：914-916.

[6]蘇鈦，黃寧珍，付傳明.匙羹藤組織培養(yǎng)條件優(yōu)化研究[J].廣西植物，2009，29（1）：87-91.

[7]陳豫，胡偉，何磊.不同濃度激素對胡蘿卜愈傷組織誘導的影響[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學，2013，41（2）：54-56.

[8]王菲彬，王斐，管玲玲，等，植物激素對東方百合試管苗鱗片分化不定芽的影響[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學，2013，41（6）：53-55.

IBA+0.2mg/LIAA培養(yǎng)基中，巖黃連不定芽能夠進行高效繁殖。重復試驗發(fā)現(xiàn)，在此培養(yǎng)基上不但增殖倍數(shù)非常高，而且芽苗質(zhì)量也非常好（圖2）。

2.4叢生芽誘導生根試驗

將生長健壯的芽苗單切接入巖黃連生根培養(yǎng)基中，30d后統(tǒng)計生根率及平均生根數(shù)（表6）。IBA濃度對試管苗生根率影響極顯著，NAA對試管苗生根率影響顯著，AC對巖黃連試管苗生根率影響不大（表7、表8）。生根率、平均生根數(shù)都主要受IBA濃度的影響，當IBA濃度為0.2～0.5mg/L，隨著IBA濃度升高，巖黃連試管苗生根率、平均生根數(shù)增加；當IBA濃度大于0.5mg/L，生根率、平均生根數(shù)均降低。當NAA濃度在0.1～0.3mg/L范圍內(nèi)時，巖黃連試管苗平均生根數(shù)、生根率均與濃度呈正比，但是如果NAA濃度超出0.3mg/L，則兩者均降低，NAA濃度過高會影響叢生芽的進一步生根。1/2MS+0.5mg/LIBA+0.3mg/LNAA+0.5g/LAC生根培養(yǎng)基中，巖黃連試管苗生根率達100%，平均生根數(shù)達26.7條（圖3）。

2.5再生苗的移栽

由表9可知，不同基質(zhì)成活率由高到低依次為泥炭+蛭石（1∶1）>泥炭+黃沙（1∶1）>蛭石>黃沙>泥炭。因此，試管苗移栽最適宜基質(zhì)為泥炭+蛭石（1∶1），移栽30d成活率為84%。

3結(jié)論與討論

理生化過程受基因的控制。促進植物發(fā)育物質(zhì)的濃度與分類、外植物體的屬性、不同植物激素的比例成分都會對不定芽的生成產(chǎn)生至關重要的影響。本研究表明，沒有細胞分裂素（6-BA）的對照組不定芽誘導率較低，說明巖黃連莖尖不定芽誘導中，細胞分裂素是必需的。低濃度的IAA有助于不定芽的形成。本研究表明，巖黃連不定芽最佳誘導培養(yǎng)基為MS+6-BA0.5mg/L+IAA0.2mg/L。本試驗中，6-BA濃度過低會導致植物叢生芽較少、繁殖速度減緩，6-BA濃度過高又會導致叢生芽玻璃化、變形。IBA屬于植物內(nèi)源生長素，植物無需借助其他外力就能夠自動生成，具有促進細胞分裂、發(fā)育等功能。在組織培養(yǎng)過程中，內(nèi)源激素形成速度較慢，無法滿足植物生長的需求，需要從培養(yǎng)基中吸收。不同種類的生產(chǎn)調(diào)節(jié)素多管齊下，效果要比只使用1種激素好很多[5-8]。本研究表明，在MS+0.6mg/L6-BA+0.2mg/LIBA+0.2mg/LIAA培養(yǎng)基中，巖黃連不定芽能夠進行高效繁殖，不但增殖倍數(shù)非常高，而且芽苗質(zhì)量非常好。生根的關鍵因素是選苗，主要是依據(jù)苗的健壯程度進行，雖然苗高也可作為1項參考指標，但并不是主要因素。生根時應選擇健壯度與高度都達到要求的組培苗進行生根培養(yǎng)。巖黃連移栽試驗出現(xiàn)萎蔫現(xiàn)象主要是由于巖黃連移栽之后，根部與土壤基質(zhì)還沒有相互適應，但是根系及葉片的呼吸作用沒有停止，產(chǎn)

生大量水分，葉片利用二氧化碳、陽光進行光合作用，消耗營養(yǎng)，導致葉片在消耗水分、養(yǎng)分，但是根部又供應不上。巖黃連所生之處主要集中在山巖邊緣等危險、陰涼區(qū)域。因此在栽培中要保持一定的濕度及溫度，每天給葉片噴灑少量水，移栽5d后可在水中加入少量液體生根培養(yǎng)基促進根的生長。

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IBA+0.2mg/LIAA培養(yǎng)基中，巖黃連不定芽能夠進行高效繁殖。重復試驗發(fā)現(xiàn)，在此培養(yǎng)基上不但增殖倍數(shù)非常高，而且芽苗質(zhì)量也非常好（圖2）。

2.4叢生芽誘導生根試驗

將生長健壯的芽苗單切接入巖黃連生根培養(yǎng)基中，30d后統(tǒng)計生根率及平均生根數(shù)（表6）。IBA濃度對試管苗生根率影響極顯著，NAA對試管苗生根率影響顯著，AC對巖黃連試管苗生根率影響不大（表7、表8）。生根率、平均生根數(shù)都主要受IBA濃度的影響，當IBA濃度為0.2～0.5mg/L，隨著IBA濃度升高，巖黃連試管苗生根率、平均生根數(shù)增加；當IBA濃度大于0.5mg/L，生根率、平均生根數(shù)均降低。當NAA濃度在0.1～0.3mg/L范圍內(nèi)時，巖黃連試管苗平均生根數(shù)、生根率均與濃度呈正比，但是如果NAA濃度超出0.3mg/L，則兩者均降低，NAA濃度過高會影響叢生芽的進一步生根。1/2MS+0.5mg/LIBA+0.3mg/LNAA+0.5g/LAC生根培養(yǎng)基中，巖黃連試管苗生根率達100%，平均生根數(shù)達26.7條（圖3）。

2.5再生苗的移栽

由表9可知，不同基質(zhì)成活率由高到低依次為泥炭+蛭石（1∶1）>泥炭+黃沙（1∶1）>蛭石>黃沙>泥炭。因此，試管苗移栽最適宜基質(zhì)為泥炭+蛭石（1∶1），移栽30d成活率為84%。

3結(jié)論與討論

理生化過程受基因的控制。促進植物發(fā)育物質(zhì)的濃度與分類、外植物體的屬性、不同植物激素的比例成分都會對不定芽的生成產(chǎn)生至關重要的影響。本研究表明，沒有細胞分裂素（6-BA）的對照組不定芽誘導率較低，說明巖黃連莖尖不定芽誘導中，細胞分裂素是必需的。低濃度的IAA有助于不定芽的形成。本研究表明，巖黃連不定芽最佳誘導培養(yǎng)基為MS+6-BA0.5mg/L+IAA0.2mg/L。本試驗中，6-BA濃度過低會導致植物叢生芽較少、繁殖速度減緩，6-BA濃度過高又會導致叢生芽玻璃化、變形。IBA屬于植物內(nèi)源生長素，植物無需借助其他外力就能夠自動生成，具有促進細胞分裂、發(fā)育等功能。在組織培養(yǎng)過程中，內(nèi)源激素形成速度較慢，無法滿足植物生長的需求，需要從培養(yǎng)基中吸收。不同種類的生產(chǎn)調(diào)節(jié)素多管齊下，效果要比只使用1種激素好很多[5-8]。本研究表明，在MS+0.6mg/L6-BA+0.2mg/LIBA+0.2mg/LIAA培養(yǎng)基中，巖黃連不定芽能夠進行高效繁殖，不但增殖倍數(shù)非常高，而且芽苗質(zhì)量非常好。生根的關鍵因素是選苗，主要是依據(jù)苗的健壯程度進行，雖然苗高也可作為1項參考指標，但并不是主要因素。生根時應選擇健壯度與高度都達到要求的組培苗進行生根培養(yǎng)。巖黃連移栽試驗出現(xiàn)萎蔫現(xiàn)象主要是由于巖黃連移栽之后，根部與土壤基質(zhì)還沒有相互適應，但是根系及葉片的呼吸作用沒有停止，產(chǎn)

生大量水分，葉片利用二氧化碳、陽光進行光合作用，消耗營養(yǎng)，導致葉片在消耗水分、養(yǎng)分，但是根部又供應不上。巖黃連所生之處主要集中在山巖邊緣等危險、陰涼區(qū)域。因此在栽培中要保持一定的濕度及溫度，每天給葉片噴灑少量水，移栽5d后可在水中加入少量液體生根培養(yǎng)基促進根的生長。

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