維藥睡蓮花沒食子酸的含量測定

李晨陽等

【摘 要】 目的：建立維藥睡蓮花藥材中沒食子酸的含量測定方法，為其質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。方法：采用HPLC法測定，色譜條件：Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱（250mm × 46mm，5μm），流動(dòng)相為甲醇：005ml/l磷酸二元梯度洗脫，流速：10ml/min，柱溫：30 ℃，檢測波長為273nm。結(jié)果：沒食子酸在000196～00784mg/ml的范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系（r=09999），加樣回收率為9812%，RSD為179%（n=6）；樣品溶液在32h內(nèi)穩(wěn)定。結(jié)論：該方法操作簡便、重復(fù)性好，可用于規(guī)范和控制維藥睡蓮花藥材的質(zhì)量。

【關(guān)鍵詞】 睡蓮花；沒食子酸；高效液相色譜法；含量測定

【中圖分類號(hào)】R2841 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A 【文章編號(hào)】1007-8517（2014）24-0006-03

Determination of gallic acid content of Nymphaea Candida

LI Chenyang，ZHAO Jun，XU Fang，TAN Wei，CHEN Yan

Xinjiang Institute of Materia Medica，Key Laboratory of Uighur Medicine，Urumqi 830004，China

Abstract：Objective To establish the determination method of Nymphaea candida Presl. for determining gallic acid with HPLC. Method The HPLC separation was performed on a Agilent Eclipse XDB-C18 column（250mm×46mm，5μm） in gradient elute mode with a mixture consisting of methol and 05ml/L phosphate acid solution at 30°C， the flow rate was 10ml/min， the detection wavelength was set at 273nm. Result The calibration curve of gallic acid was linear in the range of 000196～00784mg/ml （r=09999）； the average recovery of quercitrin was 9812% （RSD=179%，n=6），and the properties of sample solution kept steady within 32 hours. Conclusion The method is simple， accurate and reproducible， and can be used for the quality control of Nymphaea candida Presl.

Keywords：Nymphaea candida Presl；gallic acid；HPLC；determination

睡蓮花（Nymphaea candida Presl.）為睡蓮科睡蓮屬多年生水生草本植物雪白睡蓮的干燥花蕾，具有清熱解毒、鎮(zhèn)靜安神之功效，收載于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)維吾爾藥分冊(cè)》，是維吾爾醫(yī)常用的單方或復(fù)方抗病毒藥中的主要成分。該藥材在維吾爾醫(yī)中用藥歷史久遠(yuǎn)，主要用于熱癥引起的頭痛，熱感咳嗽及小兒急、慢驚風(fēng)等病癥的治療。睡蓮屬植物大部分原產(chǎn)北非和東南亞熱帶地區(qū)，少數(shù)產(chǎn)于南非、歐洲和亞洲的溫帶和寒帶地區(qū)，國內(nèi)從云南至東北，往西至新疆均有分布。本論文采用高效液相色譜法測定了睡蓮花中沒食子酸的含量，為后期睡蓮花質(zhì)量控制的提高和開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

11 儀器 LC-10ATvp高效液相色譜儀，SPD-10Avp紫外可見檢測器（日本島津有限公司）；梅特勒AL204型電子天平（梅特勒-托利多上海有限公司）；HH-W600三用恒溫水箱（江蘇金壇市醫(yī)療儀器廠）；AS10200AD型超聲波清洗器（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）。

12 試藥 沒食子酸對(duì)照品（批號(hào)：110831-200302，中國食品藥品檢定研究院）；乙腈、甲醇為色譜純（Fisher）；水為娃哈哈純凈水；磷酸等其他試劑為分析純。雪白睡蓮藥材經(jīng)新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所何江副研究員鑒定為雪白睡蓮Nymphaea candida Presl.的干燥花蕾。

2 方法與結(jié)果

21 色譜條件與系統(tǒng)適用性

211 色譜條件 色譜柱為Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱（250mm×46mm，5μm）；，流動(dòng)相：甲醇-05ml/L磷酸（5：95）；流速：10ml/min；柱溫：30℃；檢測波長：273nm；進(jìn)樣量：10μl。

212 色譜適用性試驗(yàn) 沒食子酸理論塔板數(shù) n=554（tR/Wh/2）2 =7577，說明在選定的條件下，色譜柱的某些條件如柱長、載體性能及色譜柱填充均符合要求，測定效果良好。沒食子酸分離度 R=2（tR2-tR1）/（W1+W2） = 460，《中國藥典》（2010版）規(guī)定分離度應(yīng)大于15，本項(xiàng)結(jié)果表明，分離度符合要求。在上述色譜條件下，藥材中沒食子酸的色譜峰與其它成分分離度良好。結(jié)果見圖1。

22 供試品溶液的制備 取睡蓮花藥材（批號(hào)20130108），粉碎過40目篩，取01g，精密稱定，置50ml量瓶中，加入體積分?jǐn)?shù)為60%的甲醇30ml，超聲提取30min，放至室溫，加體積分?jǐn)?shù)為60%的甲醇定容至刻度，用微孔濾膜（045μm）過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

23 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取沒食子酸對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1ml含0196mg的沒食子酸對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。

24 線性關(guān)系考察 沒食子酸線性關(guān)系考察 精密量取沒食子酸對(duì)照品溶液01、02、05、1、2、4ml，分別置10ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻。精密吸取各對(duì)照品溶液10μl，注入液相色譜儀，按上述色譜條件測定，記錄峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y=3071636768X525638，r=09999，結(jié)果表明，沒食子酸在00019600784mg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

25 日內(nèi)及日間精密度實(shí)驗(yàn) 取同一份睡蓮花藥材（批號(hào)20130108）的供試品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次測定，結(jié)果沒食子酸的RSD為073%，表明本方法精密度良好。將上述藥材連續(xù)六天，在相同時(shí)間段取樣處理并進(jìn)樣測定，結(jié)果睡蓮花藥材中沒食子酸平均含量為416mg/g，RSD為262%。

26 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 準(zhǔn)確稱取睡蓮花藥材（批號(hào)20130108）粉末6 份，按所確定的樣品制備方法和色譜條件測定，結(jié)果睡蓮花藥材中沒食子酸的平均含量為418mg/g，RSD為213%，表明本方法重復(fù)性較好。

27 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一份睡蓮花藥材（批號(hào)20130108）的供試品溶液，分別在0、1、3、7、24、32h進(jìn)樣測定，結(jié)果睡蓮花藥材中沒食子酸的峰面積RSD為072%，表明供試品溶液在32h內(nèi)穩(wěn)定性符合測試要求。

28 回收率測定 分別精密稱取已測含量的睡蓮花（批號(hào)20130108）粉末6 份，每份約005g，分別加入濃度為0196mg/ml的沒食子酸對(duì)照品溶液11ml，再加入體積分?jǐn)?shù)為60%的甲醇30ml，后按“22”項(xiàng)下供試品溶液的制備進(jìn)行操作，結(jié)果見表1。沒食子酸平均回收率為9812%，RSD為179%。

29 五批樣品的含量測定 詳見表2。

3 討論

在流動(dòng)相選擇中，考察了甲醇-水溶液和乙腈-水溶液，結(jié)果表明水系統(tǒng)對(duì)沒食子酸的分離度較差，且峰形不好；進(jìn)而考察了甲醇-005%磷酸水溶液、甲醇-01%磷酸水溶液、甲醇-02%磷酸水溶液、乙腈醇-005%磷酸水溶液、乙腈醇-01%磷酸水溶液和乙腈醇-02%磷酸水溶液的梯度洗脫系統(tǒng)，結(jié)果表明甲醇、乙腈及不同濃度的磷酸水溶液對(duì)睡蓮花樣品中沒食子酸的分離度和峰形都很好，因此從節(jié)約成本及保護(hù)色譜柱的方面考慮含量測定采用甲醇-005%磷酸水溶液系統(tǒng)。

提取方法的考察中加熱回流法考察了不同提取溶劑、不同提取次數(shù)、不同提取時(shí)間及不同溶劑倍數(shù)，確定加熱回流法的最佳提取方法是01g藥材加入30ml水，加熱回流兩次每次15h。超聲提取法同樣考察不同提取溶劑、不同提取時(shí)間及不同溶劑倍數(shù)，確定超聲提取法的最佳提取方法是01g藥材加入30ml60%甲醇，超聲05h。

綜合樣品穩(wěn)定性以及節(jié)約時(shí)間的考慮，確定睡蓮花中沒食子酸含測樣品的制備方法為01g藥材加入30ml60%甲醇，超聲05h。

（上接第7頁）

本研究采用HPLC測定了5批次不同產(chǎn)地睡蓮花藥材中沒食子酸的含量，由于新疆的湖泊數(shù)量和面積較少，加之睡蓮花樣品是未開放的花苞，采收的經(jīng)濟(jì)利益較低，所以采集較為困難，故本文收集了五批新疆地產(chǎn)的睡蓮花藥材樣品進(jìn)行測定。結(jié)果表明各產(chǎn)地沒食子酸含量差異較大，說明不同批次的睡蓮花藥材的化學(xué)成分含量有差異，這可能是受氣候、環(huán)境和土壤等因素的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為維藥睡蓮花質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高及規(guī)范睡蓮花藥材市場提供了理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1]中華人民共和國衛(wèi)生部藥典委員會(huì).中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)：維吾爾藥分冊(cè)[J].烏魯木齊：新疆科技衛(wèi)生出版社，1999：111.

[2]趙軍，徐芳，吉騰飛，等.雪白睡蓮花酚類成分研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2013，25（7）： 916-918.

[3]盛萍，帕麗達(dá)·阿不力孜，張烴，等.維吾爾藥睡蓮花中煙花苷的含量測定[J].中藥材，2006，12（12）：1313-1314.

[4]趙軍，賀金華，閆明，等.維藥睡蓮花化學(xué)成分研究[J].中國藥學(xué)雜志，2007，32（12）：1232-1234.

[5]趙軍，閆明，賀金華，等.維藥睡蓮花中的黃酮醇苷類成分分析[J].中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)雜志，2008，25（2）：115-117.

[6]賀金華，趙軍，閆明，等.睡蓮花總酚酸超聲提取工藝研究[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥，2007，18（10）：2360-2361.

（收稿日期：20140929）

23 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取沒食子酸對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1ml含0196mg的沒食子酸對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。

24 線性關(guān)系考察 沒食子酸線性關(guān)系考察 精密量取沒食子酸對(duì)照品溶液01、02、05、1、2、4ml，分別置10ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻。精密吸取各對(duì)照品溶液10μl，注入液相色譜儀，按上述色譜條件測定，記錄峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y=3071636768X525638，r=09999，結(jié)果表明，沒食子酸在00019600784mg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

25 日內(nèi)及日間精密度實(shí)驗(yàn) 取同一份睡蓮花藥材（批號(hào)20130108）的供試品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次測定，結(jié)果沒食子酸的RSD為073%，表明本方法精密度良好。將上述藥材連續(xù)六天，在相同時(shí)間段取樣處理并進(jìn)樣測定，結(jié)果睡蓮花藥材中沒食子酸平均含量為416mg/g，RSD為262%。

26 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 準(zhǔn)確稱取睡蓮花藥材（批號(hào)20130108）粉末6 份，按所確定的樣品制備方法和色譜條件測定，結(jié)果睡蓮花藥材中沒食子酸的平均含量為418mg/g，RSD為213%，表明本方法重復(fù)性較好。

27 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一份睡蓮花藥材（批號(hào)20130108）的供試品溶液，分別在0、1、3、7、24、32h進(jìn)樣測定，結(jié)果睡蓮花藥材中沒食子酸的峰面積RSD為072%，表明供試品溶液在32h內(nèi)穩(wěn)定性符合測試要求。

28 回收率測定 分別精密稱取已測含量的睡蓮花（批號(hào)20130108）粉末6 份，每份約005g，分別加入濃度為0196mg/ml的沒食子酸對(duì)照品溶液11ml，再加入體積分?jǐn)?shù)為60%的甲醇30ml，后按“22”項(xiàng)下供試品溶液的制備進(jìn)行操作，結(jié)果見表1。沒食子酸平均回收率為9812%，RSD為179%。

29 五批樣品的含量測定 詳見表2。

3 討論

在流動(dòng)相選擇中，考察了甲醇-水溶液和乙腈-水溶液，結(jié)果表明水系統(tǒng)對(duì)沒食子酸的分離度較差，且峰形不好；進(jìn)而考察了甲醇-005%磷酸水溶液、甲醇-01%磷酸水溶液、甲醇-02%磷酸水溶液、乙腈醇-005%磷酸水溶液、乙腈醇-01%磷酸水溶液和乙腈醇-02%磷酸水溶液的梯度洗脫系統(tǒng)，結(jié)果表明甲醇、乙腈及不同濃度的磷酸水溶液對(duì)睡蓮花樣品中沒食子酸的分離度和峰形都很好，因此從節(jié)約成本及保護(hù)色譜柱的方面考慮含量測定采用甲醇-005%磷酸水溶液系統(tǒng)。

提取方法的考察中加熱回流法考察了不同提取溶劑、不同提取次數(shù)、不同提取時(shí)間及不同溶劑倍數(shù)，確定加熱回流法的最佳提取方法是01g藥材加入30ml水，加熱回流兩次每次15h。超聲提取法同樣考察不同提取溶劑、不同提取時(shí)間及不同溶劑倍數(shù)，確定超聲提取法的最佳提取方法是01g藥材加入30ml60%甲醇，超聲05h。

綜合樣品穩(wěn)定性以及節(jié)約時(shí)間的考慮，確定睡蓮花中沒食子酸含測樣品的制備方法為01g藥材加入30ml60%甲醇，超聲05h。

（上接第7頁）

本研究采用HPLC測定了5批次不同產(chǎn)地睡蓮花藥材中沒食子酸的含量，由于新疆的湖泊數(shù)量和面積較少，加之睡蓮花樣品是未開放的花苞，采收的經(jīng)濟(jì)利益較低，所以采集較為困難，故本文收集了五批新疆地產(chǎn)的睡蓮花藥材樣品進(jìn)行測定。結(jié)果表明各產(chǎn)地沒食子酸含量差異較大，說明不同批次的睡蓮花藥材的化學(xué)成分含量有差異，這可能是受氣候、環(huán)境和土壤等因素的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為維藥睡蓮花質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高及規(guī)范睡蓮花藥材市場提供了理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

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[4]趙軍，賀金華，閆明，等.維藥睡蓮花化學(xué)成分研究[J].中國藥學(xué)雜志，2007，32（12）：1232-1234.

[5]趙軍，閆明，賀金華，等.維藥睡蓮花中的黃酮醇苷類成分分析[J].中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)雜志，2008，25（2）：115-117.

[6]賀金華，趙軍，閆明，等.睡蓮花總酚酸超聲提取工藝研究[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥，2007，18（10）：2360-2361.

（收稿日期：20140929）

23 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取沒食子酸對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1ml含0196mg的沒食子酸對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。

24 線性關(guān)系考察 沒食子酸線性關(guān)系考察 精密量取沒食子酸對(duì)照品溶液01、02、05、1、2、4ml，分別置10ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻。精密吸取各對(duì)照品溶液10μl，注入液相色譜儀，按上述色譜條件測定，記錄峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y=3071636768X525638，r=09999，結(jié)果表明，沒食子酸在00019600784mg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

25 日內(nèi)及日間精密度實(shí)驗(yàn) 取同一份睡蓮花藥材（批號(hào)20130108）的供試品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次測定，結(jié)果沒食子酸的RSD為073%，表明本方法精密度良好。將上述藥材連續(xù)六天，在相同時(shí)間段取樣處理并進(jìn)樣測定，結(jié)果睡蓮花藥材中沒食子酸平均含量為416mg/g，RSD為262%。

26 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 準(zhǔn)確稱取睡蓮花藥材（批號(hào)20130108）粉末6 份，按所確定的樣品制備方法和色譜條件測定，結(jié)果睡蓮花藥材中沒食子酸的平均含量為418mg/g，RSD為213%，表明本方法重復(fù)性較好。

27 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一份睡蓮花藥材（批號(hào)20130108）的供試品溶液，分別在0、1、3、7、24、32h進(jìn)樣測定，結(jié)果睡蓮花藥材中沒食子酸的峰面積RSD為072%，表明供試品溶液在32h內(nèi)穩(wěn)定性符合測試要求。

28 回收率測定 分別精密稱取已測含量的睡蓮花（批號(hào)20130108）粉末6 份，每份約005g，分別加入濃度為0196mg/ml的沒食子酸對(duì)照品溶液11ml，再加入體積分?jǐn)?shù)為60%的甲醇30ml，后按“22”項(xiàng)下供試品溶液的制備進(jìn)行操作，結(jié)果見表1。沒食子酸平均回收率為9812%，RSD為179%。

29 五批樣品的含量測定 詳見表2。

3 討論

在流動(dòng)相選擇中，考察了甲醇-水溶液和乙腈-水溶液，結(jié)果表明水系統(tǒng)對(duì)沒食子酸的分離度較差，且峰形不好；進(jìn)而考察了甲醇-005%磷酸水溶液、甲醇-01%磷酸水溶液、甲醇-02%磷酸水溶液、乙腈醇-005%磷酸水溶液、乙腈醇-01%磷酸水溶液和乙腈醇-02%磷酸水溶液的梯度洗脫系統(tǒng)，結(jié)果表明甲醇、乙腈及不同濃度的磷酸水溶液對(duì)睡蓮花樣品中沒食子酸的分離度和峰形都很好，因此從節(jié)約成本及保護(hù)色譜柱的方面考慮含量測定采用甲醇-005%磷酸水溶液系統(tǒng)。

提取方法的考察中加熱回流法考察了不同提取溶劑、不同提取次數(shù)、不同提取時(shí)間及不同溶劑倍數(shù)，確定加熱回流法的最佳提取方法是01g藥材加入30ml水，加熱回流兩次每次15h。超聲提取法同樣考察不同提取溶劑、不同提取時(shí)間及不同溶劑倍數(shù)，確定超聲提取法的最佳提取方法是01g藥材加入30ml60%甲醇，超聲05h。

綜合樣品穩(wěn)定性以及節(jié)約時(shí)間的考慮，確定睡蓮花中沒食子酸含測樣品的制備方法為01g藥材加入30ml60%甲醇，超聲05h。

（上接第7頁）

本研究采用HPLC測定了5批次不同產(chǎn)地睡蓮花藥材中沒食子酸的含量，由于新疆的湖泊數(shù)量和面積較少，加之睡蓮花樣品是未開放的花苞，采收的經(jīng)濟(jì)利益較低，所以采集較為困難，故本文收集了五批新疆地產(chǎn)的睡蓮花藥材樣品進(jìn)行測定。結(jié)果表明各產(chǎn)地沒食子酸含量差異較大，說明不同批次的睡蓮花藥材的化學(xué)成分含量有差異，這可能是受氣候、環(huán)境和土壤等因素的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為維藥睡蓮花質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高及規(guī)范睡蓮花藥材市場提供了理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

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[5]趙軍，閆明，賀金華，等.維藥睡蓮花中的黃酮醇苷類成分分析[J].中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)雜志，2008，25（2）：115-117.

[6]賀金華，趙軍，閆明，等.睡蓮花總酚酸超聲提取工藝研究[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥，2007，18（10）：2360-2361.

（收稿日期：20140929）