KBT-ZTC澄清劑用于補腎溫肺合劑水提液的澄清工藝研究

馮傳平， 楊 惠， 李 輝， 陳 斌

（湖南中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，湖南株洲412012）

KBT-ZTC澄清劑用于補腎溫肺合劑水提液的澄清工藝研究

馮傳平， 楊 惠， 李 輝， 陳 斌

（湖南中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，湖南株洲412012）

目的篩選KBT-ZTC澄清劑用于補腎溫肺合劑提取液的最佳純化澄清工藝。方法以黃芪甲苷、淫羊藿苷保留率和固形物去除率為指標(biāo)，通過單因素實驗考察水提液濃度、加入KBT-ZTC時的溫度、順序及其用量、保溫時間和攪拌對純化除去雜質(zhì)效果的影響。應(yīng)用正交設(shè)計方法篩選優(yōu)化工藝條件。結(jié)果水提液濃度1∶7，攪拌速度為100 r/min，溫度50℃，操作時先加3%B組分，然后加0.15%A組分。結(jié)論KBT-ZTC澄清劑可用于補腎溫肺合劑水提液的純化除雜。

補腎溫肺合劑；KBT-ZTC澄清劑；澄清工藝

補腎溫肺合劑是由黃芪、淫羊藿等十味中藥組成，課題組完成了大量的制劑工藝篩選研究［1-3］。該制劑為我校附屬第一醫(yī)院院內(nèi)制劑，臨床主要用于支氣管哮喘、過敏性鼻炎等疾病［4］。補腎溫肺合劑的原生產(chǎn)工藝中對水提液部分采用水提醇沉法除雜，這樣需要耗費大量酒精，成本較高，且醇沉后有效成分損失較大。為了降低生產(chǎn)成本，改善產(chǎn)品的澄明度，并提高產(chǎn)品的質(zhì)量，在參考了文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上［5-10］，本實驗采用KBT-ZTC澄清劑對其水提液純化工藝進(jìn)行了研究，并且比較了天然澄清劑法與傳統(tǒng)的醇沉法的除雜效果。

1 材料

1.1 藥品與試劑 淫羊藿、黃芪等藥材均購于湖南三湘中藥飲片有限公司，經(jīng)我校生藥教研室李飛艷副教授鑒定，均符合《中國藥典》2010年版標(biāo)準(zhǔn)。KBT-ZTC澄清劑A、B（上海科立爾生物技術(shù)公司），所用試劑均為分析純。

1.2 儀器 Agilent高效液相色譜儀；Alltech2000型蒸發(fā)光散射檢測器；METTLER-AE240型電子分析天平，黃芪甲苷對照品 （中國食品藥品檢定研究院，供含量測定用，批號110781-200613），淫羊藿苷對照品 （中國食品藥品檢定研究院，供含量測定用，批號110737-200415）。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品溶液的制備

2.1.1 提取液的制備 稱取本藥配方藥物9份，其中防風(fēng)等提取揮發(fā)油后 （揮發(fā)油備用）的藥渣與其他藥味按加水量為藥材總量的10倍，煎煮時間為1.5 h，煎煮次數(shù)為3次方法進(jìn)行提取，然后濃縮，靜置沉淀，過濾，濾液濃縮至含生藥量分別為為1∶5、1∶7、1∶10，靜置沉淀，過濾，得濾液備用，量取100 ML，進(jìn)一步濃縮至10 mL，以測定溶液中淫羊藿苷、黃芪甲苷的含有量。

2.1.2 純化除雜后樣品液的制備 取各澄清純化除雜后的溶液，過濾，量取100 mL，進(jìn)一步濃縮至10 mL，以測定溶液中淫羊藿苷、黃芪甲苷的含有量。

2.2 澄清劑溶液的配制

2.2.1 5%A組分溶液的配制 取1份中藥澄清劑A組分，用純凈水溶解稀釋成20份，攪拌溶解均勻。

2.2.2 5%B組分溶液的配制 取1份B組分用純凈水分散稀釋成20份，攪拌充分分散，放置2～3 h，再攪拌混勻1次。

2.3 評價衡量指標(biāo)

2.3.1 淫羊藿苷保留率 保留率=澄清純化后的淫羊藿苷含有量/澄清純化前的淫羊藿苷含有量×100%。

2.3.2 黃芪甲苷保留率 保留率=澄清純化后的黃芪甲苷含有量/澄清純化前的黃芪甲苷含有量×100%。

2.3.3 固形物去除率 固形物去除率=（澄清純化前固形物質(zhì)量-澄清純化后固形物質(zhì)量）/澄清純化前固形物質(zhì)量×100%。具體操作如下：取蒸發(fā)皿干燥至恒定質(zhì)量，將澄清純化處理前后的提取液各100 mL置于其中并水浴蒸干，105℃條件下烘3 h后，在干燥器中令其冷卻，于30 min后精密稱定質(zhì)量。

2.3.4 綜合評分 考慮到最大限度地保留有效成分，同時又能有較好的澄清效果，本實驗采取綜合評價指標(biāo)：固形物去除率（Y1）的權(quán)重定為0.2，黃芪甲苷保留率 （Y2）和淫羊藿苷保留率（Y3）的權(quán)重各定為0.4，綜合評分：OD%=（Y1/Y1max×0.2+Y2/Y2max×0.4+Y3/Y3max×0.4）×100%。2.4 淫羊藿苷的定量測定［11-13］

2.4.1 色譜條件參數(shù) 色譜柱Zorbax SB-C18（4.6 mm× 250 mm，5μm）；流動相組成為乙腈-水 （32∶68）；波長270 nm；進(jìn)樣體積15μL；柱溫室溫；流動相體積流量0.80 mL/min。

2.4.2 對照品溶液 精密稱取適量淫羊藿苷對照品，加甲醇溶解制成質(zhì)量濃度為0.093 8 mg/mL的淫羊藿苷對照品溶液。

2.4.3 供試品溶液 精密吸取樣品10 mL置量瓶中，加15 mL甲醇溶解，超聲20 min，濾過，濾液置于50 mL量瓶中，加甲醇定容，微孔濾膜 （0.45μm）濾過，取續(xù)濾液，即得。2.4.4 空白溶液 取缺淫羊藿藥材的制劑，按 “2.4.3”項下制法制備。色譜見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

2.5 黃芪甲苷的定量測定［14-15］

2.5.1 色譜條件參數(shù) ZORBAX C18色譜柱（4.6mm×150 mm，5μm）；柱溫為常溫；流動相組成為甲醇-水 （75∶25）；流動相體積流量0.8 mL/min；氣體體積流量2.5 mL/min；漂移管溫度80℃。

2.5.2 對照品溶液 精密稱取適量黃芪甲苷對照品，置量瓶中，加甲醇溶解制成質(zhì)量濃度為98.88μg/mL的黃芪甲苷對照品溶液。

2.5.3 供試品溶液 精密量取樣品適量 （約10 mL），加純化水10 mL稀釋，用三氯甲烷15 mL振搖萃取，共萃取3次，收集水層，用水飽和正丁醇15mL振搖萃取，共萃取4次，收集合并正丁醇液，再用0.5%氫氧化鈉溶液10mL洗滌，共洗滌2次，然后再用正丁醇飽和水10 mL洗滌，共洗滌2次，水浴蒸干合并的正丁醇液后，用75%甲醇溶解殘渣，10mL量瓶定容，搖勻后，用微孔濾膜 （0.45μm）濾過，即得。

2.5.4 空白溶液 取缺黃芪藥材的制劑，按 “2.5.3”項下制法制備。色譜見圖2。

圖2 高效液相色譜圖

2.6 單因素考察澄清劑除雜工藝

2.6.1 加入KBT-ZTC兩組分順序?qū)兓s效果的影響

按說明書的要求及注意事項操作，結(jié)合本實驗需處理的提取液pH情況，確定KBT-ZTC澄清劑在實驗中的加入順序為先B組分后A組分，且比例為2∶1。

2.6.2 澄清劑用量對純化除雜效果的影響 取含生藥量濃度為1∶7的提取液各100 mL，先按百分體積用量分別為2%、3%、4%、5%、6%加入KBT-ZTC澄清劑B組分，在50℃條件下攪拌10min，再保溫20min，然后按百分體積用量分別為1%、1.5%、2%、2.5%、3%加入KBT-ZTC澄清劑A組分，在50℃條件下攪拌10min，再保溫20 min，過夜靜置24 h后濾過，濾液定容至100 mL，測定固形物去除率、黃芪甲苷和淫羊藿苷保留率，結(jié)果表明KBT-ZTC用量對澄清效果影響明顯，固形物去除率隨著KBT-ZTC用量增加同時也增大，而黃芪甲苷、淫羊藿苷保留率則隨之下降。

2.6.3 水提液濃度、操作溫度、保溫時間、攪拌速度及持續(xù)時間對純化除雜效果的影響 取含生藥量濃度為1∶7的水提液進(jìn)行單因素試驗，其中B/A組分用量分別為3%和 1.5%，其他操作參照 “2.6.2”項下方法。結(jié)果表明水提液濃度、攪拌速度對純化除雜效果影響較大，而攪拌持續(xù)時間及保溫時間影響較小，因此，保溫10 min，攪拌持續(xù)10 min，就可達(dá)到滿意的純化除雜效果。

2.7 正交設(shè)計篩選除雜工藝條件 根據(jù)上述實驗結(jié)果，選擇澄清劑B/A組分加入量、水提液濃度、攪拌速度3個因素作為考察因素，以固形物保留率及黃芪甲苷、淫羊藿苷的含有量作為綜合評價指標(biāo)，按L9（34）正交表安排試驗方案。取生藥量為1∶7的濃縮液100 ML，加5%B組分，攪拌，混合均勻 （50℃保溫）10 min，靜置20 min（50℃保溫），再加5%A組分，混合均勻 （50℃保溫）10 Min，靜置20 min（50℃保溫），觀察。因素水平見表1，實驗結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

表1 正交實驗因素水平

表2正交實驗及結(jié)果

表3方差分析結(jié)果

由表2可知，各因素對KBT-ZTC澄清劑的純化除雜效果影響大小依次為A＞B＞C，即水提液濃度＞KBT-ZTC澄清劑加入量＞攪拌速度。由直觀分析最佳方案為A2B2C2。方差分析顯示A、B因素對純化除雜效果影響有顯著性差異，C因素?zé)o顯著性差異（見表3）；考慮到攪拌速度的便利性并結(jié)合單因素試驗優(yōu)選出KBT-ZTC的澄清純化最佳工藝條件為A2B2C1，驗證試驗結(jié)果見表4。

表4驗證試驗（n=3）

表4說明該澄清純化工藝條件穩(wěn)定、可行。因此，確定最佳工藝條件為A2B2C1，即取生藥量濃度為1∶7的提取液，在50℃條件下先滴加3%的B組分，100 r/min攪拌10 min，然后50℃條件下水浴保溫20 min；再滴加1.5%的A組分，100 r/min攪拌10 min，50℃條件下水浴保溫20min；過夜靜置24 h，濾過，即得。

2.8 不同工藝的純化效果比較 量取100 mL生藥量濃度1∶7的水提液，加入乙醇，分3次加入，邊加邊攪拌，使含醇量達(dá)到55%，過夜靜置24 h，過濾，然后濃縮至無醇味，再用純化水定容至100 mL，制備得水醇法樣品。另取100 mL生藥量濃度1∶7的水提液，在50℃下先加入KBTZTC澄清劑B組分3%，攪拌10 min，50℃水浴保溫20 min；再加入A組分1.5%，攪拌10 min，50℃水浴保溫20 min；過夜靜置24 h，濾過，100mL量瓶定容，制備得澄清法樣品。再取100 mL的1∶7的水提液，作為水提液原液，以上3種樣品按樣品測定方法進(jìn)行處理，分別測定浸膏得率、固形物去除率、淫羊藿苷、黃芪甲苷，結(jié)果見表5。

表5 不同工藝的純化效果比較（n=3）

由表5可知，水醇法處理后，固形物去除率為24.25%，而淫羊藿苷保留率和黃芪甲苷保留率分別為43.56%和47.65%；經(jīng)澄清劑處理后固形物去除率為22.42%，而淫羊藿苷保留率和黃芪甲苷保留率分別為85.54%和86.35%，說明水醇法和澄清法在沉淀除雜方面差異不大，但水醇法對有效成分吸附多，導(dǎo)致?lián)p失較多，結(jié)果表明澄清劑法效果優(yōu)。

3 討論

絮凝澄清法是在混懸的中藥提取液中加入絮凝劑 （澄清劑），通過電中和、吸附架橋、網(wǎng)捕和卷掃作用，使體系中懸浮物及膠體粒子絮凝沉淀，以達(dá)到分離純化的一種方法。傳統(tǒng)的水提醇沉法對有效成分損失率極高，而KBTZTC絮凝澄清劑既能極大程度地保留有效成分又能澄清藥液，達(dá)到除雜目的。

醇沉法在制藥工業(yè)上較為常用，大量的親水雜質(zhì)如淀粉、蛋白質(zhì)雜質(zhì)均可沉淀，但有效成分的損失也較大。此外，經(jīng)醇沉后藥液的黏性較大，濃縮較難，生產(chǎn)周期較長，導(dǎo)致成本增高。而澄清法有效成分損失少，易于濃縮，工藝簡單、且成本低。本實驗通過采用澄清法純化補腎溫肺合劑水提液并與醇沉法比較，研究表明：在固形物保留率上兩者無明顯差別，而兩種有效成分淫羊藿苷保留率和黃芪甲苷保留率明顯高于醇沉法。因此，KBT-ZTC澄清劑可用于補腎溫肺合劑水提液的純化除雜。

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R284.2

：B

：1001-1528（2015）05-1127-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.05.047

2014-05-18

湖南省中醫(yī)藥科研計劃項目 （2010117）；湖南省教育廳科學(xué)研究項目 （12C1187）；2012年株洲市科學(xué)技術(shù)局科研項目 （33）

馮傳平 （1976—），男，碩士，副教授，從事藥物制劑與藥物分析的教學(xué)、科研及管理工作。Tel：18908439690，E-mail：everyday76@163.com