實時細胞電子分析應用于復方丹參滴丸質(zhì)量評價的初步研究

雷飛飛， 王建春， 張詠梅， 孫成祥， 潘金火*

（1.南京中醫(yī)藥大學，江蘇南京210046；2.張家港市中醫(yī)醫(yī)院，江蘇蘇州215600）

實時細胞電子分析應用于復方丹參滴丸質(zhì)量評價的初步研究

雷飛飛1， 王建春2， 張詠梅2， 孫成祥1， 潘金火1*

（1.南京中醫(yī)藥大學，江蘇南京210046；2.張家港市中醫(yī)醫(yī)院，江蘇蘇州215600）

目的建立復方藥物復方丹參滴丸 （CDDP）的生物活性檢測方法；將細胞指數(shù)值 （CI）與主要活性成分含有量進行相關性分析，為其質(zhì)量控制提供研究基礎。方法采用實時細胞電子分析技術 （RTCA），測定樣本對不同細胞株的IC50值，篩選出對復方丹參滴丸有特定依賴性的細胞株，對不同批次復方丹參滴丸建立時間劑量依賴性細胞反應曲線（TCRPs），以細胞指數(shù)值 （CI）為考察指標，比較各批次藥物的生物活性；測定復方丹參滴丸主要活性成分含有量，并與生物活性進行相關性分析。結果復方丹參滴丸在一定濃度范圍內(nèi)與空白相比對A549細胞株的增殖有明顯的抑制作用 （P＜0.05），并有明顯的量效關系 （r＞0.9）；由TCRPs反映各批次滴丸質(zhì)量穩(wěn)定，但在特定時間點特定的濃度仍有一定差異，今后可用于同種藥物不同批次間的穩(wěn)定性研究；相關性結果表明復方丹參滴丸生物活性與丹參素含有量有顯著性相關 （P＜0.05）。結論說明本技術能反映復方丹參滴丸生物活性，可與化學成分分析方法結合共同把關中藥質(zhì)量。

復方丹參滴丸；實時細胞電子分析技術；質(zhì)量評價；相關性

中藥質(zhì)量控制與評價的根本目的和最終目標是要保證其臨床使用的安全、有效，而現(xiàn)行中藥質(zhì)量標準只通過鑒別、檢查、含量測定等手段控制中藥質(zhì)量，這只是立求保證中藥質(zhì)量在化學層面的均一與穩(wěn)定，中藥質(zhì)量控制與評價模式基本上是 “惟成分論”，既難以保證中藥內(nèi)在質(zhì)量的真正穩(wěn)定、可控，更無法保證其臨床使用的切實安全、有效。生物活性 （效價）測定則是一步到位直接考察藥物安全性和有效性的質(zhì)控方法，中藥質(zhì)量生物控制已成為中藥質(zhì)量控制研究發(fā)展的趨勢［1-4］。

本實驗采用了一種新型的生物活性檢測方法：實時細胞電子分析技術（RTCA）。RTCA是一種實時、定量檢測細胞形態(tài)和分化增殖改變的細胞阻抗測試微電子傳感器技術，其以細胞電子阻抗為原理，系統(tǒng)的核心是把微電子細胞傳感器芯片整合到表面適于細胞貼附與生長的細胞檢測板的底部或細胞浸潤遷移板的微孔膜上，加入細胞后，黏附在檢測板底部的細胞數(shù)量決定了細胞指數(shù)值的大小，黏附在電極表面的細胞越多，電阻抗越高，細胞指數(shù)值越大。通過細胞指數(shù)值（CI）間接反映藥物對細胞作用 （促進或抑制）的強弱，并可據(jù)此評價藥物的生物活性。該技術完全有別于傳統(tǒng)的細胞檢測方法，可以實現(xiàn)無標記、全過程動態(tài)跟蹤，在藥物量效關系指標的測定中具有突出優(yōu)勢。當前已有部分研究者將這種方法應用于中藥研究中，F(xiàn)u等［5］研究表明實時細胞電子分析技術能直觀地反應出中藥活性成分對細胞產(chǎn)生的影響，該技術可應用于中藥分析領域。

目前本課題組主要將此方法應用于活血化瘀類藥中的單味藥材的質(zhì)量評價［6］。本研究是運用實時細胞電子分析技術對活血化瘀類復方藥物復方丹參滴丸 （CDDP）進行生物檢測，并與化學分析結果進行相關性分析，希望為中藥質(zhì)量標準研究提供一種具有良好普適性和實用性，能定量表征中藥生物活性的新思路與新方法。

1 儀器和材料

96孔細胞培養(yǎng)板 （美國Costar公司）；實時細胞電子分析儀 ［艾森生物 （杭州）有限公司］；Waters2695高效液相色譜儀 （美國沃特世公司）；島津AUX220分析天平（萬分之一）、島津AUW220D分析天平 （十萬分之一）、SCQ-250超聲波清洗器 （上海聲浦超聲波設備廠）；胎牛血清、磷酸鹽緩沖液 （PBS）、胰酶細胞消化液 （杭州四季青公司）；RPMI-1640培養(yǎng)液（美國Gibco公司）；二甲亞砜（DMSO）等試劑均為國產(chǎn)分析純；對照品丹參素鈉、丹參素、丹酚酸B、原兒茶醛、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1均購于中國藥品生物制品檢定所，純度均大于98%；肺癌A549等細胞株購于美國模式培養(yǎng)物集存庫（ATCC）；復方丹參滴丸 （天津天士力制藥集團股份有限公司）批次分別為 130121、130420、130315、130301、130105，經(jīng)鑒定符合 《中國藥典》2010年版規(guī)定。

2 試驗方法

2.1 細胞培養(yǎng) 肺癌A549細胞、HeLa細胞、人乳腺癌MDA-MB-231細胞（雌激素受體陰性，her2陰性）、人乳腺癌MCF-7細胞（雌激素受體陽性，her2陰性）用含10%胎牛血清的RPMI-1640作培養(yǎng)液，置于37℃，含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2 供試品溶液的制備 取復方丹參滴丸適量，置于研缽內(nèi)搗碎，取1.35 g，精密稱定，置于25 ML量瓶內(nèi)，加入適量純凈水，超聲30 min溶解，再加入純凈水定容至刻度，4℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 特定依賴性細胞株的篩選 RTCA測定樣本的TCRPs（時間劑量依賴性細胞反應曲線）。首先在細胞檢測板的每個小孔中加入生長介質(zhì)50μL，再加入密度為2×105個/mL的特定細胞懸液100μL，將此包含一定細胞數(shù)量的檢測板在室溫放置約30min后放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并進行連續(xù)讀數(shù)，當細胞數(shù)量達到穩(wěn)定時（約18～24 h），除空白組外，其余給藥組將配好的藥液加入小孔內(nèi)，使小孔內(nèi)的藥液終質(zhì)量濃度分別為 0.015、0.044、0.133、0.4、1.2、3.6、10.8 mg/mL，將加好樣的檢測板放入實時細胞電子分析儀中，設定好參數(shù)，采用實時細胞電子分析技術測出各藥液作用于該細胞株后所產(chǎn)生的TCRPs，同時系統(tǒng)計算出IC50，通過IC50數(shù)值，篩選出對復方丹參滴丸具有較好依賴性的細胞株。

2.4 復方丹參滴丸主要化學成分定量測定 參照文獻［8］，采用HPLC法分別同時測定復方丹參滴丸內(nèi)丹參素、原兒茶醛、丹酚酸B和三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、Rb1的含有量。丹參酚酸類3種成分采用C18柱，流動相A為0.02%磷酸-水，B為0.02%磷酸-乙腈梯度洗脫，0 min 8%B，8 min 18%B，15 min 21%B，40 min 34%B，體積流量1 mL/min，檢測波長280 nm，柱溫30℃。三七皂苷類3種成分采用C18柱，流動相A為0.01%醋酸-乙腈，B為0.01%醋酸-水梯度洗脫，0 min 20%B，40 min 20%B，55 min 35%B，65min 38%B，體積流量1mL/min，檢測波長203 nm，柱溫30℃。

2.5 不同批號復方丹參滴丸TCRPs的測定 方法同特定依賴性細胞株的篩選。測定不同批號的復方丹參滴丸樣品溶液加入細胞培養(yǎng)板小孔內(nèi)質(zhì)量濃度分別為0.95、1.18、1.47、1.84、2.3、2.88、3.6 mg/mL的TCRPs。

2.6 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 16.0分析生物檢測結果與化學成分結果相關性。

3 結果

3.1 特定依賴性細胞株的篩選 采用RTCA測定樣本對不同細胞株的TCRPs。同一樣本作用于不同細胞株的TCRPs有較大差異，由RTCA測得的IC50見表1。根據(jù)結果顯示，復方丹參滴丸對這4種細胞的增殖均有明顯的抑制作用，但不同細胞對復方丹參滴丸的敏感度存在一定差異，MCF-7及A549細胞的敏感度較MDA-MB-231與HeLa好，但MCF-7較A549過于敏感，經(jīng)分析比較，選擇肺癌A549細胞進行對復方丹參滴丸的研究。樣本作用于肺癌 A549細胞株的TCRPs如圖1所示。

圖1 樣本作用于A549細胞株的TCRPs

RTCA測定的加藥后48 h時的IC50值見表1。

表1 48 h時不同細胞株的IC50

3.2 復方丹參滴丸內(nèi)主要化學成分定量測定 參考文獻，測定了復方丹參滴丸內(nèi)6種主要成分的含有量，結果見表2。

表2 復方丹參滴丸中主要成分測定結果 （Mg·g-1）

3.3 RTCA測得的各樣本作用于肺癌A549細胞株的TCRPs

各樣本作用于肺癌A549細胞株的TCRPs曲線如圖2～7所示，可以由圖實時觀察出細胞生長動態(tài)趨勢。從圖2～6可以看出TCRPs曲線有高度相似性，表現(xiàn)出各批次復方丹參滴丸質(zhì)量的穩(wěn)定性，符合各文獻關于研究不同批次復方丹參滴丸穩(wěn)定性的報道。

圖2 樣本批號13021作用于肺癌A549細胞株的TCRPs

圖3 樣本批號130420作用于肺癌A549細胞株的TCRPs

圖4 樣本批號130315作用于肺癌A549細胞株的TCRPs

經(jīng)篩選，各批號復方丹參滴丸在特定時間點即60 h時，質(zhì)量濃度為0.95～2.88 mg/mL時，細胞指數(shù)值（CI）與藥液濃度的對數(shù)值lgC呈現(xiàn)較好的量效關系，r＞0.9，且在該時間點，各批次不同質(zhì)量濃度復方丹參滴丸與空白相比對A549細胞株增殖均有顯著的抑制作用 （P＜0.05），精密度與穩(wěn)定性均較好，所以選取60 h為分析的最佳時間點。60 h時的不同樣本濃度的指數(shù)值lgC與細胞指數(shù)值CI結果如表3所示。當樣本質(zhì)量濃度為1.84 mg/mL時，不同批次復方丹參滴丸的CI值均有顯著性差異 （P＜0.05），可區(qū)分出在該質(zhì)量濃度各批次復方丹參滴丸生物活性有一定差異，從分析結果可得出在1.84mg/mL時各批次生物活性強弱順序為130301＞130315＞130420＞130121＞130105，此法今后可用于復方丹參滴丸質(zhì)量評價中的穩(wěn)定性研究中。

圖5 樣本批號130301作用于肺癌A549細胞株的TCRPs

圖6 樣本批號130105作用于肺癌A549細胞株的TCRPs

圖7 丹參素對照品作用于肺癌A549細胞株的TCRPs

《中國藥典》2010年版控制復方丹參滴丸的指標性成分為丹參素，根據(jù)本實驗所測樣品中丹參素的量，配制了與成藥含相同質(zhì)量濃度的丹參素的對照品樣本，圖7發(fā)現(xiàn)，與空白相比，丹參素對A549細胞增殖抑制作用很小，量效關系不明顯，說明丹參素的作用不能等同于整個成藥的藥效，丹參素的量也不能全面代表成藥的質(zhì)量。所以控制單一指標性成分的含有量，并不能保證藥物的療效，也無法控制藥物的質(zhì)量。

表3 細胞指數(shù)值CI與不同樣本濃度的指數(shù)值lgC關系

3.4 生物活性檢測與化學成分分析結果的相關性分析 運用SPSS 16.0將復方丹參滴丸藥液質(zhì)量濃度為1.84 mg/mL時的細胞指數(shù)值與各化學成分含有量進行相關性分析，分析結果見表4，結果表明，復方丹參滴丸的生物活性與丹參素的含有量有顯著性相關 （P＜0.05），與其他成分未見顯著性相關 （P＞0.05）。細胞指數(shù)值與丹參素含有量的Pearson相關系數(shù)r=-0.915，P=0.029＜0.05，說明丹參素含有量越高，細胞指數(shù)值越低，存活的細胞數(shù)量越少，其抑制細胞生長的活性越強。一定程度上說明以丹參素含有量作為指標性成分控制整個成藥質(zhì)量有一定依據(jù)，但是應結合生物活性測定方法共同把關中藥質(zhì)量。

表4 復方丹參滴丸細胞指數(shù)值與化學成分相關性分析

4 討論

實驗過程中比較了復方丹參滴丸作用于不同細胞株產(chǎn)生的細胞曲線有很大的差異，而其不同樣本作用于某種特定細胞株產(chǎn)生的細胞曲線有高度相似性。說明復方丹參滴丸作用于某種特定依賴的細胞株后可產(chǎn)生獨特專屬的TCRPs曲線。RTCA普適性好、實時在線、客觀靈敏，無需標記，對細胞無創(chuàng)傷，在最接近生理狀態(tài)下獲得檢測結果，實驗過程中參數(shù)少，數(shù)據(jù)處理快速方便，符合中藥藥效和質(zhì)量評價的客觀現(xiàn)實和發(fā)展方向［8］。

本實驗應用實時細胞電子分析技術篩選出對活血化瘀類復方藥復方丹參滴丸具有特定依賴性的細胞株，測定不同批次復方丹參滴丸的細胞指數(shù)值 （CI），從而評價各批次復方丹參滴丸的質(zhì)量，并根據(jù)不同的細胞指數(shù)值 （CI）與該藥物的主要化學成分進行相關性分析，得出其與丹參素含有量顯著相關，這說明 《中國藥典》規(guī)定通過測定其中丹參素的含有量控制整體藥物質(zhì)量有一定依據(jù)，深入研究化學成分分析和生物活性評價來共同把關中藥質(zhì)量有很大的可行性。

本實驗運用的新型技術實時細胞電子分析技術現(xiàn)主要應用于抗腫瘤藥物的篩選，對貼壁類腫瘤細胞更具有靈敏度，而將該技術運用于中藥復方質(zhì)量評價方面仍處于初步階段，經(jīng)查閱大量文獻表明活血化瘀類中藥能改善微循環(huán)，增加血管通透性，抑制腫瘤血管生成［9-10］，本實驗所選擇的活血化瘀類復方藥物復方丹參滴丸屬于活血化瘀類藥的代表，實驗設計時從復方丹參滴丸活血化瘀的整體作用出發(fā)，利用其對癌細胞的生長抑制作用，檢測出不同的細胞指數(shù)值，以期評價藥物的生物活性。實驗中選取了4種貼壁細胞：肺癌A549細胞、HeLa細胞、人乳腺癌MDA-MB-231細胞 （雌激素受體陰性，her2陰性）、人乳腺癌MCF-7細胞 （雌激素受體陽性，her2陰性）進行試驗，從中篩選對復方丹參滴丸有特定依賴性的細胞株。本研究的關鍵是正確選擇對被測中藥具有特定依賴和高度靈敏的細胞株，雖然實驗前期進行了大量預實驗，但細胞篩選方面仍需做很多工作，在今后的實驗中仍要加大細胞株的篩選，以期為將此技術應用于中藥質(zhì)量評價方面提供更科學的依據(jù)。在后續(xù)的研究中，將嘗試應用RTCA定量檢測中藥質(zhì)量，并結合體內(nèi)外藥效學試驗來進一步驗證該方法應用于中藥質(zhì)量評價方面的可行性。

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R285.5

：B

：1001-1528（2015）05-1119-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.05.045

2014-06-05

學校重點培育課題 （10xpy01）

雷飛飛（1988—），女，碩士生，研究方向為中藥新劑型新技術。Tel：15105161306，E-mail：leifeifei0831@163.com

*通信作者：潘金火 （1963—），男，教授，研究方向為中藥新劑型工藝及中藥質(zhì)量標準。Tel：（025）85811517，E-mail：panjinhuo@ 163.com