茺蔚子藥材儲藏過程中水蘇堿變化的影響因素分析

張美玲， 遲鐵錚， 單英俏， 姜麗嬌， 于 野， 貢濟(jì)宇*， 蔡廣知*

（1.長春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林長春130117；2.吉林市人民醫(yī)院，吉林吉林132001）

茺蔚子藥材儲藏過程中水蘇堿變化的影響因素分析

張美玲1， 遲鐵錚2， 單英俏1， 姜麗嬌1， 于 野1， 貢濟(jì)宇1*， 蔡廣知1*

（1.長春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林長春130117；2.吉林市人民醫(yī)院，吉林吉林132001）

目的以水蘇堿為指標(biāo)來考察影響茺蔚子藥材儲藏過程中水蘇堿含有量的因素及其變化趨勢。方法采用HPLC-ELSD法測定不同產(chǎn)地茺蔚子中水蘇堿，選用以氨基鍵合聚合物為填充劑的色譜柱 （4.6 mm×250 mm，5μm），流動相為乙腈-0.2%醋酸溶液 （84∶16）；體積流量為1.0 mL/min，柱溫是35℃，蒸發(fā)光閃射檢測器?？疾鞙囟取⒐庹蘸蜁r間對茺蔚子中水蘇堿的影響。結(jié)果方法平均回收率為98.3%，RSD=1.1%。不同產(chǎn)地的茺蔚子藥材中水蘇堿的含有量為2.19～3.13 mg/g；溫度對鹽酸水蘇堿的含有量無影響；光照儲存7個月后藥材中水蘇堿的含有量降低44.34%；儲存24個月藥材中水蘇堿的含有量下降18.83%。結(jié)論建立了茺蔚子藥材的成分定量測定方法，填補(bǔ)了藥材標(biāo)準(zhǔn)的空缺；光照條件下，茺蔚子藥材中水蘇堿含有量明顯下降，水蘇堿見光易降解，故茺蔚子藥材、飲片及其相關(guān)制劑在儲存或生產(chǎn)過程中均需要避光保存。盡量縮短藥材周轉(zhuǎn)期。

茺蔚子；高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法；鹽酸水蘇堿；影響因素

茺蔚子為唇形科植物益母草Leonurus japonicus Houtt.的干燥成熟果實(shí)［1］，具有活血調(diào)經(jīng)，清肝明目的功效［2］，為常用的婦科用中藥，全國大部分地區(qū)均有分布。含益母草寧堿、水蘇堿及脂肪油［3］，油酸及亞麻酸占油總量的84.84%，另含維生素A樣物質(zhì)［4］。2010年版 《中國藥典》中茺蔚子藥材標(biāo)準(zhǔn)無成分定量測定項(xiàng)，水蘇堿是茺蔚子中的主要活性成分之一，本實(shí)驗(yàn)擬建立茺蔚子中水蘇堿的HPLC-ELSD定量測定法，并對藥材中水蘇堿的影響因素及變化趨勢進(jìn)行分析。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 安捷倫1100高效液相色譜儀，SEDEX 55蒸發(fā)光散射檢測器，自動進(jìn)樣器，安捷倫液相色譜工作站，Asahipak NH2P-50 4E色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；超聲波提取器（昆山禾創(chuàng)超聲儀有限公司）；AL204型萬分之一電子天平 （瑞士），AB135-S型十萬分之一電子天平（瑞士）。

1.2 試藥 鹽酸水蘇堿對照品 （批號110712-201010，購于中國食品藥品檢定研究院）；藥材采自全國各地；乙腈為色譜純，水為超純水；醋酸為優(yōu)級純，其他試劑均為分析純。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備 精密稱取鹽酸水蘇堿對照品4.87 mg，置10 mL棕色量瓶中，加70%乙醇溶解，定容至刻度，搖勻，即得。

2.2 供試品溶液的制備 取茺蔚子藥材粉末 （過三號篩）約3 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%乙醇補(bǔ)足失質(zhì)量，搖勻，微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.3 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 氨基鍵合聚合物為填充劑的Asahipak NH2P-50 4E色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相為乙腈-0.2%醋酸溶液 （84∶16）；體積流量1 mL/min；柱溫35℃；SEDEX 55蒸發(fā)光散射檢測器 （漂移管溫度35℃，壓力為2.2 bar），進(jìn)樣量為5μL。理論塔板數(shù)按鹽酸水蘇堿計應(yīng)不低于6 000。對照品和供試品色譜圖見圖1和圖2。

圖1 鹽酸水蘇堿對照品色譜圖Fig.1 HPLC chromatograMof stachydrine reference substance

圖2 茺蔚子色譜圖Fig.2 HPLC chromatograMof Leonuri Fructus

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證試驗(yàn)

2.4.1 線性關(guān)系考察 分別精密吸取上述鹽酸水蘇堿對照品溶液 （每1 mL含對照品0.487 mg）1、3、5、7、9μL，注入液相色譜儀，以進(jìn)樣量（μg）取對數(shù)為橫坐標(biāo)，峰面積積分值取對數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。計算得回歸方程 y= 1.550 3x+2.149 5，r=0.999 9，表明鹽酸水蘇堿在0.487～4.383μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一鹽酸水蘇堿對照品溶液及供試品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，每次5μL，測得鹽酸水蘇堿峰面積的RSD分別為1.2%、1.9%，表明儀器的精密度良好。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批茺蔚子藥材6份，精密稱定，按 “2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，依法測定，測得水蘇堿RSD為1.7%，平均含有量為2.62 mg/g，表明方法重復(fù)性良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液及對照品溶液各 5μL，分別在 0、2、4、8、12、24 h注進(jìn)樣測定，測得鹽酸水蘇堿峰面積的RSD分別為1.0%、1.5%，表明鹽酸水蘇堿對照品溶液和供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含有量的樣品6份，每份約1.5 g，置錐形瓶中，分別精密加入鹽酸水蘇堿對照品適量，按 “2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，依法測定，計算回收率，結(jié)果鹽酸水蘇堿的平均回收率為98.3%，RSD為1.1%，說明本方法準(zhǔn)確度良好。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Results of recovery tests

2.5 樣品測定 取16份不同產(chǎn)地的茺蔚子藥材，按 “2.2”項(xiàng)下方法各平行制備兩份供試品溶液，按 “2.3”項(xiàng)下條件測定，記錄水蘇堿峰面積并計算，結(jié)果見表2。

2.6 影響因素考察

2.6.1 溫度控制 取茺蔚子3批每批9份樣品（每份100 g，置白色透明玻璃瓶），分別放于（15±1）℃、 （25±1）℃和 （35±1）℃恒溫箱中，每批每箱3份，用黑色不透光的紙包裹，每個月取適量樣品，按上述方法制備樣品溶液并測定水蘇堿量。

表2 不同產(chǎn)地茺蔚子藥材中鹽酸水蘇堿的測定Tab.2 DeterMination of the content of stachydrine nydro chloride in Leonuri Fructus froMdifferen t grow ing areas

2.6.2 光照控制 取茺蔚子3批每批6份樣品（每份100 g，置白色透明玻璃瓶），放于留樣室同一地點(diǎn)的樣品架，每批次取3份，避光保存 （黑色遮光紙包裹），另9瓶見光保存 （白色透明玻璃瓶），每月取上述條件儲存的樣品適量，按上述方法制備樣品溶液并測定水蘇堿量。

2.6.3 儲存時間考察 取茺蔚子3批每批3份樣品，25℃避光放置 （黑色遮光紙包裹），定期取上述條件儲存樣品適量，按上述方法制備樣品溶液并測定水蘇堿量。

2.7 影響因素考察結(jié)果

2.7.1 溫度對水蘇堿的影響 在 （15±1）℃、（25±1）℃ 和 （35±1）℃條件下，儲存7個月后茺蔚子中水蘇堿平均含有量分別下降 2.30%、2.30%和2.60%，說明溫度對藥材中水蘇堿的含有量影響較小。結(jié)果見圖3。

圖3 溫度對茺蔚子藥材中鹽酸水蘇堿的影響Fig.3 Effect of teMperature on the contents of hydrochloric stachydrine in Leonuri Fructus medicinalmaterials

2.7.2 光照對水蘇堿的影響 光照對茺蔚子中水蘇堿的含有量有顯著影響，避光保存7個月，3批產(chǎn)品中水蘇堿的平均含有量為3.22 mg/g，見光保存，水蘇堿的平均含有量為1.79 mg/g，含有量降低44.34%，見光降解為水蘇堿含有量下降的主要原因。結(jié)果如圖4。

圖4 光照對茺蔚子中水蘇堿的影響Fig.4 Effect of light on the contents of hydrochloric stachydrine in Leonuri Fructus medicinalmaterials

2.7.3 儲存時間考察結(jié)果 隨儲存時間的延長，茺蔚子中水蘇堿的含有量逐步減少，到24個月時，水蘇堿含有量下降18.83%。結(jié)果見表3。

表3 儲存時間對茺蔚子中水蘇堿的影響Tab.3 E ffect of storage time on the content of of hydroch loric stachydrine in Leonuri Fructus medicinalmaterials

3 討論

《中國藥典》2010年版中茺蔚子藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中只作了定性鑒別規(guī)定，沒有成分定量測定的具體標(biāo)準(zhǔn)，本實(shí)驗(yàn)建立了茺蔚子藥材中水蘇堿的HPLC-ELSD測定方法，水蘇堿屬于季銨堿，最大吸收波長192 nm也僅有微弱吸收，使用紫外檢測器有信號響應(yīng)值小、基線噪音大、基線不易穩(wěn)定等因素影響測定結(jié)果，蒸發(fā)光散射檢測器能克服上述缺點(diǎn)［5-9］，所以采用通用型檢測器蒸發(fā)光散射檢測器進(jìn)行檢測。

實(shí)驗(yàn)參數(shù)及條件的考察。供試品溶液的制備時，曾比較乙醇、70%乙醇和鹽酸甲醇3種溶劑的提取效果［10-12］，提取的完全程度70%乙醇 ＞乙醇＞鹽酸甲醇；提取方法考察了加熱回流法和超聲提取法，兩法提取效果沒有差異，故選擇簡便、省時的超聲提取法。曾考察 《中國藥典》2010年版益母草藥材中鹽酸水蘇堿含量測定的色譜條件，色譜柱選用丙烯酰胺鍵合硅膠（Venusil HILIC4.6 mm×250 mm）作為填充劑［1］，結(jié)果表明，該類色譜柱的基線噪音較高，無法達(dá)到定量要求。后采用氨基鍵合聚合物（Asahipak NH2P50 4E 4.6 mm×250 mm）作為填充劑，結(jié)果表明，基線噪音低，重復(fù)性好，能夠滿足定量要求，故選擇氨基鍵合聚合物為填充劑的色譜柱進(jìn)行測定。經(jīng)比較乙腈-0.2%磷酸溶液 （80∶20）與乙腈-0.2%磷酸溶液（84∶16）兩種流動相，結(jié)果乙腈-0.2%磷酸溶液（84∶16）作為流動相時，色譜峰分離度高，無拖尾，陰性無干擾，因此選擇乙腈-0.2%磷酸溶液（84∶16）作為流動相。

不同產(chǎn)地的茺蔚子中水蘇堿的含有量存在較大差異，其中遼寧省大洼縣所產(chǎn)茺蔚子中水蘇堿的含有量最高，16份不同產(chǎn)地的茺蔚子中水蘇堿的平均含有量為2.63 mg/g，乘以系數(shù)0.8，水蘇堿的量為2.10 mg/g，可作為茺蔚子藥材質(zhì)量評價的參考標(biāo)準(zhǔn)。

茺蔚子中水蘇堿含有量的影響因素結(jié)果顯示水蘇堿見光易降解［13-14］，故茺蔚子藥材儲藏過程中應(yīng)常溫、避光保存，保存期應(yīng)控制在24個月內(nèi)。本實(shí)驗(yàn)對于指導(dǎo)茺蔚子藥材及其制劑產(chǎn)品的規(guī)范化生產(chǎn)及安全有效使用具有現(xiàn)實(shí)意義。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：2010年版一部［S］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：225，272-273.

［2］張蓮珠，王會弟.茺蔚子研究進(jìn)展［J］.長春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2012，28（5）：920-921.

［3］林文群，陳 忠.茺蔚子化學(xué)成分的分離與鑒定［J］.福建師范大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2002，6（3）：146-147.

［4］高 佳，蔡廣知，貢濟(jì)宇，等.茺蔚子脂肪酸成分研究［J］.長春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2006，9（3）：49-50.

［5］劉凡凡，趙志強(qiáng)，龐麗華.HPLC-ELSD測定益母草顆粒中鹽酸水蘇堿含量［J］.亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2014，10（4）：56-58.

［6］李存金，郭飛宇.HPLC-ELSD測定復(fù)方益母草膠囊中鹽酸水蘇堿的含量［J］.中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2013，30（1）：72-74.

［7］王 坤，謝強(qiáng)勝.安宮止血顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究［J］.中成藥，2014，36（2）：318-320.

［8］陳江濤，王麗麗.高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測器法測定婦康寧片中鹽酸水蘇堿含量［J］.中國藥業(yè)，2014，23（12）：71-73.

［9］徐端瓊.HPLC-ELSD測定益母草顆粒中鹽酸水蘇堿的含量［J］.中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2013，30（2）：189-191.

［10］袁王俊，張維瑞，李 勉，等.不同產(chǎn)地益母草中總生物堿含量的比較［J］.河南大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2013，32（1）：38-39，65.

［11］林家壽.不同地區(qū)益母草的水蘇堿含量比較［J］.中國醫(yī)藥指南，2011，9（8）：32-33.

［12］南小航，宋 婷，彭 菲，等.不同產(chǎn)地益母草飲片中鹽酸水蘇堿含量差異分析［J］.湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2012，32（1）：40-42.

［13］黃鳴清，陳瑞云，謝友良，等.鹽酸水蘇堿在中藥生產(chǎn)過程中的含量變化及影響因素研究［J］.時珍國醫(yī)國藥，2009，20（10）：2587-2598.

［14］王 玉，郭茂鳳，徐 艷，等.益母草膏存儲過程中的水蘇堿的含量變化及影響因素［J］.環(huán)球中醫(yī)藥，2012，5（5）：362-363.

Influencing factors in the change of stachydrine hydrochloride in Leonuri Fructus during storage

ZHANGMei-ling1， CHITie-zheng2， SHAN Ying-qiao1， JIANG Li-jiao1， YU Ye1， GONG Ji-yu1*，
CAIGuang-zhi1*
（1.Changchun University of Traditional Chinese Medicine，Changchun 130117，China；2.Jilin City People's Hospital，Jilin 132001，China）

Fructus Leonuri；HPLC-ELSD；stachydrine hydrochloride；influencing factors

R284.1

：A

：1001-1528（2015）05-1056-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.05.028

2014-12-29

吉林省重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目 （20130338SC）

張美玲（1990—），女，碩士生，研究方向?yàn)橹兴幓钚晕镔|(zhì)。E-mail：jlseven-fairy@163.com

*通信作者：貢濟(jì)宇 （1960—），女，教授，研究方向?yàn)樗幬锓治?。Tel：（0431）86172207，E-mail：gjy0431@126.com蔡廣知 （1977—），男，講師，研究方向?yàn)橹兴庤b定及質(zhì)量分析。Tel：13159751573，E-mail：80188429@qq.com