補骨脂中補骨脂素和異補骨脂素測定

趙 婷， 朱汀瀅， 吳 斌

（揚子江藥業(yè)集團上海海尼藥業(yè)有限公司，上海201318）

補骨脂中補骨脂素和異補骨脂素測定

趙 婷， 朱汀瀅， 吳 斌*

（揚子江藥業(yè)集團上海海尼藥業(yè)有限公司，上海201318）

目的根據(jù) 《歐洲藥典》質(zhì)量標準要求，改進補骨脂中補骨脂素和異補骨脂素的HPLC測定方法。方法補骨脂以甲醇提取，YMC-Triart C18色譜柱（4mm×250mm，5μm），流動相為乙腈-水（35∶65），等度洗脫，體積流量為1mL/min，檢測波長為246 nm。結(jié)果補骨脂素和異補骨脂素在10～100μg/mL范圍內(nèi)成線性，并在Merck-LiChrospher RP-18（4 mm×250 mm，5μm）和Waters Spherisorb ODS2 column（4mm×250mm，5μm）色譜柱上可重復實驗結(jié)果，兩成分的定量測定結(jié)果偏差分別為1.50%和1.33%。7個省和緬甸產(chǎn)共16批補骨脂樣品中的補骨脂素和異補骨脂素含有量在1.11% （云南）和0.29% （廣西）之間。結(jié)論建立的方法可符合歐盟植物藥申報專屬性、精密度（日間、日內(nèi)）、準確度的要求。

補骨脂；HPLC；補骨脂素；異補骨脂素；《歐洲藥典》

中藥補骨脂最早收載于 《開寶本草》，是豆科植物補骨脂Psoralea corylifolia L.的干燥成熟果實，別名破故紙、胡韭子、胡故子等。其性溫，味辛，入腎經(jīng)，補腎助陽，在中醫(yī)臨床上主治腎虛泄瀉、陽萎、遺精、尿頻數(shù)、腰膝冷痛、虛寒喘咳等病癥。現(xiàn)代醫(yī)學研究表明，補骨脂還具有抗腫瘤、抗菌、抗骨質(zhì)疏松、抗雌激素樣作用等多種藥理活性，以及治療白癜風、牛皮癬等疾?。?-3］。補骨脂素（psoralen）和異補骨脂素（isopsoralen）屬于呋喃香豆素類化合物，是補骨脂中兩種重要的活性成分。補骨脂素具有抗腫瘤活性，對肉瘤、艾氏腹水瘤和肝癌細胞的生長具有明顯的抑制作用［4］，并且能抑制多巴胺和去甲腎上腺素的轉(zhuǎn)運，可治療帕金森病、抑郁癥、注意力缺陷多動障礙等疾病［5］。另外在體內(nèi)實驗中，它還被證明可以抑制乳腺癌向骨轉(zhuǎn)移［6］。

2005年， 《歐洲藥典》開始進行中藥-植物藥專論的工作，而到2013年為止，約有12%的內(nèi)容與草藥相關(guān)，并且約有187種草藥專論被收錄在《歐洲藥典》中［7］。但目前我國尚無中藥標準被《歐洲藥典》采納，為了今后更多的中藥及中成藥被國際接受，中藥質(zhì)量標準的國際化就顯得非常重要了。

補骨脂屬于首批被推薦入選 《歐洲藥典》的藥材。本實驗分析了先前補骨脂的質(zhì)量研究報道［5-10］，得到高品質(zhì)、高魯棒性 （robustness）的HPLC法，用以定量測定樣品中補骨脂素與異補骨脂素，進而應用于多個產(chǎn)地的補骨脂中，為該藥材的質(zhì)量控制提供較可靠的方法。

1 實驗材料

1.1 儀器 高效液相色譜儀，包括Aglient 1260、G1312C泵、G1314F檢測器、G1316A柱溫箱、G1329B自動進樣器（美國Aglient公司）；AB205十萬分之一電子天平 （瑞士梅特勒-托利多公司）；KQ-250B數(shù)控超聲波清洗儀 （昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥 補骨脂素 （中國食品藥品檢定研究院，批號110739-201115，純度99.3%）；異補骨脂素對照品 （中國食品藥品檢定研究院，批號110738-201313，純度100%）；乙腈為色譜純 （德國Merck公司）；水為超純水 （自制）；其他試劑為分析純 （國藥集團化學試劑有限公司）。

1.3 供試樣品 補骨脂藥材來源于市場購買和采集，經(jīng)上海中醫(yī)藥大學中藥學院生藥教研室張紅梅博士鑒定為豆科植物補骨脂Psoralen corylif olia L.的成熟果實。

2 色譜條件與系統(tǒng)適應性試驗

2.1 《中國藥典》2010年版方法 十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；甲醇-水 （55∶45）為流動相；檢測波長為246 nm；理論板數(shù)按補骨脂素峰計算應不低于3 000［8］。

采用《中國藥典》常用的內(nèi)徑4.6mm的色譜柱（YMC-Triart C18，4.6 mm×250 mm，5μm）及《歐洲藥典》常用的內(nèi)徑4.0 mm的色譜柱（YMC-Triart C18，4.0 mm×250 mm，5μm）進行方法重現(xiàn)。

補骨脂供試品 《中國藥典》法分析色譜圖見圖1?？梢妰煞N內(nèi)徑的補骨脂素及異補骨脂素峰對稱性較差 （內(nèi)徑4.0 mm對稱因子分別為0.79、0.82；內(nèi)徑4.6 mm對稱因子分別為0.79、0.83），不能滿足 《歐洲藥典》對稱性大于0.85的要求，因此我們對此方法進行優(yōu)化。

圖1 《中國藥典》法補骨脂供試品分析Fig.1 HPLC fingerprints of Psoralea corylifolia L.

2.2 優(yōu)化的色譜方法 YMC-Triart C18色譜柱（4 mm×250 mm，5μm）、YMC-Triart C18（4 mm× 250 mm，5μm），流動相為乙腈-水 （35∶65），體積流量1 mL/min；檢測波長246 nm，柱溫30℃。空白溶液、補骨脂素及異補骨脂素混合對照品、補骨脂供試品的色譜圖見圖2。

兩種內(nèi)徑下的對稱性得到了改善 （內(nèi)徑4.0 mm對稱因子分別為0.87和0.88；內(nèi)徑4.6 mm對稱因子分別為0.92和0.96），在4.0 mMYMC色譜柱下，補骨脂素及異補骨脂素的分離度為2.90，滿足 《歐洲藥典》大于1.5的要求，較原 《中國藥典》方法有較大的改善，峰形良好，專屬性強。按照歐洲藥典的要求，本實驗采用YMC-Triart C18（4 mm×250 mm，5μm）進行方法驗證及樣品測定。

3 方法與結(jié)果

圖2 空白溶液 （A）、補骨脂素及異補骨脂素混合對照品4.0 mm柱（B）、補骨脂供試品的HPLC圖-新方法4.0mm柱（C）、補骨脂供試品的HPLC圖-新方法在4.6 mm柱（D）Fig.2 HPLC fingerprints of blank solution（A），Mixed reference of psoralen and isopsoralen（B），test sample of P.corylifolia L.（4.0 mMcolumn）（C），test saMp le of P.corylifolia L.（4.6 mMcolumn）（D）

3.1 對照品溶液的制備 分別精密稱取補骨脂素和異補骨脂素對照品各14 mg，置50 ML量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，緩慢搖勻。分別精密吸取1mL試液置10mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，緩慢搖勻，即得混合對照品溶液。

3.2 供試品溶液的制備 取補骨脂藥材粉碎成細粉，過三號篩。取藥材粉末0.3 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲提取 （功率250W，頻率40 kHz）45 min，放冷，再次稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失的質(zhì)量。過濾，取續(xù)濾液用微孔濾膜 （0.45μm）濾過，作為供試品溶液。

3.3 線性關(guān)系 精密稱取補骨脂素21.73 mg，置100 mL量瓶中，以甲醇稀釋并定容至刻度，搖勻，按倍比稀釋法制成7個系列質(zhì)量濃度的對照品溶液。

精密稱取異補骨脂素10.06 mg，置50 ML量瓶中，以甲醇稀釋并定容至刻度，搖勻，按倍比稀釋法制成7個系列質(zhì)量濃度的對照品溶液。

準確吸取上述對照品溶液10μL，按 “2.2”項色譜條件進行測定，以對照品的質(zhì)量濃度x（μg/mL）為橫坐標，測得的峰面積積分值y為縱坐標繪制標準曲線，兩個成分的線性回歸方程及線性范圍結(jié)果見表1。由表可知，補骨脂素和異補骨脂素在10～100μg/ML的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性良好。

表1 補骨脂素和異補骨脂素的線性方程及線性范圍Tab.1 Linear equation and linear range of psoralen and isopsoralen

3.4 精密度 稱取補骨脂樣品 （1號）6份，按“3.2”項操作，在 “2.2”項條件下進行測定。按上述操作測定3 d，測定補骨脂素和異補骨脂素的量，計算相對標準偏差，結(jié)果見表2，可知該儀器的精密度 （日間、日內(nèi)）良好。

表2 精密度試驗結(jié)果（n=18）Tab.2 Results of intra-day precision（n=18）

3.5 回收率 取補骨脂素和異補骨脂素含有量已知的補骨脂藥材 （1號）粉末0.15 g，精密稱定9份，每3份加入相同量 （分別為已知含有量的50%、100%、150%）的補骨脂素和異補骨脂素對照品，按 “3.2”項操作，在 “2.2”項條件下測定，計算回收率及RSD，結(jié)果見表3和表4，可知該方法準確度良好，加樣回收率數(shù)據(jù)均符合規(guī)定。

表3 補骨脂素加樣回收率試驗結(jié)果 （n=9）Tab.3 Result of recovery tests for psoralen（n=9）

表4 異補骨脂素加樣回收率試驗結(jié)果 （n=9）Tab.4 Result of recovery tests for isopsoralen（n=9）

3.6 穩(wěn)定性 取補骨脂 （1號）粉末0.3 g，精密稱定，按 “供試品溶液制備”項下操作，在上述色譜條件下，分別于0、2、4、6、8、12、24 h進行測定，以補骨脂素和異補骨脂素的峰面積進行考察，計算RSD。結(jié)果顯示，24 h內(nèi)補骨脂素和異補骨脂素的RSD分別為0.93%和1.85%，表明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.7 重復性 取補骨脂樣 （1號）9份 （低、中、高劑量各三份），按 “3.2”項下操作，在 “2.2”項條件下測定，計算各成分量及其相對標準差。結(jié)果表明，補骨脂素的和異補骨脂素的平均含有量分別為0.54%和0.52%，RSD分別為1.03%和1.26%，可知該方法測定補骨脂中補骨脂素的和異補骨脂素的重復性良好。

3.8 耐用性 分別采用Merck Lichrospher RP-18（4 mm×250 mm，5μm）、Waters Spherisorb ODS2 column（4 mm×250 mm，5μm）、YMC-Triart C18（4 mm×250 mm，5μm）三個品牌的色譜柱對補骨脂藥材進行補骨脂素的和異補骨脂素的測定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各色譜柱的分離效果及色譜峰形均較理想，且兩成分的定量測定結(jié)果偏差分別為1.50%和1.33%。同時，對流動相比例、體積流量、柱溫進行耐受性考察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各條件下分離效果理想，且補骨脂素和異補骨脂素的含量測定結(jié)果偏差均小于2.0%。由此可知，該測定方法有較好的耐受性。

4 樣品測定

按 “3.2”項下操作，在 “2.2”項下條件測定16批樣品，結(jié)果見表5。由表可知，不同產(chǎn)地補骨脂中2種成分的含有量差異較大，高者達到1.11% （云南），低者為0.29（廣西），同一產(chǎn)地的補骨脂2種成分的含有量也有較大差異。

表5 多個產(chǎn)地樣品測定結(jié)果Tab.5 Content results of P.corylifolia L.froMdifferent growing areas

5 灰分和酸不溶性灰分

從16批藥材中選取2種成分含有量較高的補骨脂，按照 《歐洲藥典》要求進行灰分和酸不溶性灰分的實驗，結(jié)果見表6。

表6 不同產(chǎn)地補骨脂水分、灰分以及酸不溶性灰分的檢測Tab.6 Test of loss of drying，total ash and ashinsolublein-HCl of P.corylifolia L.

6 討論

文獻［8-15］報道，補骨脂定量測定所采用的流動相以甲醇-水系統(tǒng)為主，另外還有甲醇-乙酸系統(tǒng)，但對色譜柱損害比較大。在 《中國藥典》2010年版中，含量測定采用 “以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇-水 （55∶45）為流動相；檢測波長為246 nm；理論板數(shù)按補骨脂素峰計算應不低于3 000”的方法，其流動相為甲醇-水系統(tǒng)，黏性較大，導致系統(tǒng)壓力很高，而且測定的補骨脂素和異補骨脂素峰形較差。另外，對補骨脂藥材的前處理采用甲醇索氏提取2 h，操作方法繁瑣，時間較長，且精密度較差。

本實驗對提取方式 （超聲提取、加熱回流、索式提?。┻M行考察，同時考察了提取溶媒種類、溶媒用量、提取時間，最終確定采用甲醇50 ML，超聲提取45 min作為供試品溶液的制備方法。經(jīng)驗證，本實驗測定補骨脂中補骨脂素和異補骨脂素的方法專屬性強，在10～100μg/ML范圍內(nèi)成線性關(guān)系，精密度、重復性及準確度良好，穩(wěn)定性較高，耐受性較好，可較有效地監(jiān)控補骨脂藥材的質(zhì)量，符合歐盟植物藥申報專屬性、精密度 （日間及日內(nèi)）、準確度的要求。

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Improvement in deterMination of psoralen and sopsoralen froMPsoralea corylifolia L.

ZHAO Ting， ZHU Ting-ying， WU Bin*
（Shanghai Haini Pharmaceutical Co.，Ltd.，Yangtze River Pharmaceutical Group，Shanghai201318，China）

AIMTo establish an HPLCmethod for determining the contents of psoralen and isopsoralen froMPsoralea corylifolia L.in agreementwith European Pharmacopoeia.METHODSThe analysis of P.corylifolia L methanolic extractwas carried out on YMC-Triart C18（4 mm×250 mm，5μm）column with acetonitrile-water（35∶65）asmobile phase in isocratic elution manner and 1 mL/min of flow speed，and detection wavelength was set at254 nm.RESULTSThe linear relationships of psoralen and isopsoralen were in the range froM10 to 100 μg/mL.The same process was repeated on Merck-LiChrospher RP-18（4 mm×250 mm，5μm）and Waters Spherisorb ODS2 column（4 mm×250 mm，5μm），their biaswere restricted to the limitof1.50%and 1.33%，respectively.The contents of psoralen and isopsoralen collected froMseven provinces in China and Burma fellwithin the range of1.11%（Yunnan Province）and 0.29%（Guanxi Region）.CONCLUSIONThe established method can satisfy the requirements of European Pharmacopoeia in specificity，precision and accuracy of P.corylifolia L.

Psoralea corylifolia L.；HPLC；psoralen；isopsoralen；European Pharmacopoeia

R284.1

：A

：1001-1528（2015）05-1036-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.05.024

2014-12-06

趙 婷 （1984—），女，博士，研究方向為中藥學。

*通信作者：吳 斌 （1976—），男，博士，高級工程師，研究方向為天然藥物化學。Tel：（021）68128999