“益氣化瘀、溫陽利水方”治療肺心病的作用機(jī)理

蔡 敏， 楊興嫕， 史鎖芳

(1. 南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京210029;2. 六安市中醫(yī)院，安徽 六安230006;3. 江蘇省中醫(yī)院，江蘇南京210029)

慢性肺源性心臟病(chronic pulmonary heart disease，CPHD，簡稱肺心病，PHD)是由支氣管-肺組織、胸廓或肺血管病變，導(dǎo)致肺血管阻力增加，產(chǎn)生肺動(dòng)脈高壓，繼而導(dǎo)致右心結(jié)構(gòu)和功能改變的疾?。?］。肺血管舒縮功能異常及重構(gòu)導(dǎo)致的肺動(dòng)脈高壓是本病的發(fā)病基礎(chǔ)，右心結(jié)構(gòu)和功能改變是本病的結(jié)局。研究表明，以上病理變化與多種因子的異常變化及發(fā)生的時(shí)序性密切相關(guān)［2］。其中，血栓 素 (thromboxane，TXA2)、前 列 環(huán) 素 (proctacyclin，PGI2)、血管緊張素Ⅱ(angiotensin，AngⅡ)、心房尿鈉肽(atrial natriuretic peptide，ANP)在肺血管的舒縮及重構(gòu)、心肌重構(gòu)中扮演不同的角色。能夠針對(duì)以上因子進(jìn)行有效的干預(yù)，對(duì)肺心病的治療具有重要的意義。

本病屬于中醫(yī)學(xué)“肺脹”、 “喘病”、 “水腫”等范疇［3］，肺、脾、心、腎虧虛，痰、瘀、水稽留是緩解期的主要病機(jī)。導(dǎo)師史鎖芳教授根據(jù)多年的經(jīng)驗(yàn)，創(chuàng)制“益氣化瘀、溫陽利水方”［4］(黨參、蘇木、生黃芪、漢防己、茯苓、制附片、炒白術(shù)、白芍、葶藶子、桑白皮等)治療本病。既顧肺、脾、心、腎虛衰之本，又可以兼痰、瘀、水三大主要病理因素，臨床應(yīng)用取得了良好的效果?；诒痉脚R床療效，我們?cè)O(shè)計(jì)了該實(shí)驗(yàn)，探討“益氣化瘀、溫陽利水方”的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥物及試劑 “益氣化瘀、溫腎利水方”(黨參、蘇木、生黃芪、漢防己、茯苓、制附片、炒白術(shù)、白芍、葶藶子、桑白皮，由江蘇省中醫(yī)院制劑部制備，質(zhì)量濃度為6 g/mL)，卡托普利(中美上海施貴寶制藥有限公司，批號(hào)1308032)，野百合堿(monocrotaline，MCT，上海遠(yuǎn)慕生物制品有限公司，HPLC ＞99%，批號(hào)131117)，大鼠TXA2、PGI2、AngⅡ、ANP ELISA 試劑盒均由上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司提供，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 動(dòng)物與飼養(yǎng) 清潔級(jí)雄性SD 大鼠60 只，由南京軍區(qū)總院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，合格證號(hào)SCXK (軍)2012-0014。飼養(yǎng)于江蘇省中醫(yī)院藥理實(shí)驗(yàn)室，全自動(dòng)供水，自由進(jìn)食，室溫(22 ±2)℃，濕度55% ～65%，光照適度，通風(fēng)潔凈良好。

1.3 實(shí)驗(yàn)器材 FA1004 型電子分析天平(上海精科實(shí)業(yè)有限公司)，R-911 全自動(dòng)放免計(jì)數(shù)儀(中國科技大學(xué))，Vevo2100 小動(dòng)物專用高頻彩色超聲系統(tǒng)(加拿大VisuaSonics)，Leica ASP300S 全自動(dòng)真空組織脫水機(jī)(德國Leica)，組織包埋機(jī) (德國Medite)，全自動(dòng)染色機(jī) (德國Medite)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 給藥及造模 參照文獻(xiàn)方法建立MCT 致肺心病大鼠模型［5］:SD 大 鼠60 只，隨 機(jī) 分 為［6］空 白 組 (Control group)、模型組 (MCT group)、卡托普利組 (Captopril group)、復(fù)方低劑量組(Low-dose compound group)、復(fù)方高劑量組(High-dose compound group)，每組12 只。實(shí)驗(yàn)第1 天，除空白組外其余四組大鼠，每只一次性腹腔注射1% MCT 60 mg/kg (溶媒為無水酒精∶生理鹽水按2 ∶8 體積分?jǐn)?shù)配制)，空白組大鼠腹腔注射相應(yīng)劑量的酒精溶媒。造模第14 天開始灌胃給藥，空白組、模型組給予滅菌蒸餾水，其余各組參照文獻(xiàn)［7］計(jì)算給藥量:卡托普利組予卡托普利2.7 mg/kg，復(fù)方高劑量組按20 g/kg，復(fù)方低劑量組按7 g/kg 稀釋后灌胃。

2.2 心臟彩超 MCT 腹腔注射第15、30 天，腹腔麻醉后行心臟超聲檢查，檢測右心Tei 指數(shù)和平均肺動(dòng)脈壓(mean pulmonary artery pressure，mPAP)。Tei = (NFTPET)/PET (NFT 為右心室非充盈時(shí)間，PET 為肺動(dòng)脈射血時(shí)間)，mPAP=79 - (0.45 ×PAT)(PAT ＜120 ms，PAT為肺動(dòng)脈加速射血時(shí)間)。

2.3 檢測說明 MCT 腹腔注射第31 天，10%水合氯醛腹腔麻醉后腹主動(dòng)脈取血，2 000 r/min 低溫離心10 min，取上層血清-20 ℃凍存。ELISA 法測定TXA2、PGI2、AngⅡ、ANP 濃度。取心臟稱重后，中性甲醛固定，行HE 染色觀察心室變化;左肺HE 染色觀察小動(dòng)脈結(jié)構(gòu)。拍照后用圖像分析軟件分別測量肺小血管管壁厚度(wall thickness，WT)、血管外徑(external diameter，ED)、管壁面積(wall area，WA)、管腔面積 (lumen area，LA)、血管總面積(total area，TA)。心臟:右室壁面積(RV)、室間隔面積(IVS)、左室面積(LV)。計(jì)算出管壁厚度與血管外徑比值(WT%)、管壁面積與血管總面積比值(WA%)和管腔面積與血管總面積比值 (LA%)及右室體積分?jǐn)?shù)RV% =［RV/ (RV+IVS)］。

2.4 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，經(jīng)正態(tài)檢驗(yàn)、方差齊性檢驗(yàn)后，組間比較采用單因素方差分析，方差齊選擇LSD 法，方差不齊選擇Tamhane’s T2 法。P ＜0.05 表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，數(shù)據(jù)結(jié)果以均數(shù)(x)±標(biāo)準(zhǔn)差(s)表示。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 大鼠體質(zhì)量增加情況 大鼠初始體質(zhì)量各組之間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，第30 天，模型組體質(zhì)量較空白組有顯著的降低，模型組的體質(zhì)量增長與其余各組比較最為緩慢，卡托普利組、復(fù)方高劑量組較模型組有顯著增高，與空白組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見表1。

表1 大鼠體質(zhì)量變化(±s，n=10)

表1 大鼠體質(zhì)量變化(±s，n=10)

注:與模型組比較，△P ＜0.05

組別 劑量 第1 天/g 第30 天/g 體質(zhì)量增長/g空白組 - 117 ±8 348 ±20△ 171 ±21△模型組 - 178 ±5 316 ±19 139 ±19卡托普利組 2.7mg/kg 179 ±10 347 ±28△ 168 ±32△復(fù)方低劑量組 7g/kg 179 ±5 339 ±28 159 ±28復(fù)方高劑量組 20g/kg 176 ±10 348 ±16△ 171 ±19△

3.2 大鼠心臟彩超 MCT 腹腔注射第15 天時(shí)，模型組的mPAP 較空白組升高即具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P ＜0.05)，復(fù)方高劑量組與空白組無明顯差異但明顯低于模型組?？ㄍ衅绽M、復(fù)方低劑量組與空白組及模型組比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P ＞0.05)。MCT 腹腔注射第30 天時(shí)，空白組mPAP前后變化不顯著，模型組升高最為顯著，卡托普利組、復(fù)方低劑量組、復(fù)方高劑量組mPAP 較空白組均有不同程度的升高(P ＜0.05)，復(fù)方低劑量組mPAP 與模型組mPAP無明顯差異 (P ＞0.05)，卡托普利組、復(fù)方高劑量組mPAP 較模型組有顯著降低(P ＜0.05)。

MCT 腹腔注射第15 天時(shí)，各組大鼠Tei 之間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在MCT 腹腔注射第30 天時(shí)，模型組Tei 較空白組顯著增高(P ＜0.01)，與模型組比較，卡托普利組及復(fù)方高劑量組Tei 值顯著降低(P ＜0.05)，而復(fù)方低劑量組與模型組差異未能顯示出統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P ＞0.05)，見表2。

表2 MCT 注射第15、30 天各組大鼠mPAP、Tei 指數(shù)(±s，n=8，mmHg=0.133 kPa)

表2 MCT 注射第15、30 天各組大鼠mPAP、Tei 指數(shù)(±s，n=8，mmHg=0.133 kPa)

注:與空白組比較，▽P ＜0.05，▼P ＜0.01;與模型組比較，△P ＜0.05，▲P ＜0.01

MCT 注射第30 天右心Tei指數(shù)空白組 - 63.4±1.1△ 0.28±0.02 64.8±3.4▲ 0.27±0.06▲模型組 - 66.8±2.3▼ 0.37±0.13 74.2±3.5▼ 0.54±0.14▼組別 劑量MCT 注射第15 天mPAP(mmHg)MCT 注射第15 天右心Tei指數(shù)MCT 注射第30 天mPAP(mmHg)卡托普利組 2.7 mg/kg 64.4±1.5 0.34±0.06 69.5±1.3△▽0.37±0.12△復(fù)方低劑量組 7 g/kg 64.3±1.1 0.36±0.13 71.6±1.4▼ 0.42±0.17復(fù)方高劑量組 20 g/kg 63.6±1.2△ 0.31±0.12 69.1±4.2▲▽0.33±0.14△

3.3 肺小動(dòng)脈HE 染色 各組大鼠肺小動(dòng)脈HE 染色情況見圖1，各組WT%與WA%的變化趨勢相似但與LA%相反，模型組的WT%、WA% 較空白組顯著增大 (P ＜0.01)，卡托普利組、復(fù)方高級(jí)量組WT%、WA%與模型組比較有顯著的降低(P ＜0.05)，復(fù)方低劑量組與模型組差異不著。模型組LA%較空白組顯著降低，卡托普利組、復(fù)方高劑量組LA% 較模型組增高具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，復(fù)方低劑量組與模型組差異不顯著，見圖1、表3。

圖1 各組大鼠肺小動(dòng)脈結(jié)構(gòu)(×100)

3.4 心臟變化情況 比較大鼠心臟重量發(fā)現(xiàn)，給予MCT的各組大鼠心臟較空白組顯著增加，其中模型組增加最為明顯(P ＜0.01)，藥物干預(yù)三組大鼠的心臟重量較模型組均有不同程度降低，其中卡托普利組、復(fù)方低劑量組大鼠心臟重量與模型組比較(P ＜0.05)，復(fù)方高劑量組大鼠心臟重量較模型組顯著降低(P ＜0.01)。與空白組比較，模型組、復(fù)方高低劑量組右心面積分?jǐn)?shù)增加顯著(P ＜0.05)，卡托普利組則無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P ＞0.05);藥物干預(yù)各組與模型組比較發(fā)現(xiàn)，各組右心室面積分?jǐn)?shù)較模型組均顯著降低(P ＜0.01)，見表4、圖2。

圖2 大鼠心室HE 染色(HE×10)

表3 各組大鼠肺小動(dòng)脈血管情況(±s，n=10)

表3 各組大鼠肺小動(dòng)脈血管情況(±s，n=10)

注:WT%為管壁厚度與血管外徑比值，WA%為管壁面積與血管總面積比值，LA%和管腔面積與血管總面積比值。與模型組比較，△P ＜0.05，▲P ＜0.01

組別 劑量 WT% WA% LA%空白組 - 31.2 ±7.9▲ 52.1 ±10.5▲ 48.0 ±10.5▲模型組 - 57.3 ±11.6 80.5 ±10.5 19.5 ±10.5卡托普利組 2.7 mg/kg 40.7 ±11.9△63.6 ±14.3△ 36.4 ±14.3△復(fù)方低劑量組 7 g/kg 45.2 ±15.2 67.9 ±15.8 32.1 ±15.8復(fù)方高劑量組 20 g/kg 41.2 ±18.6△63.2 ±22.7△ 34.1 ±17.3△

表4 各組大鼠心臟重量及右心室面積分?jǐn)?shù)(±s，n=10)

表4 各組大鼠心臟重量及右心室面積分?jǐn)?shù)(±s，n=10)

注:與空白組比較，▽P ＜0.05，▼P ＜0.01;與模型組比較，△P ＜0.05，▲P ＜0.01

組別 劑量 心臟凈重量/g RV%空白組 - 0.83 ±0.08▲ 13.7 ±3.8▲模型組 - 1.15 ±0.20▼ 34.4 ±4.4▼卡托普利組 2.7 mg/kg 0.99 ±0.17△▽ 19.5 ±6.8▲復(fù)方低劑量組 7 g/kg 0.97 ±0.14△▽ 25.8 ±8.6▲▼復(fù)方高劑量組 20 g/kg 0.94 ±0.08▲▽ 20.1 ±2.8▲▽

3.5 大鼠血清AngⅡ、ANP、TXA2、PGI2變化 由表5 可見，模型組AngⅡ較空白組顯著升高(P ＜0.01)，復(fù)方低劑量組AngⅡ與模型組比較無顯著差異(P ＞0.05)，卡托普利組和復(fù)方高劑量組AngⅡ較模型組降低有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。模型組大鼠血清ANP 水平較空白組顯著升高(P ＜0.01)，卡托普利組、復(fù)方高劑量組大鼠血清ANP 水平較模型組均有顯著降低(P ＜0.05)。模型組TXA2較空白組顯著升高(P ＜0.01)，卡托普利組與模型組之間比較差異未能顯示出統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P ＞0.05)，復(fù)方高劑量組能夠顯著降低大鼠血清TXA2水平(P ＜0.05)?？瞻捉MPGI2水平較高，模型組PGI2較空白組顯著降低(P ＜0.01)，卡托普利組與模型組血清PGI2水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)，復(fù)方高劑量組血清PGI2濃度較模型組有顯著上升(P ＜0.05)。

表5 大鼠血清細(xì)胞因子變化(±s，n=8)

表5 大鼠血清細(xì)胞因子變化(±s，n=8)

注:與模型組比較，△P ＜0.05，▲P ＜0.01

組別 劑量 TAX2 pg/mL PGI2 pg/mL ANP pg/mL空白組 - 122 ±17▲ 227 ±36▲2.7 ±0.6▲ 144 ±24▲模型組 - 182 ±26 149 ±20 4.6 ±0.8 378 ±44 AngⅡng/mL卡托普利組 2.7mg/kg 160 ±20 160 ±300 3.4 ±0.4△ 189 ±22▲復(fù)方低劑量組 7g/kg 158 ±13 195 ±16 3.7 ±0.9 289 ±48復(fù)方高劑量組 20g/kg 149 ±25▲ 219 ±48▲3.4 ±0.3△ 176 ±20▲

4 討論

肺動(dòng)脈高壓是PHD 的病理生理基礎(chǔ)，持續(xù)存在的肺動(dòng)脈高壓，勢必影響右心的功能;在右室負(fù)荷增加的早期，通過心肌收縮力的增加，發(fā)揮代償性作用［8］;當(dāng)肺動(dòng)脈壓繼續(xù)增高，右室失代償則發(fā)展至心力衰竭。諸如TXA2、PGI2、AngⅡ、ANP 的異常變化，在形成肺動(dòng)脈高壓到過度到心衰的病程中扮演著重要的角色。

研究認(rèn)為TXA2/PGI2平衡對(duì)維持血液循環(huán)的通暢，調(diào)節(jié)血管的舒縮具有重要的意義［9］。TXA2/PGI2失衡會(huì)影響肺部血管，特別是小血管、毛細(xì)血管狀態(tài)，及肺部血小板聚集狀態(tài)，從而影響肺血管壓力和血流情況;是促進(jìn)肺動(dòng)脈高壓發(fā)生、發(fā)展的重要因素之一［10］。AngⅡ是血管平滑肌細(xì)胞的強(qiáng)絲裂原，在肺動(dòng)脈壓增高、肺血管重構(gòu)［11］及心肌重構(gòu)的發(fā)生發(fā)展中起重要作用［12］。ANP 具有利鈉、利尿、舒張血管等作用［13］，在心衰的代償階段發(fā)揮重要的作用［14］，由于RAAS 系統(tǒng)的持續(xù)激活，使其無法延緩肺心病的進(jìn)展，確在一定程度上反映心衰的嚴(yán)重程度。我們的研究顯示，模型組大鼠肺小動(dòng)脈管壁增厚、mPAP 升高，心臟重量增加、右心室體積分?jǐn)?shù)增大、右心Tei 指數(shù)升高是伴隨著TXA2、AngⅡ、ANP 升高及PGI2降低這一系列細(xì)胞因子的變化。進(jìn)一步說明TXA2/PGI2平衡、AngⅡ、ANP 與肺心病的發(fā)病和進(jìn)程密切相關(guān)?？ㄍ衅绽M能顯著降低AngⅡ、ANP 水平，抑制大鼠肺小動(dòng)脈管壁及右心室的增厚，降低mPAP 及右心Tei 指數(shù)。“益氣化瘀、溫陽利水”方在高劑量時(shí)不僅能降低Ang Ⅱ、ANP 水平，還具有調(diào)節(jié)TXA2/PGI2平衡的作用;其能夠抑制肺血管及右心室的重構(gòu)，降低mPAP、右心Tei 指數(shù)，從而發(fā)揮治療PHD 的作用。

目前右心導(dǎo)管檢測mPAP 是確診肺動(dòng)脈高壓的金標(biāo)準(zhǔn)，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用早已開展;心臟彩超檢查在臨床中應(yīng)用廣泛［15］，其在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用尚未普及，我們的實(shí)驗(yàn)較早地使用心臟彩超實(shí)現(xiàn)對(duì)大鼠mPAP 和Tei 指數(shù)的動(dòng)態(tài)監(jiān)測。實(shí)驗(yàn)中，mPAP 是根據(jù)肺動(dòng)脈加速射血時(shí)間接計(jì)算而得的，盡管所測mPAP 較文獻(xiàn)中通過右心導(dǎo)管檢測的數(shù)值偏高，通過組間比較仍然說明其在評(píng)估m(xù)PAP 和Tei 中具有重要意義。下一步的研究，可以依托于VisuaSonics Vevo2100超聲平臺(tái)實(shí)現(xiàn)對(duì)心功能進(jìn)行更全面的評(píng)估;同時(shí)拓展與PHD 相關(guān)因子［16］的研究。

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