FTIR 結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)法鑒別燕窩的真?zhèn)?/h1>
2015-01-13 09:18:46鄧仙梅賴(lài)小平
中成藥 2015年10期
趙 斌， 鄧仙梅， 劉 敬，3， 王 瓊，3， 賴(lài)小平
(1. 中山火炬職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣東 中山528436;2. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州510006;3. 國(guó)家中藥現(xiàn)代化工程技術(shù)研究中心 中山健康產(chǎn)品分中心，廣東 中山528436)
燕窩(cubilose)是雨燕科動(dòng)物金絲燕分泌唾液所筑成的巢窩［1］，最早記載于《本草備要》，認(rèn)為其“甘淡平，大養(yǎng)肺陰，化痰止咳。補(bǔ)而能清，為調(diào)理虛勞之圣藥”。燕窩是馳名中外的滋補(bǔ)良品，市場(chǎng)需求量巨大，但相關(guān)質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)很不健全，導(dǎo)致市場(chǎng)上其質(zhì)量參差不齊，偽品眾多［2］(如豬皮、銀耳、瓊脂等)，故亟需建立一套快速有效的鑒別燕窩真?zhèn)蔚姆椒?。在?guó)內(nèi)，已有很多學(xué)者對(duì)燕窩的性狀、理化性質(zhì)、化學(xué)成分測(cè)定等方面進(jìn)行分析研究［3-9］，但均需對(duì)樣品進(jìn)行前處理，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。傅立葉紅外變換光譜法(FTIR)是一種無(wú)損、快速、簡(jiǎn)便的分析技術(shù)，孫素琴等［10-11］采用該方法對(duì)燕窩的品質(zhì)進(jìn)行了研究，通過(guò)檢測(cè)不同產(chǎn)地燕窩及摻假物豬皮、銀耳的特征峰來(lái)比較其真?zhèn)?，但?duì)鑒定人員的專(zhuān)業(yè)素質(zhì)要求較高，而且主觀性較強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)將FTIR 與化學(xué)計(jì)量學(xué)法相結(jié)合，期冀快速準(zhǔn)確地鑒別燕窩的真?zhèn)巍?/p>
1 材料與方法
1.1 儀器與試劑 Nicolet iS10 傅里葉變換紅外光譜儀(美國(guó)Thermo Nicolet 公司);YP-2 壓片機(jī)(上海山岳科學(xué)儀器有限公司);HW-3 紅外烘干箱(安合盟天津科技發(fā)展有限公司)。KBr 為光譜純(美國(guó)Thermo Nicolet 公司)。
1.2 樣品來(lái)源及處理 收集28 份東南亞進(jìn)口的燕窩樣品，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院賴(lài)小平教授鑒定為正品，與若干偽品(豬皮、瓊脂、銀耳)一起組成真、偽燕窩樣品集，見(jiàn)表1。將它們于60 ℃下干燥24 h，研成粉末，過(guò)100 目篩，儲(chǔ)存于干燥器中備用，然后準(zhǔn)確稱(chēng)取各樣品2 mg，置于瑪瑙研缽中，按1 ∶100 比例加入干燥KBr，研磨均勻后取適量混合樣品置于壓片模具中，用壓片機(jī)壓成均勻透明的薄片，用于測(cè)定紅外光譜。
表1 燕窩的鑒定結(jié)果及其偽品來(lái)源Tab.1 Result of identification of cubilose and sources of its counterfeit goods
1.3 光譜條件及樣品光譜采集 室溫20 ～25 ℃;相對(duì)濕度20% ～25%;掃描范圍4 000 ～400 cm-1;掃描次數(shù)16 次/s;掃描速度0.2 cm/s;分辨率4 cm-1。掃描時(shí)，除去水分和CO2的干擾。
在采集樣品光譜前，先以KBr 為背景，累積掃描32 次，每個(gè)樣品平行測(cè)3 次，取平均值，而且均須扣除KBr 背景光譜。然后，采用Spectrum v32 操作軟件(美國(guó)Thermo Nicolet 公司)進(jìn)行數(shù)據(jù)采集及譜圖處理。
1.4 數(shù)據(jù)處理 采用SIMCA-P +12.0 軟件進(jìn)行主成分分析，SPSS 16.0 軟件進(jìn)行系統(tǒng)聚類(lèi)分析。
2 結(jié)果與分析
2.1 樣品及偽品的紅外譜圖分析(圖1) 由圖1A 可知，28 批燕窩樣品(白燕、血燕和黃燕)均有很相似的紅外光譜，在特征區(qū)(4 000 ～1 300 cm-1)范圍內(nèi)基本一致，但在指紋區(qū)(1 300 ～400，特別是1 000 ～400 cm-1)范圍內(nèi)有差異，可能是由于燕窩樣品的不同批次或種類(lèi)所致。由圖1B 可知，雖然不同種類(lèi)燕窩紅外譜圖的峰形、峰位都很相似，但其峰強(qiáng)度在2 927、1 044 cm-1附近和1 450 ～1 100、960 ～800 cm-1特征范圍內(nèi)的差異比較明顯。
圖1 真?zhèn)窝喔C的紅外譜圖Fig.1 IR spectra of real and false cubilose
燕窩的主要化學(xué)成分為蛋白質(zhì)、氨基酸及多糖。在2 927 cm-1附近的吸收峰為甲基和亞甲基，而在1 641、1 532、1 044 cm-1附近為蛋白質(zhì)、氨基酸和多糖。由圖1C 可知，瓊脂和銀耳在2 927 cm-1附近的吸收比燕窩弱，而豬皮及去油豬皮的吸收比較強(qiáng);在1 641 cm-1附近，瓊脂、銀耳及去油豬皮的吸收都明顯弱于燕窩，而豬皮則沒(méi)有吸收峰;在1 750 cm-1附近，豬皮、銀耳及去油豬皮均有一個(gè)明顯而尖銳的脂肪類(lèi)特征吸收峰;在1 532 cm-1附近，這幾類(lèi)偽品都沒(méi)有吸收峰;在1 044 cm-1附近，豬皮及去油豬皮均無(wú)吸收峰，而瓊脂及銀耳在此處的吸收比燕窩強(qiáng)。綜上所述，以圖譜中這4 個(gè)特征區(qū)的峰特點(diǎn)為依據(jù)，即可初步將燕窩與其偽品區(qū)分開(kāi)。
2.2 主成分分析 主成分分析(PCA)是一種降維統(tǒng)計(jì)分析技術(shù)，它可利用變量之間的相關(guān)關(guān)系，在最大限度保留原數(shù)據(jù)信息量的前提下，用較少的新變量來(lái)代替較多的舊變量，從而使問(wèn)題簡(jiǎn)單化。本實(shí)驗(yàn)以真?zhèn)窝喔C的紅外譜圖為變量，將其轉(zhuǎn)化為數(shù)據(jù)矩陣，并選取了3 000 ～2 700、1 800 ～400 cm-1這兩個(gè)波段范圍內(nèi)的光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。然后，對(duì)其波數(shù)點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的百分透過(guò)率數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析，并選取特征根大于1 的特征波數(shù)點(diǎn)為聚類(lèi)分析提供主要變量，用于減少交叉關(guān)聯(lián)信息對(duì)其結(jié)果的影響，提高分析的準(zhǔn)確度，并建立真?zhèn)窝喔C的分類(lèi)識(shí)別模型，見(jiàn)圖2。由圖可知，燕窩與瓊脂、銀耳、豬皮等偽品之間均互不干擾，可以很好地區(qū)分開(kāi)。
圖2 真?zhèn)窝喔C3D-PCA 圖Fig.2 3D-PCA diagram of real and false cubilose
2.3 系統(tǒng)聚類(lèi)分析 聚類(lèi)分析是一種根據(jù)觀測(cè)變量，對(duì)未知事物進(jìn)行分類(lèi)的統(tǒng)計(jì)方法，它可獲取中藥材復(fù)雜化學(xué)體系中紅外光譜整體特征信息的差異，從不同樣本中找出決定其差異的變量，從而進(jìn)行分類(lèi)。本實(shí)驗(yàn)以上述主成分分析提取的特征波數(shù)點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的百分透過(guò)率為變量，對(duì)燕窩及其偽品進(jìn)行系統(tǒng)聚類(lèi)分析，見(jiàn)圖3。由圖可知，該方法能很好地將燕窩(Ⅰ)與其偽品(Ⅱ)分為2 大類(lèi)，而在Ⅱ類(lèi)下又能很好地將豬皮(29)、去油豬皮(30)、銀耳(31 -33)及瓊脂(34)區(qū)分開(kāi)。同時(shí)，在Ⅰ類(lèi)下也能將不同批次的燕窩分為幾小類(lèi)。
3 結(jié)論和討論
本實(shí)驗(yàn)根據(jù)FTIR 譜圖、特征峰主成分及聚類(lèi)分析結(jié)果，可將28 個(gè)燕窩真品與6 個(gè)豬皮、銀耳偽品清晰地區(qū)分開(kāi)，表明FTIR 作為一種無(wú)損、快速、簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)的分析技術(shù)，可用于燕窩真?zhèn)蔚蔫b別。但由于偽品數(shù)目較少，故采用該方法進(jìn)行真?zhèn)窝喔C的快速區(qū)分尚需更多樣品的驗(yàn)證。
文獻(xiàn)［10-11］報(bào)道，通過(guò)對(duì)紅外譜圖的直觀分析，可區(qū)分不同種類(lèi)燕窩，并同時(shí)評(píng)價(jià)其品質(zhì)，但本實(shí)驗(yàn)尚不能對(duì)不同種類(lèi)燕窩(白燕、血燕及黃燕)進(jìn)行辨別分析，可能是由于以上文獻(xiàn)中每類(lèi)樣品只有1 個(gè)，并且是根據(jù)產(chǎn)地來(lái)進(jìn)行燕窩種類(lèi)的區(qū)分，而本實(shí)驗(yàn)中每類(lèi)樣品有5 ～18 個(gè)，并且來(lái)自不同產(chǎn)地或渠道，其數(shù)量及復(fù)雜程度要高于文獻(xiàn)報(bào)道。另外，文獻(xiàn)［12-13］采用FTIR 結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)法進(jìn)行煙葉產(chǎn)地、部位的識(shí)別及真假牛奶的區(qū)分，發(fā)現(xiàn)天然產(chǎn)物樣品的復(fù)雜程度越高，對(duì)其分類(lèi)識(shí)別的準(zhǔn)確率越低，并且模式識(shí)別的方法對(duì)分類(lèi)結(jié)果也有重要影響。另外，文獻(xiàn)［12］ 表明，產(chǎn)地不同所導(dǎo)致樣品差異的程度要大于部位不同，提示燕窩真?zhèn)蔚膮^(qū)分可能應(yīng)在同一產(chǎn)地樣品中進(jìn)行，這有待于今后作進(jìn)一步驗(yàn)證。
［1］ 山東省藥品監(jiān)督管理局. 山東省中藥材標(biāo)準(zhǔn)(2002 年版)［M］. 濟(jì)南:山東友誼出版社，2002:270.
［2］ 林潔茹，周 華，賴(lài)小平，等. 燕窩研究概述［J］. 中藥材，2006，29(1):85-90.
［3］ 馮夏紅，李 峰，赫 寧，等. 三種燕窩的真?zhèn)舞b別［J］.中醫(yī)藥學(xué)刊，2004，22(5):956.
［4］ 蔣華嵩. 真假燕窩的鑒別［J］. 中草藥，2000，31(1):58.
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［6］ 侯惠嬋，施亦斌，黃文青，等. 中國(guó)產(chǎn)燕窩總氮及氨基酸含量分析［J］. 中藥材，2007，30(8):961-963.
［7］ 李憲華，奚星林，陳文銳. 進(jìn)出口燕窩品質(zhì)分析評(píng)價(jià)［J］.廣州食品工業(yè)科技，2003，19(3):72，89.
［8］ 王 慧，倪坤儀，王 玉. 燕窩中唾液酸的含量測(cè)定［J］.藥物分析雜志，2006，26(6):1251-1253.
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［13］ Zhang L G，Zhang X，Ni L J，et al. Rapid identification of adulterated cow milk by non-linear pattern recognition methods based on near infrared spectroscopy［J］. Food Chem，2014，145(15):342-348.
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燕窩(cubilose)是雨燕科動(dòng)物金絲燕分泌唾液所筑成的巢窩［1］，最早記載于《本草備要》，認(rèn)為其“甘淡平，大養(yǎng)肺陰，化痰止咳。補(bǔ)而能清，為調(diào)理虛勞之圣藥”。燕窩是馳名中外的滋補(bǔ)良品，市場(chǎng)需求量巨大，但相關(guān)質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)很不健全，導(dǎo)致市場(chǎng)上其質(zhì)量參差不齊，偽品眾多［2］(如豬皮、銀耳、瓊脂等)，故亟需建立一套快速有效的鑒別燕窩真?zhèn)蔚姆椒?。在?guó)內(nèi)，已有很多學(xué)者對(duì)燕窩的性狀、理化性質(zhì)、化學(xué)成分測(cè)定等方面進(jìn)行分析研究［3-9］，但均需對(duì)樣品進(jìn)行前處理，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。傅立葉紅外變換光譜法(FTIR)是一種無(wú)損、快速、簡(jiǎn)便的分析技術(shù)，孫素琴等［10-11］采用該方法對(duì)燕窩的品質(zhì)進(jìn)行了研究，通過(guò)檢測(cè)不同產(chǎn)地燕窩及摻假物豬皮、銀耳的特征峰來(lái)比較其真?zhèn)?，但?duì)鑒定人員的專(zhuān)業(yè)素質(zhì)要求較高，而且主觀性較強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)將FTIR 與化學(xué)計(jì)量學(xué)法相結(jié)合，期冀快速準(zhǔn)確地鑒別燕窩的真?zhèn)巍?/p>
1 材料與方法
1.1 儀器與試劑 Nicolet iS10 傅里葉變換紅外光譜儀(美國(guó)Thermo Nicolet 公司);YP-2 壓片機(jī)(上海山岳科學(xué)儀器有限公司);HW-3 紅外烘干箱(安合盟天津科技發(fā)展有限公司)。KBr 為光譜純(美國(guó)Thermo Nicolet 公司)。
1.2 樣品來(lái)源及處理 收集28 份東南亞進(jìn)口的燕窩樣品，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院賴(lài)小平教授鑒定為正品，與若干偽品(豬皮、瓊脂、銀耳)一起組成真、偽燕窩樣品集，見(jiàn)表1。將它們于60 ℃下干燥24 h，研成粉末，過(guò)100 目篩，儲(chǔ)存于干燥器中備用，然后準(zhǔn)確稱(chēng)取各樣品2 mg，置于瑪瑙研缽中，按1 ∶100 比例加入干燥KBr，研磨均勻后取適量混合樣品置于壓片模具中，用壓片機(jī)壓成均勻透明的薄片，用于測(cè)定紅外光譜。
表1 燕窩的鑒定結(jié)果及其偽品來(lái)源Tab.1 Result of identification of cubilose and sources of its counterfeit goods
1.3 光譜條件及樣品光譜采集 室溫20 ～25 ℃;相對(duì)濕度20% ～25%;掃描范圍4 000 ～400 cm-1;掃描次數(shù)16 次/s;掃描速度0.2 cm/s;分辨率4 cm-1。掃描時(shí)，除去水分和CO2的干擾。
在采集樣品光譜前，先以KBr 為背景，累積掃描32 次，每個(gè)樣品平行測(cè)3 次，取平均值，而且均須扣除KBr 背景光譜。然后，采用Spectrum v32 操作軟件(美國(guó)Thermo Nicolet 公司)進(jìn)行數(shù)據(jù)采集及譜圖處理。
1.4 數(shù)據(jù)處理 采用SIMCA-P +12.0 軟件進(jìn)行主成分分析，SPSS 16.0 軟件進(jìn)行系統(tǒng)聚類(lèi)分析。
2 結(jié)果與分析
2.1 樣品及偽品的紅外譜圖分析(圖1) 由圖1A 可知，28 批燕窩樣品(白燕、血燕和黃燕)均有很相似的紅外光譜，在特征區(qū)(4 000 ～1 300 cm-1)范圍內(nèi)基本一致，但在指紋區(qū)(1 300 ～400，特別是1 000 ～400 cm-1)范圍內(nèi)有差異，可能是由于燕窩樣品的不同批次或種類(lèi)所致。由圖1B 可知，雖然不同種類(lèi)燕窩紅外譜圖的峰形、峰位都很相似，但其峰強(qiáng)度在2 927、1 044 cm-1附近和1 450 ～1 100、960 ～800 cm-1特征范圍內(nèi)的差異比較明顯。
圖1 真?zhèn)窝喔C的紅外譜圖Fig.1 IR spectra of real and false cubilose
燕窩的主要化學(xué)成分為蛋白質(zhì)、氨基酸及多糖。在2 927 cm-1附近的吸收峰為甲基和亞甲基，而在1 641、1 532、1 044 cm-1附近為蛋白質(zhì)、氨基酸和多糖。由圖1C 可知，瓊脂和銀耳在2 927 cm-1附近的吸收比燕窩弱，而豬皮及去油豬皮的吸收比較強(qiáng);在1 641 cm-1附近，瓊脂、銀耳及去油豬皮的吸收都明顯弱于燕窩，而豬皮則沒(méi)有吸收峰;在1 750 cm-1附近，豬皮、銀耳及去油豬皮均有一個(gè)明顯而尖銳的脂肪類(lèi)特征吸收峰;在1 532 cm-1附近，這幾類(lèi)偽品都沒(méi)有吸收峰;在1 044 cm-1附近，豬皮及去油豬皮均無(wú)吸收峰，而瓊脂及銀耳在此處的吸收比燕窩強(qiáng)。綜上所述，以圖譜中這4 個(gè)特征區(qū)的峰特點(diǎn)為依據(jù)，即可初步將燕窩與其偽品區(qū)分開(kāi)。
2.2 主成分分析 主成分分析(PCA)是一種降維統(tǒng)計(jì)分析技術(shù)，它可利用變量之間的相關(guān)關(guān)系，在最大限度保留原數(shù)據(jù)信息量的前提下，用較少的新變量來(lái)代替較多的舊變量，從而使問(wèn)題簡(jiǎn)單化。本實(shí)驗(yàn)以真?zhèn)窝喔C的紅外譜圖為變量，將其轉(zhuǎn)化為數(shù)據(jù)矩陣，并選取了3 000 ～2 700、1 800 ～400 cm-1這兩個(gè)波段范圍內(nèi)的光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。然后，對(duì)其波數(shù)點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的百分透過(guò)率數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析，并選取特征根大于1 的特征波數(shù)點(diǎn)為聚類(lèi)分析提供主要變量，用于減少交叉關(guān)聯(lián)信息對(duì)其結(jié)果的影響，提高分析的準(zhǔn)確度，并建立真?zhèn)窝喔C的分類(lèi)識(shí)別模型，見(jiàn)圖2。由圖可知，燕窩與瓊脂、銀耳、豬皮等偽品之間均互不干擾，可以很好地區(qū)分開(kāi)。
圖2 真?zhèn)窝喔C3D-PCA 圖Fig.2 3D-PCA diagram of real and false cubilose
2.3 系統(tǒng)聚類(lèi)分析 聚類(lèi)分析是一種根據(jù)觀測(cè)變量，對(duì)未知事物進(jìn)行分類(lèi)的統(tǒng)計(jì)方法，它可獲取中藥材復(fù)雜化學(xué)體系中紅外光譜整體特征信息的差異，從不同樣本中找出決定其差異的變量，從而進(jìn)行分類(lèi)。本實(shí)驗(yàn)以上述主成分分析提取的特征波數(shù)點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的百分透過(guò)率為變量，對(duì)燕窩及其偽品進(jìn)行系統(tǒng)聚類(lèi)分析，見(jiàn)圖3。由圖可知，該方法能很好地將燕窩(Ⅰ)與其偽品(Ⅱ)分為2 大類(lèi)，而在Ⅱ類(lèi)下又能很好地將豬皮(29)、去油豬皮(30)、銀耳(31 -33)及瓊脂(34)區(qū)分開(kāi)。同時(shí)，在Ⅰ類(lèi)下也能將不同批次的燕窩分為幾小類(lèi)。
3 結(jié)論和討論
本實(shí)驗(yàn)根據(jù)FTIR 譜圖、特征峰主成分及聚類(lèi)分析結(jié)果，可將28 個(gè)燕窩真品與6 個(gè)豬皮、銀耳偽品清晰地區(qū)分開(kāi)，表明FTIR 作為一種無(wú)損、快速、簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)的分析技術(shù)，可用于燕窩真?zhèn)蔚蔫b別。但由于偽品數(shù)目較少，故采用該方法進(jìn)行真?zhèn)窝喔C的快速區(qū)分尚需更多樣品的驗(yàn)證。
文獻(xiàn)［10-11］報(bào)道，通過(guò)對(duì)紅外譜圖的直觀分析，可區(qū)分不同種類(lèi)燕窩，并同時(shí)評(píng)價(jià)其品質(zhì)，但本實(shí)驗(yàn)尚不能對(duì)不同種類(lèi)燕窩(白燕、血燕及黃燕)進(jìn)行辨別分析，可能是由于以上文獻(xiàn)中每類(lèi)樣品只有1 個(gè)，并且是根據(jù)產(chǎn)地來(lái)進(jìn)行燕窩種類(lèi)的區(qū)分，而本實(shí)驗(yàn)中每類(lèi)樣品有5 ～18 個(gè)，并且來(lái)自不同產(chǎn)地或渠道，其數(shù)量及復(fù)雜程度要高于文獻(xiàn)報(bào)道。另外，文獻(xiàn)［12-13］采用FTIR 結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)法進(jìn)行煙葉產(chǎn)地、部位的識(shí)別及真假牛奶的區(qū)分，發(fā)現(xiàn)天然產(chǎn)物樣品的復(fù)雜程度越高，對(duì)其分類(lèi)識(shí)別的準(zhǔn)確率越低，并且模式識(shí)別的方法對(duì)分類(lèi)結(jié)果也有重要影響。另外，文獻(xiàn)［12］ 表明，產(chǎn)地不同所導(dǎo)致樣品差異的程度要大于部位不同，提示燕窩真?zhèn)蔚膮^(qū)分可能應(yīng)在同一產(chǎn)地樣品中進(jìn)行，這有待于今后作進(jìn)一步驗(yàn)證。
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