慢性骨髓炎病原菌菌譜及藥敏分析

許玉兵 丁方平

1.杭州市富陽中醫(yī)骨傷醫(yī)院檢驗(yàn)科，浙江富陽311400；2.杭州市富陽中醫(yī)骨傷醫(yī)院針灸推拿科，浙江富陽311400

慢性骨髓炎病原菌菌譜及藥敏分析

許玉兵1丁方平2

1.杭州市富陽中醫(yī)骨傷醫(yī)院檢驗(yàn)科，浙江富陽311400；2.杭州市富陽中醫(yī)骨傷醫(yī)院針灸推拿科，浙江富陽311400

目的了解慢性骨髓炎感染病原菌的菌群分布及藥敏情況，指導(dǎo)臨床合理使用抗菌藥物。方法通過對(duì)288份骨髓炎分泌物的培養(yǎng)和藥敏試驗(yàn)。結(jié)果共培養(yǎng)出細(xì)菌283株，G+菌123株，G-菌160株。結(jié)論感染的首位病原菌仍是金黃色葡萄球菌，但G-菌的感染率在不斷上升占到53%，大于G+菌的感染。喹諾酮類、克林霉素對(duì)G+菌的敏感率較高，均在80%以上，一、二代頭孢菌素對(duì)G-病原菌敏感率較低，均低于35%，三、四代頭孢菌素、喹諾酮類、哌拉西林/他巴唑、亞胺培南尚有較高的敏感率。

慢性骨髓炎；病原菌；藥敏

慢性骨髓炎病程長、治療困難、易復(fù)發(fā)，一直是骨科醫(yī)師面臨的一大臨床難題[1]。慢性骨髓炎的病情復(fù)雜，病程較長，治療的失敗率和復(fù)發(fā)率也較高。自20世紀(jì)80年代起，敗血癥減少，因敗血癥引起的急性血源性骨髓炎也相應(yīng)減少。但創(chuàng)傷性骨髓炎和慢性骨髓炎日漸增多，以往有典型表現(xiàn)者少見，癥狀不典型者增多，致誤診、漏診增多，喪失了最佳治療時(shí)機(jī)[2]?？股刂委熓锹怨撬柩椎闹饕侄魏头椒ㄖ?，由于抗生素的廣泛使用，臨床上產(chǎn)生了不少的耐藥菌株，增加了該病的治療難度和治療周期。既增加患者的痛苦，又消耗了更多的醫(yī)療資源。因此了解慢性骨髓炎感染菌株分布的特點(diǎn)及其耐藥情況變得尤為重要。為此，于2011～2014年間我院收集的288例骨髓炎分泌物標(biāo)本進(jìn)行了細(xì)菌培養(yǎng)和藥敏試驗(yàn)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2011年1月1日～2014年12月31日我院收治的288例慢性骨髓炎患者，依照《坎貝爾骨科學(xué)》標(biāo)準(zhǔn)診斷為慢性骨髓炎，其中108例為急性骨髓炎轉(zhuǎn)變而來，180例為開放性骨折引發(fā)的骨髓炎。男210例，女78例。發(fā)病部位：脛腓骨160例，肱骨48例，股骨35例，指部23例，足部22例。所有標(biāo)本都有臨床醫(yī)生按照無菌操作流程采集的竇道分泌物或手術(shù)中采集的肉芽組織或死骨。

1.2 材料與藥物

1.2.1 材料血瓊脂平板（法國梅里埃生產(chǎn)哥倫比亞血瓊脂平板，規(guī)格90 mm）電熱恒溫培養(yǎng)箱、35℃，（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司制造）無菌棉拭子（法國梅里埃生產(chǎn)，產(chǎn)品標(biāo)號(hào)155C。

1．2．2抗菌藥物[GP－AST藥敏板]青霉素G、利福平、呋喃妥因、四環(huán)素、莫西沙星、左氟沙星、環(huán)丙沙星、慶大霉素、復(fù)方新諾明、克林霉素、替考拉寧、紅霉素、苯唑西林、萬古霉素。[GN－AST藥敏板]亞胺培南、左氟沙星、呋喃妥因、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢他啶、阿米卡星、環(huán)丙沙星、慶大霉素、氨曲南、頭孢曲松、頭孢拉定、妥布霉素、頭孢挫啉。

1.3 方法

臨床采集的標(biāo)本在2 h內(nèi)接種于血平板上，經(jīng)35℃、24 h培養(yǎng)，生長菌落行革蘭染色，如果染色為G+細(xì)菌，用VITEK－2的專用的GP鑒定板上機(jī)鑒定，藥敏則采用GP－AST板做藥敏檢測(cè)。染為G－細(xì)菌則用VITEK－2專用的GN鑒定板進(jìn)行鑒定，用GN－AST藥敏板進(jìn)行藥敏檢測(cè)。所有鑒定和藥敏在24 h內(nèi)由儀器自動(dòng)完成并給出完整報(bào)告。一個(gè)病例只收集一次結(jié)果，無重復(fù)培養(yǎng)和藥敏結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS19．0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析，表1為分離到的細(xì)菌以及各自所占構(gòu)成比。表2為主要三種G+病原菌的敏感例數(shù)/敏感率%，表3為主要三種G－病原菌的敏感例數(shù)/敏感率%。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果

288例標(biāo)本有細(xì)菌生長的有224例，陽性率77．7%，其中12例有三種細(xì)菌生長，35例有兩種細(xì)菌生長，共檢出菌株283株。總共檢出15種細(xì)菌。見表1。

2.2 藥敏結(jié)果

所有檢出細(xì)菌行藥敏試驗(yàn)，見表2、3。

表1骨髓炎病原菌檢出構(gòu)成比（%）

3 討論

表2主要G+對(duì)15種抗生素的敏感率[n（%）]

3.1 慢性骨髓炎致病菌菌譜的特點(diǎn)

本組標(biāo)本共檢出15種細(xì)菌。前五位排序?yàn)榻瘘S色葡萄球菌（29．0%）＞銅綠假單胞菌（17．7%）＞陰溝腸桿菌（13．8%）＞大腸埃希菌（8．8%）＞溶血葡萄球菌（7．8%）。和謝克恭等[3]報(bào)道的文獻(xiàn)一致。但與劉伯讓等[4]報(bào)道文獻(xiàn)略有差異，其排列首位的病原菌為銅綠，而我們檢出的首位則是金黃色葡萄球菌。與張雙江等[5]報(bào)道的有較大差異，其報(bào)道中G+菌比例占80%，可能由于長期用藥習(xí)慣的地區(qū)差異導(dǎo)致了臨床陽性病原菌的不同，其真正原因有待研究。其中G+菌共檢出123株，占43%，G－菌160株，占53%。G－菌的感染率要大于G+菌，前五位中G－桿菌占多數(shù)達(dá)52%，說明隨著抗生素的長期應(yīng)用，一些正常寄生菌或自然界總正常菌群的感染率在上升，同時(shí)由于在骨科感染治療時(shí)偏重于G+菌的抗生素的使用，產(chǎn)生了一定的抑陽扶陰的作用，須引起足夠重視。同時(shí)本組試驗(yàn)有20%的標(biāo)本無菌生長，但不表示一定沒有細(xì)菌，一些厭氧菌、L型細(xì)菌，苛養(yǎng)菌無法通過常規(guī)的培養(yǎng)方法生長。近年來臨床發(fā)現(xiàn)細(xì)菌“L”型[6]已成為慢性骨髓炎難以治愈的主要原因。L型細(xì)菌是細(xì)菌的細(xì)胞壁部分或全部缺失產(chǎn)生的變異菌，具有返祖化特征，但患者抵抗力下降或抗菌藥物濃度下降時(shí)、可轉(zhuǎn)化成金葡菌[7]。有文獻(xiàn)報(bào)道若不開展厭氧菌培養(yǎng)或其他微生物檢測(cè)，則大約有25．7%的病原菌不能被及時(shí)發(fā)現(xiàn)，特別是某些單純厭氧菌感染，這種感染以往由于未做厭氧菌培養(yǎng)，需氧菌培養(yǎng)陰性而被誤診為無菌膿腫[8]。由于厭氧菌感染常為多菌性，不僅細(xì)菌協(xié)同現(xiàn)象值得注意，而且厭氧菌中最多見的脆弱桿菌能產(chǎn)生β內(nèi)酰胺酶。其能顯著減低病灶中的β－內(nèi)酰胺類抗生素的濃度并將其滅活，因此在臨床治療時(shí)選用抗生素時(shí)要加以考慮。

表3主要G-病原菌對(duì)15種抗生素的敏感率[n（%）]

3.2 病原菌耐藥性的分析

本次分離的G+菌對(duì)青霉素敏感率率僅5．8%，對(duì)骨髓炎已幾乎無治療作用。同時(shí)也檢測(cè)到較高比例的MRSA．79．5%．對(duì)這種細(xì)菌所有的β內(nèi)酰胺抗生素全部無效，因此G+菌感染時(shí)應(yīng)盡量做好MRSA的檢測(cè)。喹諾酮和林可霉素類還有較高的敏感率都在80%以上。有學(xué)者報(bào)道[9]皮下注射頭孢噻吩和林可霉素2H后在兔骨中未檢測(cè)帶頭孢噻吩，而檢測(cè)到了林可霉素。據(jù)羅明琍等[10]報(bào)道克林霉素在骨骼組織中能達(dá)到較高的血藥濃度，對(duì)于治療非典型性的MRSA感染性骨髓炎患兒也有很好的療效。而喹諾酮類藥物對(duì)粘附細(xì)胞有效，可滲入巨噬細(xì)胞和多型核白細(xì)胞，骨濃度和給藥劑量成正比，給予一個(gè)劑量后超過大多數(shù)病原菌的MIC即骨濃度＞1 μg/G，而且兩藥的副作用小，在臨床應(yīng)用中可以作為對(duì)G+菌感染的骨髓炎，喹諾酮和林可霉素是較理想的藥物。本次檢出的金葡菌有79．5%為MRSA，MRSA是對(duì)β－內(nèi)酰胺類抗生素及其他多種抗生素高度、多重耐藥的金葡菌，MRSE通過不同的機(jī)制對(duì)氨基糖苷類、大環(huán)內(nèi)酯類、氯霉素和四環(huán)素等耐藥，但是通常對(duì)萬古霉素、替考拉寧、利奈唑胺及一些氟喹諾酮類敏感[11]。本次資料顯示萬古霉素和替考拉寧多具有最好的抗陽性菌活性，金葡菌敏感率100%溶血葡萄球菌敏感率98%。萬古霉素和替考拉寧對(duì)G+的敏感率雖然很高，但臨床應(yīng)根據(jù)患者自身感染情況采取個(gè)體優(yōu)化治療方案，且使用時(shí)應(yīng)密切監(jiān)測(cè)患者的肝腎功能，防止產(chǎn)生嚴(yán)重的毒副作用?？紤]到萬古霉素的副反應(yīng)，臨床更多地采用局部使用。近年來一些攜帶抗生素的載體在骨髓炎的治療中起到了臨床效果，如載萬古霉素硫酸鈣等。據(jù)張展等報(bào)道[12]局部使用載萬古霉素硫酸鈣后。病灶局部引流液中萬古霉素平均濃度136．56 mg/L，最高濃度845．61 mg/L、最低濃度37．55 mg/L。3例患者硫酸鈣人工骨用量為2．5 mL，平均濃度為88．53 mg/L，最高濃度為758．84 mg/L，最低濃度為50．43 mg/L；1例患者硫酸鈣人工骨用量為1．5 mL，平均濃度為93．20 mg/L，最高濃度127．36 mg/L最低濃度為35．42 mg/L均超過萬古霉素的有效治療濃度（15～20）mg/L和最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）。因此針對(duì)G+病原菌感染的骨髓炎，局部使用萬古霉素具有很好的應(yīng)用前景。氨基糖甙類、紅霉素、四環(huán)素都有較好的抗菌活性，但是這幾類藥物有效骨組織濃度小、副作用大等缺點(diǎn)，為克服這些缺點(diǎn)，臨床上已經(jīng)開發(fā)出攜帶這些抗生素的新材料，在局部使用治療骨髓炎，取得了不錯(cuò)的療效。Lee[13]等將慶大霉素與BMP順序固化與鈦表面，制得的GS/BMP－2Hep－Ti不僅能抑制金葡菌，同時(shí)大大加強(qiáng)堿性磷酸酶活性和成骨細(xì)胞的鈣沉淀，具有優(yōu)越的抗菌活性和促進(jìn)成骨細(xì)胞增值的雙重功能。在一定程度上起了緩釋慶大霉素的作用，同時(shí)降低了藥物的毒性。通過對(duì)表3的分析，頭孢唑啉、頭孢拉定對(duì)G－菌的敏感率都不超過35%，說明一、二代頭孢菌素對(duì)G－病原菌抗菌作用已經(jīng)較差，除非有明確的藥敏試驗(yàn)顯示敏感，一般不作為抗骨髓炎的抗菌藥物。頭孢曲松、頭孢他啶仍有較好的抗菌活性，敏感率大部分＞75%。說明三、四代頭孢菌素在抗G－菌感染時(shí)可以選用。需要注意的是在銅綠對(duì)頭孢曲松的耐藥率較高85%，是因?yàn)轭^孢曲松對(duì)銅綠的活性很弱，因此當(dāng)懷疑是銅綠感染時(shí)應(yīng)避免使用頭孢曲松。哌拉西林的敏感率只有15%，但是添加了酶抑制劑他唑巴坦后其敏感性明顯上升，說明G－陰性病原菌中有很多產(chǎn)ESBL的菌株。尤其對(duì)銅綠的敏感率達(dá)86%，因此針對(duì)銅綠引發(fā)的慢性骨髓炎哌拉西林/他巴唑是較理想的抗菌藥物。亞胺培南對(duì)G－中仍有很強(qiáng)大的抗菌效果，敏感性為均在90%以上，還有很大的臨床應(yīng)用價(jià)值。

3.3 臨床用藥建議

慢性骨髓炎的致病菌菌株繁多，且很多有多種細(xì)菌感染的情況，因此盡量采取聯(lián)合用藥。一般在第一次清創(chuàng)后就可以根據(jù)臨床經(jīng)驗(yàn)用藥，當(dāng)病原菌培養(yǎng)及藥敏結(jié)果出來后、應(yīng)及時(shí)更換敏感藥物，一般維持4～6周[14]。損傷部位常有疤痕形成或血管損傷，導(dǎo)致血液循環(huán)障礙，抗生素的全身應(yīng)用很難在損傷部位達(dá)到有效的藥物濃度，因此在骨髓炎的抗菌治療中局部使用敏感藥物也是可選擇的方案。

慢性骨髓炎在臨床上難于治療的根本原因是病原菌持續(xù)感染，除了局部瘢痕增生、血供差、耐藥菌等原因外，也是其難治的主要原因之一。細(xì)菌在死骨、內(nèi)固定物、周圍瘢痕組織等表面形成細(xì)菌生物膜（baterial biofilm，BBF），BBF是由細(xì)菌群體附著于有生命或無生命物體表面，分泌胞外大分子將自身包裹，具有特殊的內(nèi)部生態(tài)環(huán)境和不同的細(xì)菌基因表達(dá)[15]。據(jù)錢燕兒等[16]報(bào)道生物膜陽性菌株對(duì)環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、利福平及慶大霉素的耐藥性顯著高于生物膜陰性菌株，生物膜陽性菌的MRSA陽性率高達(dá)66．7%，顯著高于生物膜陰性株。

目前認(rèn)為在清除病灶的基礎(chǔ)上修復(fù)創(chuàng)面，同時(shí)合理應(yīng)用抗菌藥物是控制感染的主要手段。病原菌培養(yǎng)仍是診斷慢性骨髓炎的金標(biāo)準(zhǔn)之一，培養(yǎng)標(biāo)本采集不規(guī)范或術(shù)前使用抗生素都會(huì)影響培養(yǎng)結(jié)果。

創(chuàng)面分泌物的培養(yǎng)對(duì)診斷來說是不夠的，應(yīng)該在手術(shù)中取出更多的標(biāo)本進(jìn)行培養(yǎng)，包括竇道分泌物、膿液、軟組織及骨刮取物，尤其是骨組織及髓腔內(nèi)分泌物的培養(yǎng)是十分必要的。臨床微生物室應(yīng)盡量擴(kuò)大培養(yǎng)范圍，開展厭氧菌、L型菌的培養(yǎng)及藥敏，可降低漏檢率，獲得更多藥敏結(jié)果。給骨科醫(yī)生提供更準(zhǔn)確、全面、及時(shí)的微生物學(xué)報(bào)告，使臨床的治療更加成功。

[1]魯菁，陳立章.骨髓炎的臨床演變及其展望[J].中國矯形外科雜志，2011，（24）：2109-2111.

[2]魯玉來，張喜善.骨髓炎臨床感染類型的變化及其對(duì)策[J].中國矯形外科雜志，2014，22（23）：2189-2194.

[3]謝克恭，唐任光，唐毓金，等.化膿性骨髓炎病原菌培養(yǎng)及耐藥性分析[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床，2009，（5）：325-327.

[4]劉伯讓，畢曉潔，莫基浩.396例化膿性骨髓炎竇道分泌物細(xì)菌培養(yǎng)及藥敏結(jié)果分析[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2014，24（10）：1438-1440.

[5]張雙江，張樹明，宋迪煜，等.慢性骨髓炎的有效治療[J].中國醫(yī)學(xué)工程雜志，2015，123（2）：12-15.

[6]楊俊，王云芬.409份感染標(biāo)本細(xì)菌及其L型分離培養(yǎng)結(jié)果分析[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床，2011，1（8）：95-96.

[7]孫永強(qiáng)，張?jiān)票?慢性骨髓炎新療法作用機(jī)制分析[J].中國矯形外科雜志，2008，16（15）：1154-1155.

[8]蘇建榮，馬紀(jì)平.實(shí)驗(yàn)室開展厭氧菌檢查的重要性[J].中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2007，30（12）：13.

[9]袁壁君.抗生素對(duì)革蘭陽性菌骨和關(guān)節(jié)感染的治療[J].國外醫(yī)藥：抗生素分冊(cè)，2005，（1）：24-27.

[10]羅明琍，吳新榮.美國耐甲氧西林金黃色葡萄球菌感染治療臨床治療指南[J].今日藥學(xué)，2011，21（12）：721-726.

[11]VercilloM，PatzakisMJ，Holtom P，et al.Linezoild in the treatment of implant-relate chromic osteomyelitis[J].Clin Orthop Relate Research，2007，461：40-43

[12]張展，張春，郭峭峰，等.載萬古霉素硫酸鈣在骨髓炎治療中的應(yīng)用[J].中國科學(xué)院學(xué)報(bào)，2013，35（3）：337-342.

[13]Lee DW，Yun YP，Park K，et al.Gentamicin and bone morphogenic protein-2（BMP-2）-delivering heparinizedtitanium implant with enhanced antibacterial activity and osteointegration[J].Bone，2012，50（4）：974-982.

[14]Sheehy SH，Atkins BA，Bejon P，et al.The microbiology of chronic osteomyelitis：Prevalence of resistance to common empirical anti-microbial reg[J].Infect，2010，60（5）：338-343.

[15]Sia IG，Ber EF.Infection and musculoskeletal conditions：Osteomyelitis[J].Best Pract Res Clin Rheumatol，2006，20（6）：1065-1081.

[16]錢燕兒，陳曉.金黃色葡萄球菌生物膜形成能力與耐藥性關(guān)系的研究[J]．中國微生態(tài)學(xué)雜志，2013，25（3）：339-341.

Spectrum and susceptibility analysis of pathogens resulting in chronic osteomyelitis

XU Yubing1DING Fangping2
1.Department of Clinical Laboratory，F(xiàn)uyang Orthopedics Hospital of Traditional Chinese Medicine of Hangzhou, Fuyang311400,China；2.Department of Acupuncture and Moxibustion，F(xiàn)uyang Orthopedics Hospital of Traditional Chinese Medicine of Hangzhou City,Fuyang311400,China

Objective To understand the distribution and susceptibility of pathogens resulting in chronic osteomyelitis for guiding clinical rational use of antibiotics.Methods A total of 288 osteomyelitis secretions were cultured and sensitivity test were conducted.Results There were 283 cases of bacteria,including 123 cases of Gram-positive bacteria and 160 cases of Gram-negative bacteria after culture.Conclusion The top pathogen is Staphylococcus aureus,but the infection rate of Gram-negative bacteria is rising continuously until 53%,and is greater than that of Gram-positive bacteria.The susceptibility rates of Gram-positive bacteria to Quinolones,clindamycin were high and all of them were more than 80%.The susceptibility rates of Gram-negative bacteria to the first-generation and the second-generation cephalosporins are low and all of them are less than 35%.And susceptibility rates of Gram-negative bacteria to the third-generation,and the fourth-generation cephalosporins,quinolones,piperacillin/methimazole,imipenem are high.

Chronic osteomyelitis;Pathogens;Susceptibility

R446.5;R681.2

A

1673-9701（2015）27-0012-04

2015-04-28）

浙江省中醫(yī)藥科技計(jì)劃基金（2014ZT005）